專利名稱：一種豬凝血酶的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種凝血酶的制備方法。
背景技術：
凝血酶是一種廣泛存在于動物和人體血液中的與血液凝固系統(tǒng)相關的一種凝血酶前體物(凝血酶原)經(jīng)激活后形成的一種絲氨酸蛋白酶，是主導凝血反應的一種主要酶類。臨床上，凝血酶適用于結(jié)扎止血困難的小血管、毛細血管以及實質(zhì)性臟器出血的止血。用于外傷、手術、口腔、耳鼻喉、泌尿、燒傷、骨科、等出血的止血凝血酶能直接作用于血液中的纖維蛋白原，促使轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，加速血液的凝固而止血。臨床用于外傷、手術、口腔、耳鼻咽喉、泌尿、婦產(chǎn)科、消化道出血的止血。目前，臨床上應用的凝血酶產(chǎn)品，主要是從人血、豬、牛等動物血中分離提取的，其中，由于豬血的來源充分，原料成本低等因素，所以大部分凝血酶是從豬血中分離提取的，少部分是從人血及牛血等血液中分離提取的。但是，不論是從動物血或人血中分離的凝血酶產(chǎn)品都可能存在感染各種病毒的風險，也為產(chǎn)品的應用埋下了安全隱患，為此，國家食品藥品監(jiān)督管理局曾下發(fā)文件，要求所有的動物源性生化藥物，在生產(chǎn)中都應有相應的去除或滅活病毒的工藝，以保證產(chǎn)品的生物安全性，參見《多組分生化藥注射劑基本技術要求(試行)》和《生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價技術審評一般原則》。為此，在生產(chǎn)工藝上和產(chǎn)品的最終處方上必須做出相應的調(diào)整來適 應病毒去除或滅活工藝的開展。目前，豬凝血酶生產(chǎn)工藝方法上主要有鋇鹽吸附的方法，就是將血漿中加入鋇鹽吸附，然后再進一步精制，如公開工藝CN1063789C和CN102337255A，這類工藝的主要缺點就是產(chǎn)出率低；另外，專利CN1294257C還公開了一種采用陰離子交換層析的方法來提取凝血酶，但是，在其公開資料中并沒有公開使用哪一種型號的陰離子交換劑，因為不同的陰離子交換劑所需要的工藝條件是不同的(如PH值，離子濃度等)，所以其公開的離子交換的的工藝條件是沒有意義的，同時由于層析柱自身體積限制，一次加工的血漿量有限，一般每次只能處理數(shù)升到十幾升血漿，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有方法制備豬凝血酶產(chǎn)率低以及不適于大規(guī)模生產(chǎn)的問題，而提供了一種豬凝血酶的制備方法。本發(fā)明的一種豬凝血酶的制備方法，是按照以下步驟進行的:一、分離豬血漿:取新鮮豬血，加入抗凝劑，離心分離，得豬血漿；其中，新鮮豬血與抗凝劑的質(zhì)量比為250:1 ;二、化學法病毒滅活:按照豬血漿總重量的10%加入病毒滅活試劑，在24 26°C下保溫6 8h，進行病毒滅活；
三、吸附凝血酶原:按照豬血漿總重量的1.5%加入離子交換樹脂，在室溫下吸附40 60min，然后用濾布過濾收集離子交換樹脂，用5 10倍離子交換樹脂重量的洗滌液，洗滌離子交換樹脂，棄去洗滌液；四、收集凝血酶原:將步驟三經(jīng)洗滌液洗滌的離子交換樹脂，用3倍樹脂體積的洗脫液進行洗脫，收集洗脫液，將收集的洗脫液用截留分子量為10000道爾頓的超濾器進行透析，去除多余的鹽類物質(zhì)，使收集的洗脫液的電導率降到3mS/cm以下，即得到凝血酶原溶液；五、納米過濾:將步驟四得到的凝血酶原溶液，用孔徑為20nm的過濾器進行過濾，收集濾過液；六、凝血酶原的活化:按質(zhì)量百分含量為1%的比例向步驟五中得到的濾過液中加入兔腦磷脂粉末，然后在20 30°C下保溫6 8h，即得豬凝血酶；七、凝血酶的凍干保存:將步驟六獲得的豬凝血酶用生理鹽水稀釋至500IU/ml后，加入凍干賦形劑和保護劑，灌裝入西林瓶中，進行凍干，真空壓塞軋蓋，得到凝血酶凍干粉。