專利名稱：一種急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人類細(xì)胞株，具體涉及一種急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株及其建立方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性淋巴母細(xì)胞白血病是造血系統(tǒng)常見惡性腫瘤，化療為其主要的治療手段。雖然新的化療藥物、多藥聯(lián)合的強(qiáng)烈化療方案的應(yīng)用以及造血干細(xì)胞移植的開展已使急性白血病的預(yù)后獲得很大改善，但難治、復(fù)發(fā)仍然是白血病治療中的現(xiàn)實(shí)問題。研究表明，多藥耐藥是導(dǎo)致多數(shù)白血病患者化療失敗的根本原因。多藥耐藥性(MDR)是指對一種藥物具有耐藥性的同時，對其他結(jié)構(gòu)不同，作用靶點(diǎn)不同的抗腫瘤藥物也具有耐藥性。急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥是指白血病細(xì)胞在接觸一種抗腫瘤藥物之后，產(chǎn)生了對多種結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的其它抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，白血病多藥耐藥的機(jī)制、臨床意義及耐藥逆轉(zhuǎn)成為腫瘤研究中的熱點(diǎn)之一，建立實(shí)驗(yàn)需要的白血病耐藥細(xì)胞模型更具有重要的研究意義。腫瘤細(xì)胞耐藥株的建立方法通常有兩種，一是逐步增加藥物濃度、持續(xù)誘導(dǎo)法，二是大劑量沖擊法。本發(fā)明結(jié)合兩種方法，前期誘導(dǎo)采用大劑量沖擊法，后期誘導(dǎo)采用持續(xù)誘導(dǎo)法。通過耐藥細(xì)胞株的建立可以進(jìn)一步構(gòu)建體內(nèi)外腫瘤耐藥模型，從而深入研究MDR耐藥機(jī)制，甚至發(fā)現(xiàn)其他新的耐藥機(jī)制。通過耐藥細(xì)胞株的建立的體內(nèi)外腫瘤耐藥模型，可以用于抗腫瘤藥物的篩選。目前，尚沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于用于藥物篩選用的急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株的報道。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株及其建立方法。本發(fā)明的細(xì)胞株 具有典型多藥耐藥特性，為進(jìn)一步研究耐藥逆轉(zhuǎn)途徑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明采用急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞株M0LT-4為誘導(dǎo)對象，前期采用大劑量沖擊法，后期采用逐步遞增5-FU濃度、間歇作用的體外誘導(dǎo)法，建立了急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株M0LT-4/FU。該細(xì)胞株已經(jīng)于2012年12月24日中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.7053。該耐藥株構(gòu)建體內(nèi)外腫瘤耐藥模型，從而實(shí)現(xiàn)療效更好的抗癌藥物的篩選。具體地，本發(fā)明涉及的急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株M0LT-4/FU是按照如下方法建立獲得:(I)人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞株M0LT-4用培養(yǎng)液(含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液)，5% C02，37°C條件下，培養(yǎng)至70% 90%貼壁率時，棄上清，加入氟尿嘧啶1000ng/ml沖擊培養(yǎng)I小時，棄氟尿嘧啶1000ng/ml培養(yǎng)液，空白RPM1-1640培養(yǎng)液洗滌2次后，更換增殖培養(yǎng)液培養(yǎng)72-96h擴(kuò)增存活細(xì)胞。至存活細(xì)胞擴(kuò)增至70% 90%貼壁率時，再重復(fù)用氟尿嘧啶1000ng/ml培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時9次，即總共完成10次氟尿嘧啶1000ng/ml紫杉醇培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時，進(jìn)一步以此細(xì)胞為基礎(chǔ)，1000ng/ml持續(xù)培養(yǎng)7天。(2 )重復(fù)上述操作，將篩選條件依次改為氟尿嘧啶1000ng/ml、2000ng/ml、5000ng/ml, lOOOOng/ml,20000ng/ml 培養(yǎng)液。本發(fā)明通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生長曲線和群體倍增時間測定、藥物敏感試驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)Rh-123研究及MDR1、MRP和細(xì)胞周期的測定，評價急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株M0LT-4/FU的生物學(xué)特性，結(jié)果成功建立了 M0LT-4/FU耐藥株，耐藥指數(shù)為34.609，對依托泊苷(VP16)、順鉬(cDPP)、紫杉醇(Taxol)、長春新堿(YCR)和阿霉素(Adr)產(chǎn)生了明顯的交叉耐藥性。


圖1為M0LT-4、M0LT-4/FU的細(xì)胞生長曲線圖。圖2為M0LT-4的細(xì)胞周期圖。圖3為M0LT-4/FU的細(xì)胞周期圖。圖4為羅丹明123在M0LT-4細(xì)胞內(nèi)的含量圖。圖5為羅丹明123在M0LT-4/FU細(xì)胞內(nèi)的含量圖。圖6為本發(fā)明M0LT-4/FU細(xì)胞株的顯微圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施例僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明方法的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株M0LT-4/FU的誘導(dǎo)建立采用逐步遞增5-FU濃度、間歇作用的體外誘導(dǎo)法建立急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株M0LT-4/FU，具體步驟如下:(I)人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞株M0LT-4用培養(yǎng)液(含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液)，5% C02，37°C條件下，培養(yǎng)至70% 90%貼壁率時，去上清，加入氟尿嘧啶1000ng/ml沖擊培養(yǎng)I小時，去氟尿嘧啶1000ng/ml培養(yǎng)液，空白RPM1-1640培養(yǎng)液洗滌2次后，更換增殖培養(yǎng)液培養(yǎng)72-96h擴(kuò)增存活細(xì)胞。至存活細(xì)胞擴(kuò)增至70% 90%貼壁率時，再重復(fù)用氟尿嘧啶1000ng/ml培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時9次，即總共完成10次氟尿嘧啶1000ng/ml紫杉醇培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時，進(jìn)一步以此細(xì)胞為基礎(chǔ)，1000ng/ml持續(xù)培養(yǎng)7天。 (2 )重復(fù)上述操作，將篩選條件依次改為氟尿嘧啶1000ng/ml、2000ng/ml、5000ng/ml, lOOOOng/ml,20000ng/ml 培養(yǎng)液。(3)敏感細(xì)胞逐漸死亡，而耐藥細(xì)胞繼續(xù)生長。如此反復(fù)誘導(dǎo)、換液、傳代，歷時約6月，最終得到在20 ii g / mL5-FU中穩(wěn)定生長增殖的耐藥株，命名為M0LT-4/FU。將該細(xì)胞凍存2月后復(fù)蘇，在不含5-FU的培養(yǎng)液中反復(fù)傳代2月以上仍基本保持原來的耐藥性。
