專利名稱：一種預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能的分子生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能的分子生物學(xué)方法，即通過用ACTN3基因分子標(biāo)記方法預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能的方法，屬于體育科學(xué)和生命科學(xué)交叉的學(xué)科和領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
冰雪運(yùn)動(dòng)在實(shí)現(xiàn)我國(guó)體育運(yùn)動(dòng)綜合發(fā)展戰(zhàn)略中起著重要的作用。改革開放以來，我國(guó)冰雪運(yùn)動(dòng)有了較大的發(fā)展，取得了一些成就。近年來我國(guó)冰雪運(yùn)動(dòng)的科學(xué)研究空前活躍，無論從理論方面還是理論與實(shí)踐結(jié)合方面，都有許多優(yōu)秀的研究成果。但是我們還應(yīng)該清楚地看到，在發(fā)展中還有許多有待探討和解決的問題。隨著科學(xué)技術(shù)越來越多地運(yùn)用到競(jìng)技體育領(lǐng)域，優(yōu)秀體育人才的選拔和培養(yǎng)也日趨白熱化，對(duì)運(yùn)動(dòng)員的選拔還停留在形態(tài)、生理機(jī)能的指標(biāo)上，傳統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)員選材方法已經(jīng)無法滿足當(dāng)今競(jìng)技體育科學(xué)發(fā)展的需求。其一，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和科技的日益進(jìn)步，訓(xùn)練更加客觀和科學(xué)化，在訓(xùn)練條件、方法、手段的差別日漸縮小的情況下，運(yùn)動(dòng)員先天條件的重要性更加突出。其二，運(yùn)動(dòng)員出成績(jī)的年齡提前，尤其在體操、跳水、游泳、蹦床、技巧等項(xiàng)目上較為明顯。這要求必須從童年起選拔有前途的運(yùn)動(dòng)苗子予以長(zhǎng)期專門訓(xùn)練，才能有計(jì)劃、有目的、又快又好地培養(yǎng)尖子運(yùn)動(dòng)員。其三，培養(yǎng)成本提高。優(yōu)秀人力資源的匱乏、人力成本提高、訓(xùn)練成本增加、科研經(jīng)費(fèi)增加，這些科研項(xiàng)目不但需要高水平的專門人才，還需要投入大筆資金購(gòu)買高、精、尖儀器。因此，基因選材方法勢(shì)在必行。杰出運(yùn)動(dòng)能力很大程度上受遺傳因素控制已成為不爭(zhēng)的事實(shí)。近年來，隨著分子遺傳學(xué)理論與技術(shù)的進(jìn)展及其對(duì)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的滲透，各國(guó)學(xué)者通過關(guān)聯(lián)與連鎖分析對(duì)杰出運(yùn)動(dòng)能力的分子遺傳學(xué)特征及基因標(biāo)記展開了廣泛的研究，并獲得了某些令人鼓舞的研究結(jié)果和啟迪。人類各種可遺傳變異是十分常見的現(xiàn)象，在DNA水平上的變異更加普遍。這種有差異的基因可以遺傳、表達(dá)，產(chǎn)生不同的基因表型和多態(tài)性，決定人類種族差異和個(gè)體差異。通過這種方式也決定了不同人群運(yùn)動(dòng)能力的差異以及對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的敏感性和適應(yīng)能力。肌肉動(dòng)作學(xué)習(xí)、肌肉力量 訓(xùn)練、有氧運(yùn)動(dòng)能力訓(xùn)練等體能相關(guān)的表型的訓(xùn)練應(yīng)答均具有顯著的遺傳特征。所謂運(yùn)動(dòng)員科學(xué)選材，是根據(jù)不同運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的特點(diǎn)和要求，用科學(xué)的，先進(jìn)的手段和方法，通過客觀指標(biāo)的測(cè)試，全面綜合評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)，把先天條件優(yōu)越，適合從事某項(xiàng)運(yùn)動(dòng)的人選拔出來，從小進(jìn)行系統(tǒng)培養(yǎng)，并且不斷地監(jiān)測(cè)其發(fā)展過程。人體運(yùn)動(dòng)能力的遺傳性已經(jīng)越來越被人們所重視。在體育運(yùn)動(dòng)中，頂尖的運(yùn)動(dòng)員決不是偶然產(chǎn)生的，他們所達(dá)到國(guó)家級(jí)和世界級(jí)的運(yùn)動(dòng)成績(jī)也決不可能僅僅靠后天的努力。運(yùn)用人類單核苷酸多態(tài)性(singlenucIeotidepoIymorphisms, SNPs)進(jìn)行連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析等方法我們可以定位和運(yùn)動(dòng)有關(guān)的功能基因，然后用相同的原理和方法對(duì)候選運(yùn)動(dòng)員基因進(jìn)行篩選，從而可以找到與特定運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目相匹配的“基因型運(yùn)動(dòng)員”，從而能更加科學(xué)而準(zhǔn)確地評(píng)估個(gè)體的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)及運(yùn)動(dòng)潛力。可見，基因選材將成為未來運(yùn)動(dòng)員科學(xué)選材的主要研究?jī)?nèi)容和方向。