本發(fā)明包含以下有益效果:本發(fā)明工藝過程中包含去除和殺滅病毒的方法，能夠提高凝血酶產(chǎn)品的生物安全性，同時，采用特定的離子交換樹脂提取工藝，獲得更高的凝血酶收獲率，可以達到80000IU/L血漿以上，由于本發(fā)明是采用將離子交換樹脂直接按比例投入到血漿中吸附的方法，故每次可以處理I噸到數(shù)噸的血漿，便于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施例方式本發(fā)明技術方 案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一:本實施方式的一種豬凝血酶的制備方法，是按照以下步驟進行的:一、分離豬血漿:取新鮮豬血，加入抗凝劑，離心分離，得豬血漿；其中，新鮮豬血與抗凝劑的質(zhì)量比為250:1 ;二、化學法病毒滅活:按照豬血漿總重量的10%加入病毒滅活試劑，在24 26°C下保溫6 8h，進行病毒滅活；三、吸附凝血酶原:按照豬血漿總重量的1.5%加入離子交換樹脂，在室溫下吸附40 60min，然后用濾布過濾收集離子交換樹脂，用5 10倍離子交換樹脂重量的洗滌液，洗滌離子交換樹脂，棄去洗滌液；四、收集凝血酶原:將步驟三經(jīng)洗滌液洗滌的離子交換樹脂，用3倍樹脂體積的洗脫液進行洗脫，收集洗脫液，將收集的洗脫液用截留分子量為10000道爾頓的超濾器進行透析，去除多余的鹽類物質(zhì)，使收集的洗脫液的電導率降到3mS/cm以下，即得到凝血酶原溶液；五、納米過濾:將步驟四得到的凝血酶原溶液，用孔徑為20nm的過濾器進行過濾，收集濾過液；六、凝血酶原的活化:按質(zhì)量百分含量為1%的比例向步驟五中得到的濾過液中加入兔腦磷脂粉末，然后在20 30°C下保溫6 8h，即得豬凝血酶；七、凝血酶的凍干保存:將步驟六獲得的豬凝血酶用生理鹽水稀釋至500IU/ml后，加入凍干賦形劑和保護劑，灌裝入西林瓶中，進行凍干，真空壓塞軋蓋，得到凝血酶凍干粉。本實施方式的工藝過程中包含去除和殺滅病毒的方法，能夠提高凝血酶產(chǎn)品的生物安全性，同時，采用特定的離子交換樹脂提取工藝，獲得更高的凝血酶收獲率，可以達到80000IU/L血漿以上，由于本實施方式是采用將離子交換樹脂直接按比例投入到血漿中吸附的方法，故每次可以處理I噸到數(shù)噸的血漿，便于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施方式
二:本實施方式與具體實施方式
一不同的是:步驟一中所述的抗凝劑為質(zhì)量百分含量為0.4%的枸櫞酸三鈉。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三:本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是:步驟二中所述的病毒滅活試劑包含聚山梨酸甲酯-80和磷酸三丁酯的水溶液，其中聚山梨酸甲酯-80為體積百分比含量11%，磷酸三丁酯為體積百分比含量3.3%，其余為水。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四:本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是:步驟三中所述的離子交換樹脂為DEAE-Sephadex A-50型離子交換樹脂。其它與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五:本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是:步驟三中所述的洗滌液由100 150mM氯化鈉和IOmM的枸櫞酸鈉的水溶液組成，其中，洗滌液pH值為6 7。其它與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六:本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是:步驟四中所述的洗脫液由1.0M 2.0M氯化鈉和IOmM的枸櫞酸鈉的水溶液組成，其中，洗脫液pH值為6 7。其它與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七:本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是:步驟七中所述的的凍干賦形劑為右旋糖酐-40或甘露醇，凍干賦形劑按質(zhì)量百分含量為1%的添加量添力口。其它與具體實施方式
一至六之一相同。
具體實施方式
八:本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是:步驟七中所述的保護劑為人血白蛋白，保護劑按質(zhì)量百分含量為0.3-0.5%的添加量添加。其它與具體實施方式
