專利名稱：一種預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員彈跳潛能的分子生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員彈跳潛能的分子生物學(xué)方法，即運用分子生物學(xué)方法對冰雪運動員的跳躍潛能進行預(yù)測，屬于體育科學(xué)和生物科學(xué)的交叉學(xué)科。
背景技術(shù)：
彈跳是冰雪運動員的一項重要專項素質(zhì)，跳躍項目要求運動員在短時間內(nèi)表現(xiàn)出最大速度或最大力量，對爆發(fā)力要求高，需要大功率、短時間的供能。教練員們無不將彈跳的訓(xùn)練放在優(yōu)秀冰雪運動員身體訓(xùn)練的重要地位上。彈跳是一項綜合性素質(zhì)，彈跳的發(fā)展受多種因素的影響和制約。盡管后天訓(xùn)練和營養(yǎng)等環(huán)境因素也能顯著影響人體的運動能力，研究也發(fā)現(xiàn)運動員的基因組成和多態(tài)性在很大程度上決定著他們的體能。爆發(fā)力有多種定義，簡單地說就是人體的功率，即力量乘以速度，很多冰雪運動項目都需要運動員有很好的彈跳力。如花樣滑冰，跳躍動作已經(jīng)是自由滑中最重要的成分，各種跳躍動作在現(xiàn)今自由滑內(nèi)容中，占有極大的百分比。做為一個參加比賽的運動員，不單有完成單個跳躍動作的能力，而且也應(yīng)該能聯(lián)跳和連續(xù)跳。跳躍動作是肌肉作功的結(jié)果，是由冰面彈起身體、自由地掠過空中及降落在冰上向后滑行的一些位移。它們的突出特點是要求運動員在短暫的時間內(nèi)，最大限度地募集肌肉收縮力量，發(fā)揮出體能潛力，運動員需要有較高的速度素質(zhì)和速度力量。大量研究表明a -肌動蛋白-3(a -actinin-3，ACTN3)基因與人體肌肉的爆發(fā)力密切相關(guān)，ACTN3基因定位于第11號染色體上，進化上具有高度的保守性，在人類肌肉的結(jié)構(gòu)和功能上都很重要。世界上約10億人缺乏ACTN3蛋白。這與人類ACTN3基因的多態(tài)性有關(guān)。ACTN3基因野生型(R)的第16個外顯子的第1747位是C，當(dāng)C突變成了 T后就成為突變型(X)。因此當(dāng)個體的ACTN3基因型是577XX純合子時，第577個氨基酸殘基(精氨酸)就變成了一個終止碼，從而導(dǎo)致ACTN3的缺失。速度素質(zhì)與神經(jīng)系統(tǒng)的反應(yīng)速度、靈敏、協(xié)調(diào)和肌肉系統(tǒng)、肌纖維類型有關(guān)，受先天性遺傳的影響較大，發(fā)展敏感期早，因此可以較早地運用表象指標(biāo)進行測試評價，為早期選材提供依據(jù)。速度力量發(fā)展敏感期較晚，到青春期后期才能達到較高水平。因此，利用ACTN3基因在早期準(zhǔn)確預(yù)測個體爆發(fā)力的水平，無疑可以提高速度力量性項群人才培養(yǎng)的成功率。研究證實，帶有R等位基因的個體具有爆發(fā)力的優(yōu)勢，而帶有X等位基因的個體無論在爆發(fā)力還是耐力上，都沒有顯現(xiàn)出任何特別之處。攜帶這種基因的運動員在接受相同質(zhì)量訓(xùn)練時比非攜帶者更容易取得好的運動成績。新的分子生物學(xué)證據(jù)表明，由于提高了有氧代謝相關(guān)酶類的生理活性，增加了慢肌纖維數(shù)量，減少了快肌纖維直徑，導(dǎo)致ACTN3敲除小鼠體內(nèi)的肌肉力量顯著降低。血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶(angiotensin I converting enzyme,ACE)基因多態(tài)性也已被證實與人體運動天賦相關(guān)。ACE基因位于17q23染色體區(qū)域，全長21kb，含26個外顯子和25個內(nèi)含子，在第16號內(nèi)含子以一段287bp的重復(fù)序列為標(biāo)記構(gòu)成ACE基因的插入/缺失((Insertion/Deletion, I/D)多態(tài)性。
