專利名稱：一種預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員耐力潛能的分子生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員耐力潛能的分子生物學(xué)方法，具體地說就是通過分析ACE (Angiotensin-converting enzyme) I/D (激肽酶II基因插入/缺失型)的多態(tài)性，從而得知ACE基因多態(tài)性通過何種途徑影響杰出耐力的天賦。此發(fā)明屬于基礎(chǔ)生命科學(xué)、人類遺傳資源學(xué)、分子生物學(xué)及運動科學(xué)的交叉學(xué)科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
ACE是一個20肽單鏈酸性糖蛋白，為含鋅的金屬水解酶，其系統(tǒng)名為肽基一二肽水解酶或激肽酶II。ACE廣泛存在于全身各組織，主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞(尤以肺循環(huán)多見)、腎上皮細(xì)胞等。緩激肽是ACE的天然底物，通過裂解兩個羥基末端二肽來抑制其生物學(xué)活性。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-anglotensin system, RAS)包括血管緊張素原(Angiotensin origin,簡寫為A0)、血管緊張素I (Angiotensin I，簡寫為Ang I)、血管緊張素 II (Angiotensin II，簡寫為 Ang II)、腎素、ACE 和血管緊張素 II 受體(Angiotensin IIreceptor，簡寫為AT)。RAS在心血管系統(tǒng)中作用顯著，如調(diào)節(jié)血壓、血容量、血管張力，以及引起血管壁增厚或心肌細(xì)胞的肥大和非心肌細(xì)胞的增殖。其中Ang II是RAS中的效應(yīng)肽，通過其受體AT引起心肌和血管收縮，調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡，引起細(xì)胞增生、增殖等。Ang II對心臟有直接和短暫的作用，包括增加心率和增強心肌收縮性；同時，Ang II還對心臟有長期影響其結(jié)構(gòu)的效應(yīng)，其主要通過引起心肌細(xì)胞的肥大和成纖維細(xì)胞刺激膠原與結(jié)蒂組織生成。ACE是RAS酶/底物鏈反應(yīng)體系中的關(guān)鍵酶，ACE的作用是催化十肽Ang I轉(zhuǎn)變?yōu)榘穗腁ng II。ACE水平?jīng)Q定著RAS中Ang II生成量。眾多研究證實，ACE水平穩(wěn)定，測量重復(fù)性好，環(huán)境代謝和激素因素對其影響較少。但是，研究也證實ACE水平在個體之間存在明顯可變性，差異可達(dá)5倍之多。顯然，ACE水平一方面與個體內(nèi)穩(wěn)定，并與缺乏環(huán)境因素相關(guān)聯(lián)，另一方面由于個體間差異較大的現(xiàn)象，使人們推測ACE水平在較大程度上由遺傳決定。ACE基因位于17號染色體長臂2區(qū)3帶(17q23)。ACE基因跨距為21kb，有26個外顯子和25個內(nèi)含子。目前已發(fā)現(xiàn)6種ACE基因多態(tài)標(biāo)志，但第16內(nèi)含子中存在的287bp的Alu插入片段和/或缺失片段研究最多。由此，ACE基因在此多態(tài)標(biāo)志位點可分為DD純合子缺失型，ID雜合子插入或缺失型和II純合子插入型三種不同的基因型。DNA多態(tài)性是指染色體等位基因中核苷酸排列的差異性。DNA區(qū)域中等位基因(或片段)存在兩種或兩種以上的形式，可分為序列多態(tài)性和序列長度多態(tài)性。其中序列長度多態(tài)性由重復(fù)序列以各自的核心序列串聯(lián)重復(fù)出現(xiàn)或散在地分布于染色體上，以插入/缺失方式形成多態(tài)性(如Alu重復(fù)序列)，這種多態(tài)性是目前最有價值的遺傳標(biāo)志。最大有氧代謝能力的影響因素可以歸納于中樞機制和外周機制。其中，心室容積和每搏輸出量是中樞機制中的核心環(huán)節(jié)，良好的心血管功能，特別是動脈和心臟的順應(yīng)性是優(yōu)秀耐力運動員成功的關(guān)鍵；肌纖維類型、肌毛細(xì)血管密度和氧化酶的活性是外周機制中的主要角色。ACE基因I/D多態(tài)性與運動員有氧耐力存在關(guān)聯(lián)，是決定人體有氧耐力素質(zhì)的關(guān)鍵因素，同時影響人體有氧耐力素質(zhì)的最佳水平及人體對耐力訓(xùn)練的敏感度。該基因主要影響人體的心肺功能，從而影響人體的有氧耐力素質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明能夠預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員的耐力潛能。本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員耐力潛能的分子生物學(xué)方法。本發(fā)明所提供的預(yù)測方法是ACE基因I/D(激肽酶II基因插入/缺失型)多態(tài)性分析。位于ACE基因內(nèi)含子16的插入或缺失多態(tài)性經(jīng)PCR方法檢測后，可呈現(xiàn)3種帶型:僅有401bp條帶的為純合子插入型(II)，僅有113bp條帶的為純合子缺失型(DD)，有401bp和113bp兩個條帶的為雜合子插入或缺失型(I/D)。DD、ID、II基因型血清ACE水平三者間有顯著差異，DD型人的ACE水平最高，ID型次之，II型人最低。