任何遺傳分析都是以遺傳標(biāo)記為基礎(chǔ)的，遺傳標(biāo)記是一類用來區(qū)分不同個(gè)體或群體，同時(shí)又能穩(wěn)定遺傳的物質(zhì)。SNPs作為第三代遺傳標(biāo)記有著前兩代遺傳標(biāo)記不可替代的優(yōu)點(diǎn)，用于運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)基因的檢測(cè)天才運(yùn)動(dòng)員的基因組型鑒別以及基因在訓(xùn)練環(huán)境中的表達(dá)與變異狀況的研究。在人體科學(xué)專業(yè)中將有廣闊的應(yīng)用前景。依據(jù)SNPs制定個(gè)性訓(xùn)練、營(yíng)養(yǎng)方案及個(gè)性治療方案等SNPs決定了不同的基因型對(duì)不同的訓(xùn)練方案、飲食方案、運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目具有不同的敏感性，所以根據(jù)個(gè)體的具體不同情況，設(shè)計(jì)適合于不同的個(gè)體、不同的運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的訓(xùn)練方案、飲食方案、運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目，達(dá)到“個(gè)性特征”的最優(yōu)發(fā)揮。做到物盡其用，人盡其才。此外，在大眾健身中，運(yùn)動(dòng)處方要因人而異，不同的運(yùn)動(dòng)方式、不同的運(yùn)動(dòng)量已成為目前的研究熱點(diǎn)。不同基因型的個(gè)體對(duì)相同的處方有不同的敏感性。如果SNPs能引入到運(yùn)動(dòng)處方的研究中，也會(huì)為該領(lǐng)域的發(fā)展帶來重大影響和促進(jìn)作用。所以，根據(jù)SNPs可以設(shè)計(jì)專一的運(yùn)動(dòng)損傷治療方案，使療效達(dá)到最佳。隨著SNPs研究的成熟和完善，“專人專項(xiàng)”、“個(gè)性訓(xùn)練方案”、“個(gè)性飲食方案”、“個(gè)性治療方案”等必能應(yīng)運(yùn)而生。雖然有關(guān)SNPs與運(yùn)動(dòng)能力的研究結(jié)果還不多，但SNPs作為第三代遺傳標(biāo)記，有前兩代遺傳標(biāo)記無可取代的優(yōu)點(diǎn)，SNPs與運(yùn)動(dòng)能力表型的關(guān)聯(lián)研究，對(duì)于運(yùn)動(dòng)能力的分子遺傳學(xué)研究將有重要的應(yīng)用價(jià)值。a -輔肌動(dòng)蛋白分布在骨骼肌Z線，是肌動(dòng)蛋白的結(jié)合蛋白，它通過與細(xì)肌絲相結(jié)合維持著肌纖維的有序排列和正常收縮。a-輔肌動(dòng)蛋白家族在人體中以a-輔肌動(dòng)蛋白-2和a-輔肌動(dòng)蛋白-3兩種方式存在。其中，a-輔肌動(dòng)蛋白-2存在于所有肌纖維類型中，而a-輔肌動(dòng)蛋白-3則僅存在于骨骼肌的快肌纖維中。a-輔肌動(dòng)蛋白-3基因(alpha actinin,ACTN3)上的R577X (C1747T)位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)，該位點(diǎn)的C-T突變會(huì)造成577位的氨基酸由精氨酸(577R)變?yōu)榻K止蛋白(577X)，由此造成a -輔肌動(dòng)蛋白-3的缺失。但是，該蛋白的缺失并沒有造成任何表型上的疾病。在關(guān)于ACTN3基因的報(bào)道中，Yang對(duì)澳大利亞優(yōu)秀男女速度力量型運(yùn)動(dòng)員的研究發(fā)現(xiàn)，577R等位基因在速度力量組的頻率顯著高于對(duì)照組，提示ACTN3基因的577R等位基因?qū)τ诹α克刭|(zhì)和速度素質(zhì)來說是優(yōu)勢(shì)等位基因。在眾多對(duì)抗阻訓(xùn)練效果的研究中，也均發(fā)現(xiàn)R等位基因攜帶者的訓(xùn)練敏感性更高。本發(fā)明的目的是用ACTN3的C1747單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)基因預(yù)示和鑒定冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能的分子標(biāo)記方法，對(duì)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能進(jìn)行選擇，不僅為優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能選擇提供了更為有效、簡(jiǎn)便易行的分子標(biāo)記方法，從而可以加速運(yùn)動(dòng)員的科學(xué)選材。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種用ACTN3基因預(yù)示和鑒定冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能的分子標(biāo)記方法分子生物學(xué)技術(shù)，即采用PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)ACTN3基因型，從而預(yù)示和鑒定優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:1、根據(jù)人的ACTN3基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物引物序列為:上引物:5'-CAGCAGCATTCTCCTGTCA-3'；下引物:5'-CCCTTACCTCCACCTTCG-3'。2、利用該引物對(duì)人的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3、PCR產(chǎn)物經(jīng)Dde I 內(nèi)切酶消化后用2%的瓊脂糖凝膠電泳分型，PCR產(chǎn)物經(jīng)DdeI內(nèi)切酶酶切消化后，出現(xiàn)3種類型條帶:有Dde I酶切位點(diǎn)的純合型TT被切為47bp、97bp和206bp3條帶；沒有Dde I酶切位點(diǎn)的純合型CC為144bp和206bp2條帶；雜合型TC為47bp、97bp、144bp 和 206bp4 條帶。4、ACTN3基因C1747T多態(tài)位點(diǎn)的CC基因型可以作為冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能的分子
