N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用，所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其編碼基因如SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明通過易錯PCR的方法對野生型N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶（GNA1）進行改造，測得酶活力最高為25.3U/L，野生型GNA1酶活力為7.8U/L，突變體GNA1M的酶活力相較于野生型提高了3.24倍。
【專利說明】N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，涉及一種N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來發(fā)現(xiàn)氨基糖類通常作為復雜寡聚糖和多糖類中的單體殘基。氨基葡萄糖是單糖葡萄糖的氨基衍生物。N-乙酰氨基葡萄糖是葡糖胺的乙酰衍生物。葡糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖和其他氨基糖類是許多天然多糖的重要組成部分。
[0003]將氨基葡糖制成營養(yǎng)藥品用于治療動物和人的骨關(guān)節(jié)病等疾病。N-乙酰氨基葡萄糖也是治療多種疾病的有價值的藥物活性劑。由于N-乙酰氨基葡萄糖是動物體內(nèi)蛋白合成的有價值和重要的成分，因此它對組織再生具有積極的影響，N-乙酰葡萄糖在預(yù)防和治療各種疾病方面具有治療潛能，諸如胃炎、食物過敏、炎癥性腸病(IBD)、憩室炎、急性和慢性形式的類風濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎，以及因骨關(guān)節(jié)組織代謝疾病導致的病理情況。
[0004]由于工業(yè)生產(chǎn)的氨基葡萄糖不能適宜于所有的人，來源于有殼的水生動物的氨基葡萄糖，對海鮮過敏的人群是不適宜的，越來越多的消費者尋找不含有動物副產(chǎn)物的物質(zhì)，N-乙酰氨基葡萄糖沒有任何已經(jīng)確定的副作用。通過發(fā)酵生產(chǎn)獲得氨基葡萄糖的過程中，氨基葡萄糖的積累對微生物代謝是有害的，因此只有通過發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖，再對其進行水解即可獲得氨基葡萄糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0007]與野生型的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶相比，本發(fā)明的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體發(fā)生改變的氨基酸序列為:F38S (第38位苯丙氨酸變?yōu)榻z氨酸)，P64T (第64位脯氨酸變?yōu)樘K氨酸)，I131N (第131位異亮氨酸變?yōu)樘於０?。
[0008]本發(fā)明還提供編碼所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體的基因，其核苷酸序列為:
[0009]i) Seq ID N0.2所示的核苷酸序列；或
[0010]ii)Seq ID N0.2所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0011]iii)在嚴格條件下與Seq ID N0.2所示序列雜交的核苷酸序列；
[0012]所述嚴格條件為在含0.1%SDS的0.1 X SSPE或含0.1%SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0013]本發(fā)明還提供含有編碼所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體基因的載體、工程菌及轉(zhuǎn)基因細胞系。優(yōu)選地，所述工程菌的出發(fā)菌株為大腸桿菌。[0014]本發(fā)明還提供所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體在N-乙酰氨基葡萄糖合成中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明進一步提供一種利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，通過在大腸桿菌中過表達編碼所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體的基因，從而提高N-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0016]所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體的篩選方法，包括以下步驟:
[0017](1)由釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) S288C,擴增N-乙酸葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(GNAl)的編碼基因gnal ；
[0018](2)采用易錯PCR技術(shù)，以基因gnal為模板，擴增獲得GNAl突變體基因；
[0019](3)將步驟(2)所得易錯PCR產(chǎn)物及表達質(zhì)粒pET28b用BamH I和Xho I雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布至LB (Kan)平板，即得構(gòu)建好的重組GNAl基因突變庫；
[0020](4)將LB (Kan)平板上長出的菌落——對應(yīng)轉(zhuǎn)入LB (Kan)液體培養(yǎng)基中，置37°C搖床培養(yǎng)，待OD6tltl值達到0.6-0.8時，加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG，37°C繼續(xù)培養(yǎng)12h，然后分別離心收集菌體，破碎，測定GNAl酶活力，挑選酶活力最強的一株，并測定其基因序列，結(jié)果SEQ ID N0.2所示。
[0021]其中，所述野生型N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶具有SEQ ID N0.3所示的基因序列和SEQID N0.4所示的氨基酸序列。
[0022]本發(fā)明的另一方面提供所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體的制備方法，包括以下步驟:
[0023]I) PCR擴增編碼所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體的基因；
[0024]2 )將步驟I)所得PCR產(chǎn)物連接表達載體pET_28b ；
[0025]3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得表達產(chǎn)物；
[0026]其中，步驟I)中PCR擴增所用引物為:
[0027]正向引物:5'-GATCGGATCCATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAGGC-3'
[0028]反向引物:5'-GATCCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC-3'
[0029]其中，過表達的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體C-端含有6個組氨酸標簽。
[0030]進一步采用親和層析法分離純化表達產(chǎn)物，分離純化的步驟為:
[0031]i)以NTA介質(zhì)填柱，用2倍柱體積的去離子水洗滌，接著加NiSO4溶液至NTA介質(zhì)結(jié)合度達到飽和，用5倍柱體積的NAT-O緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl)洗柱；
[0032]ii)將含有表達的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌破碎菌體離心后得到的上清加入到Ni2+-NTA樹脂柱中，用5倍柱體積的NAT-1緩沖液(即NAT-O緩沖液含有80mmol/L咪唑)洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白，最后用含有300mmol/L咪唑的NAT-O緩沖液洗脫帶有6個組氨酸標簽的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，并進行SDS-PAGE分析。
[0033]本發(fā)明的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體(GNAlM)及其編碼基因還可以通過人工合成序列的方法獲得。
[0034]本發(fā)明通過易錯PCR的方法對野生型N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶進行改造，測得酶活力最高為25.3U/L，野生型GNAl酶活力為7.8U/L，突變體GNAlM的酶活力相較于野生型提高T 3.24 倍?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0035]圖1為PCR擴增野生型(GNAl)和突變體(GNAlM) N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶基因的凝膠電泳檢測結(jié)果；其中，I為野生型gnal，2為突變體gnal。
[0036]圖2為本發(fā)明實施例4中構(gòu)建的表達載體的酶切檢測結(jié)果；其中，M為DNA分子量標準 DL2000，I 為 pET-GNAl，2 為 pET-GNAlM。
[0037]圖3為野生型N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(GNAl)在大腸桿菌中表達與純化的SDS-PAGE檢測結(jié)果；其中，I為未誘導的菌體上清，2為經(jīng)過誘導的菌體上清，3為經(jīng)過純化的GNAl蛋白。
[0038]圖4為N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體(GNAlM)在大腸桿菌中表達與純化的SDS-PAGE檢測結(jié)果；其中，I為未誘導的菌體上清，2為經(jīng)過誘導的菌體上清，3為經(jīng)過純化的GNAlM蛋白。
【具體實施方式】
[0039]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0040]實施例1N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶基因的獲得
[0041]Hlyg 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) S288C 基因組 DNA 為 PCR 反應(yīng)模板，按 SEQ ID N0.3 所示 序列設(shè)計正向引物 GNAl-F:5/ -GATCGGATCCATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAGGC-3'，反向引物 GNA1-R: 5' -GATCCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC-3'，其中斜體字母部分分別為酶切位點BamH I和Xho I。PCR反應(yīng)在50 μ I總體系中進行，反應(yīng)條件為:94°C變性5min ;94°C變性60s，58°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。取3μ I PCR擴增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。取100 μ I PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收試劑盒的說明回收目的片段。
[0042]實施例2野生型N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶基因表達載體的構(gòu)建
[0043]將實施例1中的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I雙酶切消化后，與用相同內(nèi)切酶消化的pET-28b質(zhì)粒(購自Novagen公司)進行連接反應(yīng)，構(gòu)建的載體被命名為pET-GNAl，然后用連接產(chǎn)物pET-GNAl混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (購自promega公司)，并進行序列測定提取轉(zhuǎn)化菌體庫的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2UDE3)菌株(購自promega公司)。
[0044]實施例3易錯PCR擴增N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶基因
[0045]利用Taq DNA聚合酶不具有3' -5'校對功能的性質(zhì)，在高鎂離子濃度(8mmol/L)和不同濃度dNTP的濃度下(其中dATP和dGTP濃度為1.5mmol/L, dTTP和dCTP濃度為3.0mmol/L)，來控制隨機突變的頻率，向目的基因中引入隨機突變，構(gòu)建突變庫。模板濃度A260值為1000ng/mL，酶濃度為5U/yL，引物濃度為100 μ M。實驗中最優(yōu)的突變率約為0.6%。
[0046]易錯PCR反應(yīng)體系(100 μ I):
[0047]10 X PCR反應(yīng)緩沖液10 μl
dATP2 μl
dTTP4 μ l
dCTP4 μl
[0048]
dGTP2 μl
MgCl26 μl
引物 GNAl-F4μl
引物GNAl-R4 μl
DNA模板(實施例1的PCR產(chǎn)物) 4 μl
Taq DNA聚合酶1 μl
ddH2059 μl
總體積100 μ l
