用于定性、定量檢測棗瘋病植原體的引物、探針及其方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及用于對棗瘋病植原體進(jìn)行定性、定量檢測的引物、探針及其檢測方法。本發(fā)明根據(jù)棗瘋病植原體與其它植原體在16S?rDNA基因序列上的差異，設(shè)計(jì)了特異性檢測棗瘋病植原體的引物對JWB?Primer-F：5’-TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’/JWB?Primer-R：5’-CTCCCGTAGGAGTTT?GG-3’和TapMan探針JWB-Probe：5’-FAM-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-TAMRA-3’，通過建立的棗瘋病植原體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法測定Ct值，依據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，即可實(shí)現(xiàn)對棗瘋病植原體的定性；再由預(yù)先建立的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出檢測樣品中棗瘋病植原體16S?rDNA基因片段拷貝濃度，據(jù)此得到樣品中棗瘋病植原體的數(shù)量，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于植物檢疫、植物保護(hù)、科研等領(lǐng)域。
【專利說明】用于定性、定量檢測棗瘋病植原體的弓丨物、探針及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及用于對棗瘋病植原體進(jìn)行定性、定量檢測的引物、探針及其檢測方法，特別是涉及用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對棗瘋病植原體進(jìn)行定性、定量檢測的引物、探針及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]棗瘋病(Jujube witches’ broom, JffB)又稱“棗癌癥”是由植原體病原侵染導(dǎo)致的、在棗樹生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的毀滅性病害。植原體原稱類菌原體，為單細(xì)胞原核生物，無細(xì)胞壁，由生物膜包圍，可引起多種病害。根據(jù)植原體16S rDNA基因序列為對象進(jìn)行分析，可將植原體分為28個(gè)組。其中引起棗瘋病的棗瘋病植原體與榆樹黃化植原體、葡萄金黃化植原體等同為植原體榆樹黃化組成員。棗瘋病分布范圍廣，傳播速度快，致病力強(qiáng)，樹體一旦感病，終身攜帶，傳統(tǒng)的病害防治技術(shù)和栽培技術(shù)難以治愈。我國多數(shù)棗樹主栽品種對棗瘋病敏感，全國每年因棗瘋病死樹高達(dá)千萬株，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億元，嚴(yán)重阻礙了棗樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。要從根本上解決 棗瘋病的防治問題是采取有效的預(yù)防措施，加強(qiáng)種苗(接穗、砧木)的檢疫檢驗(yàn)，采用健康苗木(砧木、接穗)，建立無病苗木繁育體系，從源頭上杜絕病原才是控制棗瘋病發(fā)生蔓延的根本途徑，而建立和應(yīng)用先進(jìn)的病原檢測技術(shù)是紅棗無病苗木生產(chǎn)的核心所在。
[0003]植原體自發(fā)現(xiàn)后的10多年里，其檢測技術(shù)的發(fā)展一直沒有大的突破。傳統(tǒng)的電鏡觀察、血清學(xué)等檢測方法因?yàn)殪`敏度低、周期長和操作繁瑣等不足，已不能滿足現(xiàn)代生產(chǎn)的需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)引入植原體病害研究領(lǐng)域，植原體鑒定和檢測技術(shù)才得到了較快的發(fā)展，如普通PCR、巢氏PCR等技術(shù)的應(yīng)用使植原體檢測靈敏度和鑒定水平有了極大的提高，但這些方法整個(gè)過程繁雜，操作步驟多，而且需要PCR后處理，如瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，紫外光觀察結(jié)果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測，如果要鑒定到種或組，還要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(RFLP)，或者進(jìn)行核酸序列測定和同源性比較，不僅需要多種儀器，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所使用的染色劑溴化乙錠對人體又有害，這些繁雜的實(shí)驗(yàn)過程又給污染和假陽性提供了機(jī)會(huì)，嚴(yán)重影響對結(jié)果的正確判斷。為此研發(fā)一套簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，以期滿足檢疫工作的需要。
[0004]熒光PCR(FQ-PCR)技術(shù)是美國珀金埃爾默公司(PerkinElmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)，該方法自產(chǎn)生以來，不斷發(fā)展完善，其中TaqMan探針實(shí)時(shí)突光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中添加了一對引物的同時(shí)加入了一條標(biāo)記了 2個(gè)突光基團(tuán)的特異性TaqMan探針，在PCR擴(kuò)增過程中TaqMan探針同PCR產(chǎn)物雜交，引起報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號，通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測實(shí)現(xiàn)對起始模板進(jìn)行定性及定量分析。