一至七之一相同。通過以下實例來對本發(fā)明的作進一步說明，但并不限于以下實例。實例1:本實施例的一種豬凝血酶的制備方法，是按照以下步驟進行的:一、分離豬血漿:采集屠宰(哈爾濱市呼蘭區(qū)付江動物臟器經(jīng)銷部)中的新鮮豬血2000L,加入0.4% (W/V)即8000g的質(zhì)量百分含量為0.4%的枸櫞酸三鈉作為抗凝劑，室溫離心分離得豬血漿1200L ；二、化學法病毒滅活:按照豬血漿總量的10% (V/V)即加入病毒滅活試劑120L，在24°C下保溫6小時；三、吸附凝血酶原:按照豬血漿總量的1.5% (W/V)的比例加入離子交換樹脂即18Kg，在室溫下吸附40min，用濾布過濾收集離子交換樹脂，用10倍于樹脂量的洗滌液180L洗滌離子交換樹脂，去除殘余血漿和化學病毒滅活試劑，棄去洗滌液；四、收集凝血酶原:將經(jīng)洗滌液洗滌的離子交換樹脂，用樹脂體積3倍量的洗脫液進行洗脫，收集洗脫液54L，將收集的洗脫液用截留分子量為10000道爾頓的超濾器進行透析，去除多余的鹽類物質(zhì)，使收集的洗脫液的電導率降到3mS/cm，即得到凝血酶原溶液54L ；五、納米過濾:將步驟四得到的凝血酶原溶液，用孔徑為20nm的過濾器進行過濾，收集濾過液54L ；六、凝血酶原的活化:向步驟五收集的濾過液中按照1% (W/V)的比例加入兔腦磷脂粉末540g，在20°C下保溫6h，使凝血酶原充分活化，轉(zhuǎn)變成豬凝血酶，0.22 μ m濾器過濾，收集過濾液53L ；七、凝血酶的凍干保存:將步驟六獲得的豬凝血酶凝血酶用生理鹽水稀釋到藥典規(guī)定的濃度500IU/ml后，加入凍干賦形劑甘露醇1% (W/V)和保護劑人血白蛋白0.5% (ff/V),灌裝入西林瓶中，進行凍干，真空壓塞軋蓋，得到凝血酶凍干粉。本實施例步驟二中所述的病毒滅活試劑，是一種含聚山梨酸甲酯-80和磷酸三丁酯的水溶液，其中，聚山梨酸甲酯-80為總體積百分比含量11%，磷酸三丁酯為總體積百分比含量3.3%，其余為水；本實施例步驟三中所述的離子交換樹脂為DEAE-Sephadex A-50型離子交換樹脂；本實施例 步驟三中所述的洗滌液是一種同時含有100 150mM氯化鈉溶液和IOmM的枸櫞酸鈉的水溶液，其中，洗滌液PH值為6 7 ;本實施例步驟四中所述的洗脫液是一種同時含有1.0M 2.0M氯化鈉溶液和IOmM的枸櫞酸鈉的水溶液，其中，洗脫液PH值為6 7 ;本實施例步驟七中所述的凍干賦形劑為右旋糖酐-40或甘露醇，凍干賦形劑按質(zhì)量百分含量為1%的添加量添加；本實施例步驟七中所述的步驟七中所述的保護劑為人血白蛋白，保護劑按質(zhì)量百分含量為0.3-0.5%的添加量添加。實例2對實施例1制得的豬凝血酶活性和收率進行測量取實例I中步驟六中獲得的濾液樣品，按照《中國藥典》2010年版二部凝血酶項下的標準方法檢驗，測得凝血酶活性:A，纖維蛋白原溶液的制備，取纖維蛋白原，加0.9 %氯化鈉溶液溶解并制成含
0.1 %凝固物的溶液。B，標準曲線的制備，取凝血酶標準品，用0.9%氯化鈉溶液溶解并分別定量稀釋制成每Iml中含5.0單位、6.4單位、8.0單位與10.0單位的標準品溶液。C，供試品溶液的制備，取本品5瓶，分別加適量0.9%氯化鈉溶液溶解，并全量轉(zhuǎn)移至同以量瓶中，用上述溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取適量，用上述氯化鈉溶液定量稀釋制成每Iml中含7單位的供試品溶液。D,測定法,取內(nèi)徑1cm、長IOcm的試管4支,各精密加入纖維蛋白原溶液0.9ml,置370C ±0.5°C水浴中保溫5分鐘，再分別精密量取上述4種濃度的標準品溶液各0.1ml，迅速加入各試管中，立即計時、搖勻，置37°C ±0.5°C水浴中，觀察纖維蛋白原的初凝時間。每種濃度測5次，求平均值(5次測定之最大值與最小值的差不得超過平均值的10%，否則重測)。標準品溶液的濃度應控制凝結(jié)時間在14 60秒為宜。以標準品效價(單位)的對數(shù)為橫坐標，凝結(jié)時間(秒)的對數(shù)為縱坐標,進行直線回歸。精密量取供試品溶液0.1ml,按上述方法平行測定5次，求出凝結(jié)時間的平均值(誤差要求同標準曲線)，用直線回歸方程求得單位數(shù)，計算，即得。 結(jié)果:在獲得的53L凝血酶溶液中，凝血酶活性為1857.17IU/ml,共計獲得98430000IU凝血酶，起始血漿量為1200L，相當于每一升血漿中獲得82025IU。
權利要求