[0049]PCR 程序為:96°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 lmin，58°C退火 lmin，75°C延伸 2min，45個循環(huán)；最后75°C延伸15min。采用膠回收方法回收PCR產(chǎn)物。取5 μ I產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0050]實施例4突變體GNAlM表達載體的構(gòu)建
[0051 ] 將實施例3中的PCR產(chǎn)物(DNA改組后的混合物)經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I雙酶切消化后，與用相同酶消化的pET-28b質(zhì)粒進行連接反應(yīng)，構(gòu)建的載體被稱為pET-GNAlM (圖2)，然后用連接產(chǎn)物pET-GNAlM混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌體
突變庫。
[0052]實施例5構(gòu)建表達突變庫及高酶活突變體的篩選
[0053]提取轉(zhuǎn)化菌體庫的質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，獲得轉(zhuǎn)化子約500株，構(gòu)建表達突變體庫。隨機挑取100株突變菌株分別至含50 μ g/mL kan的LB培養(yǎng)基的96孔板中，370C、150rpm培養(yǎng)，待OD值達0.6-0.8，加入IPTG (終濃度0.2mmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集菌體。超聲破菌得上清，并進行酶活及蛋白含量測定。檢測酶活性最高的菌株，并挑選其克隆，提取質(zhì)粒，進行電泳檢測。然后測定與野生型N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶對應(yīng)的突變體基因序列。測定的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體基因序列如SEQ ID N0.2所示，對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0054]N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的酶活檢測:
[0055](1)離心收集菌體，用0.lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)洗滌后低溫超聲破碎，離心取100 μ l上清液，并用緩沖液稀釋至相同濃度，4°C冷藏備用。
[0056](2)在獲得的蛋白上清液中，加入200μΜ的6_磷酸氨基葡萄糖和乙酰CoA，混勻，37°C反應(yīng)，每分鐘取50μ l，5min后終止反應(yīng)。[0057](3)終止條件:50 μ I反應(yīng)液中加入500 μ I終止液(含20%乙酸的0.05Μ NaOH)。
[0058](4)將終止后的樣品，在412nm下測吸光度，由于反應(yīng)催化釋放出CoA，測得的吸光值代表CoA的值，這一數(shù)值可直接反應(yīng)出酶活力的高低。
[0059]結(jié)果表明，通過易錯PCR對N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶進行改造，測得酶活力最高為25.3，野生型GNAl酶活力為7.8，突變體GNAlM的酶活力相較于野生型提高了 3.24倍。
[0060]實施例6野生型GNAl和突變體GNAlM的誘導表達及純化
[0061]以測序驗證的pET-GNAl和pET_GNAlM表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞；挑取陽性克隆，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD值約為0.6-0.8時，加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG，37°C誘導12h。接種上述轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21于1000mL LB培養(yǎng)基，待OD600值約達2.0時，離心收集菌體，以50mmol/L Tris-HCl、pH 8.0(含lmmol/L NaCl)緩沖液懸浮(濕菌體與緩沖液的比例為Ig濕菌體:5mL緩沖液)，在冰浴中以超聲波破碎菌體，離心后收集上清。
[0062]NTA介質(zhì)填柱，用2倍柱體積的去離子水洗滌，然后加NiSO4溶液至NTA介質(zhì)結(jié)合度達到飽和，用5倍柱體積的NAT-O緩沖液(20mMTris-HCl pH 7.9,0.5M NaCl)洗柱。將上述收集破碎菌體離心后得到的上清加入到Ni2+-NTA樹脂柱中，反復加入2-3次后，用5倍柱體積的NAT-1緩沖液(即NAT-O緩沖液含有80mmol/L咪唑)洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白，最后用含有300mmol/L咪唑的上述緩沖液洗脫帶有6個組氨酸標簽的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，并進行SDS-PAGE分析。純化分析結(jié)果如圖3和圖4所示。
[0063]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的工程菌。
7.如權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于，出發(fā)菌株為大腸桿菌。
8.權(quán)利要求1所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體在N-乙酰氨基葡萄糖合成中的應(yīng)用。
9.一種利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，在大腸桿菌中過表達權(quán)利要求2或3所述基因，從而提高N-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵產(chǎn)量。
10.權(quán)利要求1所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)PCR擴增編碼所述N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶突變體的基因； 2)將步驟I)所得PCR產(chǎn)物連接表達載體pET-28b；· 3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得表達產(chǎn)物； 其中，步驟I)中PCR擴增所用引物為: 正向引物:5' -GATCGGATCCATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAGGC-3'； 反向引物:5' -GATCCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC-3'。
【文檔編號】C12N9/10GK103589695SQ201310465011
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】李榮杰, 徐斌, 汪本助 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司