具體實施例方式下面以優(yōu)秀冰雪運動員和普通人為實驗對象進(jìn)行ACE基因I/D (激肽酶II基因插入/缺失型)多態(tài)性分析為例，詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實施。實施例:ACE基因I/D (激肽酶II基因插入/缺失型)多態(tài)性分析研究對 象研究對象主要分2組，優(yōu)秀冰雪運動員組和普通人組，普通人組主要選擇與本次優(yōu)秀運動員年齡相當(dāng)?shù)谋镜貐^(qū)人，嚴(yán)格按照隨機抽樣的原則進(jìn)行，均無專業(yè)運動訓(xùn)練史。ACE基因Ι/D多態(tài)性的測定(一)DNA 的提取從肘靜脈取2ml全血注入肝素(10U/ml)抗凝試管，然后立即離心(1500rpm，IOmin)。溶解全血中的紅細(xì)胞后，轉(zhuǎn)至1.5ml eppendorf管中，制備成白細(xì)胞沉淀保存于_80°C備用。使用經(jīng)典法DNA抽提試劑盒從白細(xì)胞沉淀中抽提總DNA。(二)引物設(shè)計及PCR產(chǎn)物測序引物設(shè)計先通過互聯(lián)網(wǎng)從Genbank數(shù)據(jù)庫中查找到公開發(fā)表的ACE基因序列，選擇合適的序列范圍，采用Primer select5.0引物設(shè)計軟件,設(shè)計出的引物一般長21 24bp，退火溫度為58°C 60°C，通過PCR擴增后獲得了相應(yīng)的條帶。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測定，證實擴增產(chǎn)物序列與文獻(xiàn)報道完全一致，說明上述引物對選定的基因具有高度特異性。引物的序列如下:上引物(Forward):5，TCC CAT TTC TCT AGA CCT GCT G3，下引物(Reverse):5，GCC CTT AGC TCA CCT CTG CT3，(三)PCR反應(yīng)體系(251)總反應(yīng)體系為251。Η2012.81、5Xbuffer51、10mM dNTPs0.751、250mM Mg2+0.41、10M primer for0.41>10M primer Rev0.41> Ext aq Hs0.251、DNA(10ng/l)51。(四)PCR反應(yīng)條件初期預(yù)變性95 °C，5min、變性 95 V 30s、退火 58 °C 30s、延伸 72 V 60s，2-4X40cycles、最后延伸 72°C 7min、4°C IOmin0(五)電泳將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物 IOl+6 X loading buffer21 于 1.6 % Agarose 凝膠電泳(膠45ml+FB21)成像，在紫外燈下顯影，通過凝膠照相及圖像分析系統(tǒng)攝片，并確定基因型。(六)ACE基因型的判斷與鑒定結(jié)果位于ACE基因內(nèi)含子16的插入或缺失多態(tài)性經(jīng)上述PCR方法檢測后，可擴增出兩種長度的片段，即401bp插入擴增片段(I)和113bp的缺失片段(D)，紫外燈下可呈現(xiàn)下面3種帶型:僅有401bp條帶的為純合子插入型(II)，僅有113bp條帶的為純合子缺失型(DD)，有401bp和113bp兩個條帶的為雜合子插入或缺失型(Ι/D)。研究表明位于第16內(nèi)含子的一段287bp的Alu重復(fù)序列的插入/缺失(Ι/D)有多態(tài)性，使ACE基因有3種基因型:11(插入純合型)、ID (插入/缺失型)和DD (缺失純合型)。ACE在血中濃度受遺傳因素影響，證實ACE基因多態(tài)性與血漿及細(xì)胞內(nèi)ACE水平有很大關(guān)聯(lián)。DD、ID、II基因型血清ACE水平三者間有顯著差異，DD型人的ACE水平最高，ID型次之，II型人最低。ACE基因Ι/D多態(tài)性與運動員有氧耐力存在關(guān)聯(lián),是決定人體有氧耐力素質(zhì)的關(guān)鍵因素，同時影響人體有氧耐力素質(zhì)的最佳水平及人體對耐力訓(xùn)練的敏感度。該基因主要影響人體的心肺功能， 從而影響人體的有氧耐力素質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種探究 ACE (Angiotensin-converting enzyme) I/D (激妝酶 II 基因插入 / 缺失型)多態(tài)性與優(yōu)秀冰雪運動員耐力潛能關(guān)系的方法。
2.一種插入純合型(II)基因、插入/缺失型(ID)基因和缺失純合型(DD)基因的克隆與檢測方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，此方法的創(chuàng)新點在于通過定量評價ACE基因Ι/D多態(tài)性與優(yōu)秀冰雪運動員耐力素質(zhì)的相關(guān)性，從而可以將ACE基因Ι/D多態(tài)性作為預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員耐力潛能基因選材的候選位點之一。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能夠預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員耐力潛能的分子生物學(xué)方法，該方法能夠探究ACE(Angiotensin-converting enzyme)I/D(激肽酶II基因插入/缺失型)多態(tài)性與優(yōu)秀冰雪運動員耐力潛能的關(guān)系。大量研究結(jié)果表明，基因I/D多態(tài)性與運動員有氧耐力存在關(guān)聯(lián)，是決定人體有氧耐力素質(zhì)的關(guān)鍵因素，同時影響人體有氧耐力素質(zhì)的最佳水平及人體對耐力訓(xùn)練的敏感度。該基因主要影響人體的心肺功能，從而影響人體的有氧耐力素質(zhì)。鑒于ACE基因與運動有氧耐力有關(guān)，應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行該基因在優(yōu)秀冰雪運動員的分布研究，對于確定該基因與耐力型冰雪運動相關(guān)性有重要的理論意義，對于今后應(yīng)用其進(jìn)行分子選材也將奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK103160592SQ20131011351
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者劉石, 武大偉, 譚睿, 裴沛, 張文秀, 關(guān)偉軍 申請人:哈爾濱體育學(xué)院