1.一種豬凝血酶的制備方法，其特征在于所述的豬凝血酶的制備方法，具體步驟步驟為: 一、分離豬血漿:取新鮮豬血，加入抗凝劑，離心分離，得豬血漿；其中，新鮮豬血與抗凝劑的質(zhì)量比為250:1 ； 二、化學法病毒滅活:按照豬血漿總重量的10%加入病毒滅活試劑，在24 26°C下保溫6 8h，進行病毒滅活； 三、吸附凝血酶原:按照豬血漿總重量的1.5%加入離子交換樹脂，在室溫下吸附40 60min，然后用濾布過濾收集離子交換樹脂，用5 10倍離子交換樹脂重量的洗滌液，洗滌離子交換樹脂，棄去洗漆液； 四、收集凝血酶原:將步驟三經(jīng)洗滌液洗滌的離子交換樹脂，用3倍樹脂體積的洗脫液進行洗脫，收集洗脫液，將收集的洗脫液用截留分子量為10000道爾頓的超濾器進行透析，去除多余的鹽類物質(zhì)，使收集的洗脫液的電導率降到3mS/cm以下，即得到凝血酶原溶液； 五、納米過濾:將步驟四得到的凝血酶原溶液，用孔徑為20nm的過濾器進行過濾，收集濾過液； 六、凝血酶原的活化:按質(zhì)量百分含量為1%的比例向步驟五中得到的濾過液中加入兔腦磷脂粉末，然后在20 30°C下保溫6 8h，即得豬凝血酶； 七、凝血酶的凍干保存:將步驟六獲得的豬凝血酶用生理鹽水稀釋至500IU/ml后，力口入凍干賦形劑和保護劑，灌裝入西林瓶中，進行凍干，真空壓塞軋蓋，得到凝血酶凍干粉。
2.根據(jù)權 利要求1所述的一種豬凝血酶的制備方法，其特征在于步驟一中所述的抗凝劑為質(zhì)量百分含量為0.4%的枸櫞酸三鈉。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種豬凝血酶的制備方法，其特征在于步驟二中所述的病毒滅活試劑包含聚山梨酸甲酯-80和磷酸三丁酯的水溶液，其中聚山梨酸甲酯-80為體積百分比含量11%，磷酸三丁酯為體積百分比含量3.3%，其余為水。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種豬凝血酶的制備方法，其特征在于步驟三中所述的離子交換樹脂為DEAE-S^hadex A-50型離子交換樹脂。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種豬凝血酶的制備方法，其特征在于步驟三中所述的洗滌液由100 150mM氯化鈉和IOmM的枸櫞酸鈉的水溶液組成，其中，洗滌液pH值為6 7。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種豬凝血酶的制備方法，其特征在于步驟四中所述的洗脫液由1.0M 2.0M氯化鈉和IOmM的枸櫞酸鈉的水溶液組成，其中，洗脫液pH值為6 7。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種豬凝血酶的制備方法，其特征在于步驟七中所述的的凍干賦形劑為右旋糖酐-40或甘露醇，凍干賦形劑按質(zhì)量百分含量為1%的添加量添加。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種豬凝血酶的制備方法，其特征在于步驟七中所述的保護劑為人血白蛋白，保護劑按質(zhì)量百分含量為0.3-0.5%的添加量添加。
全文摘要
一種豬凝血酶的制備方法，它涉及一種凝血酶的制備方法。本發(fā)明要解決現(xiàn)有方法制備豬凝血酶產(chǎn)率低以及不適于大規(guī)模生產(chǎn)的問題。本發(fā)明的方法包括一、分離豬血漿；二、化學法病毒滅活；三、吸附凝血酶原；四、收集凝血酶原；五、納米過濾；六、凝血酶原的活化；七、凝血酶的凍干保存。本發(fā)明能夠提高凝血酶產(chǎn)品的生物安全性，同時，采用特定的離子交換樹脂提取工藝，獲得更高的凝血酶收獲率，可以達到80000IU/L血漿以上，由于本發(fā)明是采用將離子交換樹脂直接按比例投入到血漿中吸附的方法，故每次可以處理1噸到數(shù)噸的血漿，便于大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明應用于凝血酶工業(yè)生產(chǎn)領域。
文檔編號C12N9/74GK103160486SQ201310112769
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月2日 優(yōu)先權日2013年4月2日
發(fā)明者董繼勝, 王金富, 馮文善, 魏彥, 趙波 申請人:黑龍江迪龍制藥有限公司