實(shí)施例2耐藥株形態(tài)學(xué)觀察取對數(shù)生長期的急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株M0LT-4/FU，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖6所示:細(xì)胞形態(tài)變大，核皺縮。實(shí)施例3細(xì)胞生長曲線和群體倍增時間的測定細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為5X 103個/mL的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μ L細(xì)胞懸液(每孔500個細(xì)胞)；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2d、4d、6d、8d、10d ;將96孔板進(jìn)行MTT染色，每孔加入20 μ L MTT (5mg/mL)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時；棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μ L DMSO溶解，搖床10分鐘輕輕地混勻；λ =490nm，酶標(biāo)儀讀出每孔的OD值，以時間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。M0LT-4、M0LT-4/FU的細(xì)胞生長曲線見圖1。實(shí)施例4、PI染色法檢測細(xì)胞周期用0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2 X 105/ml，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h ；0.25%胰酶消化，收取細(xì)胞；用4°C保存的0.0lM PBS洗滌細(xì)胞3次，70%乙醇冰上固定5min, 2000rpm室溫離心5min,重懸于冷PBS Iml,備用；用流式細(xì)胞儀檢測,激發(fā)波長為488nm，接收波長為575nm。結(jié)果顯示，M0LT-4G1期、S期、G2期細(xì)胞分別為68.05%、14.59%、17.36%，M0LT-4/FU Gl 期、S 期、G2 期細(xì)胞分別為 77.33%、10.69%、11.98%，M0LT-4/FU S期、G2期細(xì)胞減少，Gl期細(xì)胞明顯增多，結(jié)果見圖2、圖3。
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實(shí)施例5流式細(xì)胞儀檢測羅丹明123蓄積用0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2 X 105/ml，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h ；0.25%胰酶消化，收取細(xì)胞；用4°C保存的0.0lM PBS洗滌細(xì)胞3次，收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1父1071111，每管加入濃度為5呢/1111的羅丹明123500uL，37°C保溫30min，500rpm離心2min，去除培養(yǎng)液，再用新培養(yǎng)液洗去細(xì)胞外的羅丹明染料，在37 °C保溫IOmin,使P-gp糖蛋白功能得以發(fā)揮，把藥物泵出，再用培養(yǎng)液洗I次，放在冰冷的培養(yǎng)液中待檢測，流式細(xì)胞儀用488nm的激發(fā)光，測試細(xì)胞熒光強(qiáng)度。結(jié)果見圖4、圖5。M0LT-4細(xì)胞熒光強(qiáng)度為5395，M0LT-4/FU細(xì)胞熒光強(qiáng)度為113，M0LT-4/FU細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞羅丹明123含量比M0LT-4減少。 實(shí)施例6藥物敏感試驗(yàn)細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為I X IO5個/ml的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入IOOul細(xì)胞懸液(每孔IX IO4個細(xì)胞)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100 μ L相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；將96孔板進(jìn)行MTT染色，λ =490nm,測定OD值；計(jì)數(shù)各組別抑制率及藥物IC50。試驗(yàn)結(jié)果參見表I。根據(jù)表I的結(jié)果可以看出，M0LT-4/FU對氟尿嘧啶、依托泊苷、順鉬、紫杉醇、長春新堿、阿霉素的耐藥指數(shù)是34.609,2.107、1.510、1.596,3.162,2.785。表I細(xì)胞株對各種化療藥物的IC50和耐藥指數(shù)
權(quán)利要求
1.一種急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株M0LT-4/FU，保藏號為CGMCC N0.7053。
2.如權(quán)利要求1所述的急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株M0LT-4/FU在構(gòu)建體內(nèi)外腫瘤耐藥模型中 的應(yīng)用 。
全文摘要
本發(fā)明采用逐步遞增5-FU濃度、間歇作用的體外誘導(dǎo)法，建立了急性淋巴母細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株MOLT-4/FU。該細(xì)胞株已經(jīng)于2012年12月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.7053。本發(fā)明的細(xì)胞株具有典型多藥耐藥特性，為進(jìn)一步研究耐藥逆轉(zhuǎn)途徑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/09GK103224909SQ20131014871
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月25日
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