與常規(guī)PCR檢測方法相比，該法具有特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、靈敏度高、穩(wěn)定性好和定量等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]目前國內(nèi)已建立了用于檢測植原體榆樹黃化組成員的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，但該方法僅能實(shí)現(xiàn)植原體組間的特異性檢測，無法對植原體榆樹黃化組內(nèi)的植原體進(jìn)行區(qū)分和鑒定。本發(fā)明在對植原體大量基因信息進(jìn)行分析比較的基礎(chǔ)上，建立了棗瘋病植原體特異性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，能較好的區(qū)分不同組間及組內(nèi)的植原體，可大大提高棗瘋病植原體的檢測效率，從而滿足我國相關(guān)檢疫工作的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種用于對棗瘋病植原體進(jìn)行定性、定量檢測的引物、探針及其檢測方法，具有快速定性和定量檢測棗瘋病植原體的功能。本發(fā)明操作簡單，易于掌握，檢測精度高，可廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室等日常檢測工作。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是。
[0007](I)設(shè)計(jì)并提供用于棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的引物和探針。
[0008]引物的序列為:
[0009]上游引物JWB Primer-F:5’ -TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3，；
[0010]下游引物JWB Primer-R:5’ -CTCCCGTAGGAGTTTGG-3，。
[0011]探針的序列為:
[0012]JffB-Probe: 5，-FAM-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-TAMRA-3，。
[0013](2)提供棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，即首先從待檢測棗瘋病樣品中制備反應(yīng)模板，并建立和優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，然后通過設(shè)定實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序，利用熒光PCR儀對反應(yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增和熒光收集。
[0014](3)最后根據(jù)儀`器給出每個(gè)樣品的Ct值，分析檢測結(jié)果。
[0015]具體的，本發(fā)明提供了一種用于對棗瘋病植原體進(jìn)行定性、定量檢測的引物、探針及檢測方法，包括以下步驟。
[0016](I)作為本發(fā)明的核心，提供一組高敏感和特異性的引物和探針，用于棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，進(jìn)一步提高了棗瘋病植原體檢測的靈敏度。
[0017]引物的序列為:
[0018]上游引物JWB Primer-F:5’ -TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’ ；
[0019]下游引物JWB Primer-R:5’ -CTCCCGTAGGAGTTTGG-3，。
[0020]探針的序列為:
[0021 ] JffB-Probe: 5 ’ -FAM-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-TAMRA-3’。
[0022]所述用于棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的引物、探針，設(shè)計(jì)合成方法是:首先在NCBI中搜集全部植原體及有代表性細(xì)菌的16S rDNA核酸序列，利用Omiga軟件對上述序列進(jìn)行比較及一致性分析，找出棗瘋病植原體與其他植原體的基因差異位點(diǎn)，用軟件Beacon Designer7.0篩選出一對引物,在該引物對的擴(kuò)增區(qū)域設(shè)定一條突光Tapman探針，報(bào)告熒光染料標(biāo)記在探針的5’端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3’端。棗瘋病植原體特異性的PCR引物對和探針設(shè)計(jì)完成后，采用在線同源性比對，分析其序列特異性，結(jié)果表明棗瘋病植原體特異性的引物和探針設(shè)計(jì)區(qū)域?yàn)闂棷偛≈苍w所特有，未發(fā)現(xiàn)除棗瘋病植原體之外的可以和此對弓丨物配對并引起擴(kuò)增的物種，可以初步保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。TaqMan探針及引物對由生物公司合成。
[0023]本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR引物對擴(kuò)增位于棗瘋病植原體16S rDNA基因202bp~299bp位點(diǎn)的片段，擴(kuò)增片段大小為98bp，本發(fā)明的特異性熒光探針的5’端具有報(bào)告熒光染料FAM標(biāo)記，3’端具有淬滅熒光染料TAMRA標(biāo)記。
[0024](2)植物總DNA的提取:采用植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取棗樹葉片總DNA，置于_40°C冰箱貯存?zhèn)溆谩?br> [0025](3)以提取的植物總DNA為模板，分別設(shè)陽性對照、健康植株總DNA對照及無菌雙蒸水對照，采用上述設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。
[0026]實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的反應(yīng)體系為20 μ L:包括2.5XrealMasterMix8.0 μ L,20 X Probe Enhancer solutionl.0 μ L, 10 μ mol/L 的上游引物 JWB Primer-F0.5 μ L>10 μ mol/L 的下游引物 JffB Primer-R0.5 μ L，10 μ mol/L 的 TaqMan 探針 JffB-Probe0.5 μ L,模板DNA1.0yL,補(bǔ)足滅菌ddH20至20 μ L。