I■■己 O
具體實(shí)施例方式1、基因組DNA的提取(I)將20iil全血加入裝有700 ill X SET的1.5miil離心管中，輕輕混勻。(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度100-200 y g/和10%的SDS至終濃度
0.5%，55°C消化 12h。(3)待消化完全后，加入等體積的Tris飽和酚，來回顛倒，使其混勻。(4) 12，OOOrpm離心lOmin，用剪去尖端的吸頭將上層水相小心移入另一個(gè)離心管
中，棄去有機(jī)相。重復(fù)第三和第四步驟一次。(5)向水相中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比為24: 23: I)混合IOmin, 12, OOOrpm,離心IOmin,移出水相到另一個(gè)離心管。(6)向水相中加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(23: 1)，來回顛倒混合10minl2，OOOrpm，離心lOmin，移出·水相到另一個(gè)離心管。(7)向水相中加入1/10體積NaAc(3M，pH5.2)和2倍體積的無水乙醇，來回顛倒，
沉淀DNA。(8)將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70%乙醇洗I次。(9)7，500rpm離心5min。小心倒掉管中乙醇，將倒置在濾紙上，讓乙醇流盡，置于
空氣中干燥。(10)加入200 的TE置50°C水浴中過夜溶解DNA。溶解后貯存于_20°C，備用。2、PCR 反應(yīng)PCR 反應(yīng)體系為:0.1-0.g 基因組 DNA，0.2mMdNTP，l.5mM MgC12，lU Taq 聚合酶，5pmol 引物；PCR 反應(yīng)循環(huán)條件:95 °C，4min ；95°C, Imin，54 °C，Imin，72 °C，5min, 32 循環(huán)；72°C，5min。在PE-9700上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，然后用紫外透視儀照相并記錄結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種用ACTN3基因預(yù)測(cè)冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能的分子標(biāo)記方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用工ACTN3基因預(yù)測(cè)冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能的分子標(biāo)記方法，其特征是 (1)根據(jù)人的ACTN3基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物 引物序列為上引物5' -CAGCAGCATTCTCCTGTCA-3'； 下引物5' -CCCTTACCTCCACCTTCG-3'。
(2)利用該引物對(duì)人的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)PCR產(chǎn)物經(jīng)DdeI內(nèi)切酶消化后用2%的瓊脂糖凝膠電泳分型，PCR產(chǎn)物經(jīng)Dde I內(nèi)切酶酶切消化后，出現(xiàn)3種類型條帶有Dde I酶切位點(diǎn)的純合型TT被切為47bp、97bp和206bp3條帶；沒有Dde I酶切位點(diǎn)的純合型CC為144bp和206bp2條帶；雜合型TC為47bp、97bp、144bp 和 206bp4 條帶。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種用ACTN3基因預(yù)示和鑒定冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能的分子標(biāo)記方法。根據(jù)人的ACTN3基因序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)ACTN3基因型，分別對(duì)人ACTN3基因該位點(diǎn)純合型及雜合型進(jìn)行命名。利用本發(fā)明的分子標(biāo)記方法對(duì)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能進(jìn)行選擇，不僅為優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員速度潛能選擇提供了更為有效、簡(jiǎn)便易行的分子標(biāo)記方法，從而可以加速運(yùn)動(dòng)員的科學(xué)選材。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103255212SQ201310108118
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者朱志強(qiáng), 趙玉華, 朱紅, 李向臣, 裴沛, 關(guān)偉軍 申請(qǐng)人:哈爾濱體育學(xué)院