研究發(fā)現(xiàn)運動員與常人不論在基因型頻率還是等位基因頻率上均有顯著差異(P< 0.02和？ < 0.003)，且優(yōu)秀運動員多為ACE-1I純合子，而少見DD純合子。普遍認(rèn)為確實存在ACE基因的I/D多態(tài)性與運動能力的相關(guān)性。Williams等發(fā)表在《Nature》雜志上的一篇研究結(jié)果認(rèn)為，肌肉作功與能量消耗的比值(DE)是評價肌肉效能的最好指標(biāo)，其研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過11周訓(xùn)練后僅ACE-1I基因型的DE顯著增高。另一研究報道ACE-1I基因型群體較ACE3/ID和DD基因型群體表現(xiàn)出相對高的能量節(jié)省化狀態(tài)，且去脂體重也高于其他基因型。這些研究結(jié)果均支持I等位基因主要是通過肌肉效能影響運動能力。此外，與ACE-1等位基因關(guān)聯(lián)的優(yōu)秀耐力運動員群體血漿和心肌組織的ACE水平也高于其他基因型。如果一名運動員同時擁有多種促進運動能力的基因組合，則他很可能在自己的領(lǐng)域取得較大突破。影響運動能力的基因變異體的發(fā)現(xiàn)和性質(zhì)鑒定，使得在兒童中開展DNA測試，以辨別出適合某種特殊體育運動項目的天才或者優(yōu)化訓(xùn)練方法成為可能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過檢測ACTN3基因R/X多態(tài)性和ACE基因I/D多態(tài)性來預(yù)測冰雪運動員的彈跳潛能。實施方案主要試劑:紅細胞裂解液(10mmol/LTris-HCL pH7.6，5mmol/L，MgCl2，IOmmoI/L NaCl)，白細胞裂解液(10mmol/L Tris,pH7.6,10mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl)、蛋白酶 K、10% SDS、6M飽和氯化鈉、苯酚氯仿異戊醇(25: 24:1)。操作步驟:1、抽取血液靜脈抽取冰雪運動員靜脈血10mL，肝素抗凝。2、基因組DNA的提取及純化(I)將抗凝血以1500r/min離心5min,吸出血衆(zhòng)。(2)加等體積的紅細胞裂解液,上下顛倒充分混勻，2500 3000r/min離心15min,
去上清液。(3)加適量紅細胞裂解液2 3mL,上下顛倒充分混勻，4000r/min離心12min,去
上清液。(4)重復(fù)步驟(3)2 3次，加白細胞裂解液3mL，上下顛倒混勻，加適量10% SDS,輕輕搖勻，加10mg/mL RNAase，37°C水浴中孵育2h，加10mg/mL蛋白酶K，37°C恒溫水浴中孵育過夜。(5)加入等量體積的飽和酹,混勻后2500r/min離心IOmin,取上清液(注意不要吸到有機相和無機相之間的蛋白質(zhì))。(6)加等量體積的苯酹氯仿異戍醇(25: 24: I), 5000r/min離心IOmin,取上清液加等量的氯仿異戍醇(24: I) 5000r/min離心lOmin。(7)取上清液，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕搖動至絮狀DNA析出，1000 1500r/min離心5min,使DNA貼壁去乙醇，用70 乙醇清洗一次，1000 1500r/min離心5min,去乙醇。
(8)適量 70% 乙醇將 DNA 重懸，移入 0.15mL 的 ^pendof 管中，1000 1500r/min離心5min，去乙醇，自然干燥。(9)將DNA溶解于TE緩沖液中。取2 y LDNA樣品，用紫外分光光度法檢測樣品的A (OD)值及DNA濃度，最后DNA均調(diào)整至100 U g/mL。3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)(I)引物設(shè)計ACTN3 基因上游引物:5，CTG TTG CCT GTG GTA AGT GGG-3’ACTN3 基因下游引物:5，TGG TCA CAG TAT GCA GGA GGG-3，ACE 基因上游引物:5，CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3，ACE 基因下游引物:5’ GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3’ (2) ACTN3基因-PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)PCR 反應(yīng)體系 :3u L ddH20、上下游引物個 Iii L、10ii L 2 X Reddy Mix (5mM MgCl2)、5 ii L基因組DNA。