[0027]針對上述引物、探針和PCR反應(yīng)體系，設(shè)置的PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性2min ；以95°C變性15s，60°C退火30s，68V延伸Imin進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，68V設(shè)置FAM熒光通道采集熒光。
[0028](4)反應(yīng)結(jié)束后，記錄各檢測樣本的PCR擴(kuò)增曲線Ct值，根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中是否存在棗瘋病植原體，即可實(shí)現(xiàn)棗瘋病植原體的定性檢測；并可通過預(yù)先建立的熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出檢測樣品中棗瘋病植原體16SrDNA基因片段拷貝濃度，據(jù)此得到樣品中棗瘋病植原體的數(shù)量，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。
[0029](5)棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為:如果樣品熒光PCR擴(kuò)增曲線的Ct值≤34，而且同時(shí)陰性對照及空白對照無擴(kuò)增曲線，則判定待檢樣品中含有棗瘋病植原體，否則該樣本不含棗瘋病植原體；熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:I = -3.354X+38.27，x為所測樣品中棗瘋病植原體16S rDNA基因片段拷貝數(shù)的對數(shù)，y為Ct值。
[0030]通過實(shí)施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達(dá)到以下效果:
[0031]本發(fā)明充分考慮到檢疫工作的特殊性，并針對棗瘋病植原體的特點(diǎn)，研制了一套實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針及引物，該引物及探針能特異性的檢測出棗瘋病植原體，并排除其他植原體，其檢測靈敏度達(dá)60拷貝/ μ L。另外本發(fā)明采用上述實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物、探針進(jìn)行檢測的方法能快速準(zhǔn)確的檢測出樣品中的棗瘋病植原體含量，為苗木和接穗的帶菌檢測及抗棗瘋病品種的鑒定提供了新的手段和依據(jù)。
[0032]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0033](I)靈敏度高:對棗瘋病植原體檢測的靈敏比普通PCR方法高100倍以上。
[0034](2)特異性強(qiáng):本發(fā)明只針對棗瘋病植原體設(shè)計(jì)特異性引物及探針，通過選取棗瘋病植原體(榆樹黃化組)，葡萄金黃化植原體(榆樹黃化組)，泡桐叢枝植原體(翠菊黃化組)，翠菊黃化植原體(翠菊黃化組)為對象，進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果表明本發(fā)明檢測準(zhǔn)確性高，特異性強(qiáng)。
[0035](3)檢測時(shí)間短:比現(xiàn)有的常規(guī)PCR檢測法節(jié)省時(shí)間。
[0036](4)降低污染:由于是在封閉的體系中完成擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴(kuò)增后進(jìn)行操作。
[0037](5)既可以做定性分析又可以做定量分析。
[0038](6)對人和環(huán)境安全:檢測過程中不使用溴化乙錠等有毒試劑，對人和環(huán)境都非常安全。
[0039]總之，該方法不僅操作簡便、快速高效、高通量，而且具有很高的敏感性、重復(fù)性和特異性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1所示的是以陽性質(zhì)粒為模板的的PCR鑒定結(jié)果。圖中M道指IOObp DNALadder, I~4泳道分別均為PCR產(chǎn)物，5泳道為陰性對照。
[0041]圖2所示的是棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0042]圖3所示的為棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果。圖中曲線I~10分別對應(yīng)當(dāng)采用的質(zhì)粒模板濃度為6.09 X IO9~6.09拷貝/ μ L時(shí)的擴(kuò)增情況，曲線11是陰性對照。
[0043]圖4所示的為棗瘋病植原體常規(guī)PCR檢測方法的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果。圖中M道指IOObp DNA Ladder,泳道I~10分別對應(yīng)當(dāng)采用的質(zhì)粒模板濃度為6.09 X IO9~6.09拷貝/ μ L時(shí)的擴(kuò)增情況，泳道Ii是陰性對照。
[0044]圖5所示的是棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。圖中曲線
1、2、3、4分別代表采用健康棗樹DNA、泡桐叢枝植原體DNA、翠菊黃化植原體DNA、葡萄金黃化植原體DNA作為模板時(shí)的熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果，曲線5代表采用棗瘋病植原體DNA作為模板時(shí)的熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0046]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而絕不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。
[0047]試驗(yàn)藥品:植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit, TIANGEN), PGM-T載體、三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)、質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit)及RealMasterMix(Probe)購自北京天根生化科技有限公司。
[0048]儀器設(shè)備:實(shí)時(shí)熒光PCR儀(Roche Lightcycle2.0)，ND-1000核酸/蛋白檢測儀(Nano Drop 公司)。
[0049]本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。
[0050]實(shí)施例1引物和探針的制備
[0051]1.引物和探針的設(shè)計(jì)和合成
[0052]所述用于棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的引物、探針，設(shè)計(jì)合成方法是:首先在NCBI中搜集全部植原體及有代表性細(xì)菌的16S rDNA核酸序列，利用Omiga軟件對上述序列進(jìn)行比較及一致性分析，找出棗瘋病植原體與其他植原體的基因差異位點(diǎn)，用軟件Beacon Designer7.0篩選出一對引物，并在該引物對的擴(kuò)增區(qū)域設(shè)定一條突光Tapman探針，報(bào)告熒光染料標(biāo)記在探針的5’端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3’端。棗瘋病植原體特異性的PCR引物和探針設(shè)計(jì)完成后，采用在線同源性比對，分析其序列特異性，結(jié)果表明棗瘋病植原體特異性的引物和探針設(shè)計(jì)區(qū)域?yàn)闂棷偛≈苍w所特有，未發(fā)現(xiàn)除棗瘋病植原體之外的可以和此對引物配對并引起擴(kuò)增的物種，可以初步保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物及探針由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成。
[0053]引物的序列為 :
[0054]上游引物JWB Primer-F:5’ -TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’ ；
[0055]下游引物JWB Primer-R:5’ -CTCCCGTAGGAGTTTGG-3，。
[0056]探針的序列為:
[0057]JffB-Probe:5’ -AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-3’。
[0058]本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR引物對擴(kuò)增位于棗瘋病植原體16S rDNA基因202bp~299bp位點(diǎn)的片段，擴(kuò)增片段大小為98bp，本發(fā)明的特異性熒光探針的5’端具有報(bào)告熒光染料FAM標(biāo)記，3’端具有淬滅熒光染料TAMRA標(biāo)記。
[0059]2.引物和探針的準(zhǔn)備
[0060]引物和探針合成后，用滅菌雙蒸水分別稀釋為lOymol/L，將引物、探針置于_20°C冰箱避光保存?zhèn)溆谩?shí)施例2棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立
[0061]1.植物總DNA的提取:采用植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取棗樹葉片總DNA，置于_40°C冰箱貯存?zhèn)溆谩?br> [0062]2.棗瘋病植原體16S rDNA的PCR擴(kuò)增
[0063]利用植原體16S rDNA 通用引物對 R16mF2:5’ -CATGCAAGTCGAACGGA-3’，R16mR2:5’ -CTTAAC CCCAATCATCGA-3’對上述提取的棗樹葉片總DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為 25 μ L:DNA模板 1.0 μ L, 10 μ mol/L 的引物各 1.0 μ L, 10 μ mol/L 的 dNTPl.0 μ L，10XPCRBuffer2.5μ L,2.5U/μ L 的 TaqDNA聚合酶 0.3 μ L，滅菌 ddH2018.2 μ L。反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性6min ;94°C變性45s，52°C復(fù)性45s，72°C延伸lmin，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72°C補(bǔ)償延伸lOmin。
[0064]3.陽性質(zhì)粒的構(gòu)建
[0065]用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit)將上述PCR產(chǎn)物回收純化，連接到pGM-T載體中并轉(zhuǎn)入E.coli T0P10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過篩選、PCR鑒定獲得含目的片段的重組質(zhì)粒。通過上海生工測序部測序鑒定，證實(shí)目的基因已正確克隆到載體中，用核酸蛋白測定儀(NanoDix)P, ND-1000)測定質(zhì)粒濃度，換算成拷貝數(shù)，-20°C保存?zhèn)溆?，使用前進(jìn)行10倍梯度稀釋。
[0066]4.棗瘋病實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及條件的建立與優(yōu)化
[0067]以構(gòu)建的含有靶基因的陽性質(zhì)粒為DNA模板，建立棗瘋病實(shí)時(shí)熒光PCR方法，并對PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的反應(yīng)體系為20 μ L:包括 2.5 X realMasterMix8.0 μ L, 20 X Probe Enhancer solutionl.0 μ L, 10 μ mol/L 的上游引物 JWB Primer-F0.5 μ LUO μ mol/L 的下游引物 JffBPrimer-R0.5 μ L，10 μ mol/L 的TaqMan 探針 JffB-Probe0.5 μ L,模板 DNA1.0 μ L，補(bǔ)足滅菌 ddH20 M 20 μ L0 反應(yīng)在 RocheLightcycle2.0熒光PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性2min ;以95°C變性15s，60°C退火30s，68 °C延伸Imin進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，68 °C設(shè)置FAM熒光通道采集熒光。