基因PCR反應(yīng)條件:95 °C預(yù)變性5min，94 V變性30s，60 V退火30s，72 °C延伸30s，共35個循環(huán)，72°C延伸30s，延伸循環(huán)完畢，取出PCR管，置于4°C冰箱待測。(3) ACE基因-PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)PCR 反應(yīng)體系:總體系 25 ii L、ddH2015 u L、dNTP2.0 u L, 10*buffer2.5 y L (內(nèi)含 Mg2+，濃度為 15_/1)、]\%2+1.01^(濃度2511111/1)、引物各 1.0ii L、模板 2.0ii L Taq 酶
0.5 u L0ACE 基因 PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 lmin，55.5°C退火 lmin，72DC延伸lmin30s，共30個循環(huán)，72°C延伸lOmin，延伸循環(huán)完畢，取出PCR管，置于4°C冰箱待測。4、ACTN3和ACE基因型鑒定(1)ACTN3基因型鑒定取15 ii L PCR產(chǎn)物與Loadingbuffer混合，3%瓊脂糖凝膠電泳約90min，電泳后取出凝膠塊放置于紫外線分析儀內(nèi)，觀察電泳條帶并用照相機拍攝圖片。根據(jù)MARKER識別86、97、108和205bp大小片段的RR基因型的個體。(2) ACE基因型鑒定瓊脂糖凝膠電泳:按2: 7體積將Loadingbuffer與PCR產(chǎn)物混合，I %瓊脂糖凝膠電泳約40min，電泳后取出凝膠塊放置于紫外線分析儀內(nèi)，觀察電泳條帶并用照相機拍攝圖片。篩選僅有401bp條帶的純合子插入型(II)。5、統(tǒng)計篩選根據(jù)凝膠電泳的條帶大小來判斷待測者的ACTN3基因和ACE基因的基因型。篩選出ACTN3基因為RR型同時ACE基因為II型的個體。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明是一種預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員彈跳潛能的分子生物學(xué)方法。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過測定冰雪運動員血液來源基因組DNA中ACTN3基因型R/X多態(tài)性和ACE基因型I/D多態(tài)性來預(yù)測冰雪運動員的彈跳潛能。即篩選ACTN3(RR)型同時ACE基因 為(II)型的個體。
全文摘要
ACTN3基因的577R等位基因?qū)τ诹α克刭|(zhì)和速度素質(zhì)來說是優(yōu)勢等位基因。在眾多對抗阻訓(xùn)練效果的研究中，也均發(fā)現(xiàn)R等位基因攜帶者的訓(xùn)練敏感性更高。ACTN3基因的多態(tài)性與力量素質(zhì)密切相關(guān)不容置疑。另外，ACE基因組中I等位基因也可能是力量素質(zhì)的相關(guān)基因。本發(fā)明通過同時測定冰雪運動員血液來源基因組DNA中ACTN3基因型R/X多態(tài)性和ACE基因型I/D多態(tài)性來預(yù)測冰雪運動員的彈跳潛能即篩選ACTN3-RR型同時ACE基因為純合子插入(II)型的群體。本發(fā)明可用于優(yōu)秀冰雪運動員早期的選拔。
文檔編號C12Q1/68GK103160597SQ20131011593
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者賈春佳, 呂嬋, 張臣, 孫玉姣, 陸濤峰, 關(guān)偉軍 申請人:哈爾濱體育學(xué)院