[0068]5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性測定
[0069]以10倍梯度稀釋(6.09 X IO9~6.09X10拷貝/ μ L)的質(zhì)粒DNA為模板，在熒光PCR儀上檢測，得到擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測得的最低拷貝數(shù)評價(jià)其敏感性。同時(shí)利用引物對JWBPrimer-F: 5 ’ -TG GTGAGGTAAAGGCTTA-3 ’ ；JffB Primer-R:5’ -CTCCCGTAGGAGTTTGG-3’以上述梯度稀釋的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR敏感性測定，并與熒光PCR靈敏度進(jìn)行比較。常規(guī)PCR反應(yīng)體系為20μ?:10XPCRBuffer2.5 μ L，10 μ mol/L 的上游引物 JffB Primer-F0.5 μ L，10 μ mol/L 的下游弓 I 物 JffB Primer-R0.5 μ LlO μ mol/L 的 dNTP0.5 μ L，質(zhì)粒 DNA 模板 1.0 μ L, 2.5U/ μ L 的TaqDNA聚合酶0.5μ L，滅菌ddH2014.5μ L。反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性4min ;95°C變性 15s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸7min，35個(gè)循環(huán)；72°C補(bǔ)償延伸IOmin0[0070] 6.特異性試驗(yàn)
[0071 ] 分別提取棗瘋病植原體(榆樹黃化組)，葡萄金黃化植原體(榆樹黃化組),泡桐叢枝植原體(翠菊黃化組)，翠菊黃化植原體(翠菊黃化組)以及田間采集及實(shí)驗(yàn)室保存的健康棗樹基因組DNA作為模板，進(jìn)行棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的特異性試驗(yàn)。熒光定量PCR檢測的反應(yīng)體系為20 μ L:包括
[0072]2.5 XrealMasterMix8.0 μ L,20 XProbe Enhancer solutionl.0 μ L，10 μ mol/L的上游引物 JffB Primer-F0.5 μ LUO μ mol/L 的下游引物 JffB Primer-R0.5 μ L，10 μ mol/L 的 TaqMan 探針 JffB-Probe0.5 μ L，模板 DNA1.0 μ L，補(bǔ)足滅菌 ddH20 M 20 μ L0 反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性2min，以95°C變性15s，60°C退火30s，68°C延伸Imin進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，68°C設(shè)置FAM熒光通道采集熒光。
[0073]7.重復(fù)性試驗(yàn)
[0074]對3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(反應(yīng)初始體系中含6.09X IO4~6.09X IO6拷貝/UL)利用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR重復(fù)檢測3次，通過計(jì)算循環(huán)閾值(Ct)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)來評價(jià)該方法的穩(wěn)定性。變異系數(shù)(CV)=測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差與其平均值的百分比。
`[0075]8.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0076]以重組的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示特異性條帶大小為98bp (見圖1)，與引物的預(yù)設(shè)擴(kuò)增片段大小相符。
[0077]使用質(zhì)粒DNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)。以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒為模板，對應(yīng)濃度6.09 X IO9~6.09 X 10拷貝/ μ L，以獲得的Ct值為y軸，對應(yīng)的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，儀器自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為98.2 %，相關(guān)系數(shù)為0.998，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = -3.354X+38.27。由擴(kuò)增曲線可知，熒光PCR的檢測靈敏度下限為60拷貝/ y L是目前常用的常規(guī)PCR檢測方法靈敏度的100倍(見圖3、圖4)。根據(jù)檢測出的最低拷貝數(shù)我們設(shè)立檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn):在陰性無Ct值的前提下，待檢樣品Ct值在34以下為陽性，34~40為可疑，需加大模板量重新進(jìn)行檢測，無Ct值的樣品為陰性。
[0078]將建立的棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該探針能準(zhǔn)確檢測出屬于植原體榆樹黃化組的率瘋病植原體，而同屬植原體榆樹黃化組的葡萄金黃化植原體和屬于植原體翠菊黃化組的泡桐叢枝植原體、翠菊黃化植原體以及健康棗樹均為陰性(見圖5)。由此可見，JWB-Probe探針對棗瘋病植原體有較強(qiáng)的特異性，能較好的區(qū)分不同組間及組內(nèi)的植原體，特異性較好，特異性驗(yàn)證通過后，即表明該引物及探針可應(yīng)用于棗瘋病植原體的定性檢測。[0079]重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)，各重復(fù)試驗(yàn)的Ct值誤差均不到I個(gè)循環(huán)，且Ct值變異系數(shù)均小于5%，證明本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR體系重復(fù)性較好，從而保證了不同樣品間檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。
[0080]表1實(shí)時(shí)熒光PCR的重復(fù)性檢測
【權(quán)利要求】
1.一種用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的引物、探針，其特征在于，含有一條特異性循環(huán)探針和一對引物，所述引物對和探針的寡聚核昔酸序列為:
上游引物 JWB Primer-F:5’ -TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’ 下游引物 JWB Primer-R:5，-CTCCCGTAGGAGTTTGG-3’
探針 JWB-Probe:5，-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-3，。
2.如權(quán)利要求1所述用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的引物、探針，其特征在于，其設(shè)計(jì)方法是=WNCBI中搜集全部植原體及有代表性細(xì)菌的16S rDNA核酸序列，利用Omiga軟件對上述序列進(jìn)行比較及一致性分析，找出棗瘋病植原體與其他植原體的基因差異位點(diǎn)，用軟件Beacon Designer7.0篩選出一對特異性的PCR引物，在該引物對的擴(kuò)增區(qū)域設(shè)定一條熒光Tapman探針，并利用NCBI中的Blast程序分別對上游引物、下游引物和探針進(jìn)行比對，確保棗瘋病植原體特異性的引物和探針設(shè)計(jì)區(qū)域?yàn)闂棷偛≈苍w所特有，從而保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。
3.如權(quán)利要求1所述的引物對，其特征在于，所述引物對擴(kuò)增位于棗瘋病植原體16SrDNA基因202bp~299bp位點(diǎn)的片段，擴(kuò)增片段大小為98bp。
4.如權(quán)利要求1所述的用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的探針，其特征在于，該探針的5’端具有報(bào)告熒光染料FAM標(biāo)記，3’端具有淬滅熒光染料TAMRA標(biāo)記。
5.一種用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的方法，該方法包括下列步驟: (1)采用植物基因組提取試劑盒(PlantGenomic DNA Kit,TIANGEN)提取棗樹葉片總DNA,置于_40°C冰箱貯存?zhèn)溆谩? (2)以提取的植物總DNA為模板，分別設(shè)陽性對照、健康植株總DNA對照及無菌雙蒸水對照，采用JWB-Probe探針及JWB Primer引物對進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。 (3)根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中是否存在棗瘋病植原體，即可實(shí)現(xiàn)棗瘋病植原體的定性檢測；并可通過預(yù)先建立的熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出檢測樣品中棗瘋病植原體16SrDNA基因片段拷貝濃度，據(jù)此得到樣品中棗瘋病植原體的數(shù)量，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。
6.如權(quán)利要求5所述的一種用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的反應(yīng)體系為20 μ L:包括2.5XrealMasterMix8.0yL,20 X Probe Enhancer solutionl.0 μ L, 10 μ mol/L 的上游引物 JWB Primer-F0.5 μ L>10 μ mol/L 的下游引物 JffB Primer-R0.5 μ L，10 μ mol/L 的 TaqMan 探針 JffB-Probe0.5 μ L,模板DNA1.0yL,補(bǔ)足滅菌ddH20至20 μ L。
7.如權(quán)利要求5所述的一種用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的方法，其特征在于，所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性2mmin ;以95°C變性15s，60°C退火30s，68 °C延伸Imin進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，68 °C設(shè)置FAM熒光通道采集熒光。
8.如權(quán)利要求5所述的一種用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的方法，其特征在于，所述的棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為:如果樣品熒光PCR擴(kuò)增曲線的Ct值≤34，而且同時(shí)陰性對照及空白對照無擴(kuò)增曲線，則判定待檢樣品中含有棗瘋病植原體，否則該樣本不含棗瘋病植原體。
9.如權(quán)利要求5所述，其特征在于，所述熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=-3.354x+38.27，X為所測樣品中棗瘋病植原體16S rDNA基因片段拷貝數(shù)的對數(shù)，y為Ct值。
【文檔編號】C12Q1/06GK103525923SQ201310455553
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】羅明, 韓劍, 徐金紅, 王同仁, 張祥林 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)