專利名稱：一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Amniotic MesenchymalCells, AM-MSCs)分離方法，具體地說是利用多種酶聯(lián)合消化法獲得純度非常高的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。屬于細(xì)胞生物學(xué)與運(yùn)動(dòng)生理學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)交叉學(xué)科與領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2002年，美國學(xué)者Kaviani A發(fā)現(xiàn)胎盤中含有豐富的繁殖力極強(qiáng)的間充質(zhì)細(xì)胞，提出了胎盤作為胚胎組織工程的細(xì)胞資源的設(shè)想。胎盤組織的特點(diǎn)之一就是它能夠通過主動(dòng)和被動(dòng)免疫機(jī)制來逃避母系的排斥。隨后，許多學(xué)者開始對胎盤干細(xì)胞進(jìn)行深入研究。In’s Anker等用機(jī)械法成功從人羊膜分離到間充質(zhì)干細(xì)胞，他們經(jīng)組織相容性復(fù)合物抗原分型檢測全部為胎兒源性。經(jīng)檢測后鑒定為AM-MSCs。Tamagawa等第一次證實(shí)了羊膜干細(xì)胞可向三胚層分化的多潛能性。又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的AM-MSCs除表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋Nestin外,還表達(dá)干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子八聚體連接蛋白4 (octamer-bindingprotein4, Oct-4),進(jìn)一步證實(shí)羊膜中存在多分化潛能的羊膜干細(xì)胞。人類羊膜的采集多在胎兒出生后，將廢棄的胎盤作為實(shí)驗(yàn)材料，故不涉及倫理方面問題。且取材相對容易。Tamagawa等將人的羊膜上皮和間充質(zhì)細(xì)胞與鼠的胚胎細(xì)胞融合形成體外異基因嵌合體，第一次提出來自羊膜的細(xì)胞具有多分化潛能的假設(shè)。隨后一些研究者，研究并證實(shí)了來自羊膜具有多分化潛能的細(xì)胞是羊膜上皮干細(xì)胞，并研究了其的生物學(xué)特性及其有向三胚層分化的潛能。胰酶和其它消化酶的作用次序不同，有不同的方法從羊膜中分離培養(yǎng)AM-AMSCs。通常AM-AMSCs用L-DMEM，5-10 % FBS, bFGF培養(yǎng)。新分離培養(yǎng)的AM-AMSCs用吉姆薩染色可見細(xì)胞呈 中等大小，中心有一到兩個(gè)核仁，大量胞質(zhì)，通常可見空泡。細(xì)胞呈有絲分裂增殖，具有紡錘樣細(xì)胞形態(tài)。在培養(yǎng)過程中低密度接種也會(huì)使細(xì)胞過早分化衰老。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞除表達(dá)胚胎干細(xì)胞表面抗原:SSEA_3和SSEA-4，腫瘤抗性基因TRA1-60和TRA1-81之外，近來發(fā)現(xiàn)AM-AMSCs還表達(dá)多潛能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，例如Oct-4, Sox-2, Nanog 和 REX-1 等及其它抗原。AM-AMSCs在合適的誘導(dǎo)條件下可以向三胚層誘導(dǎo)分化。有人通過RT-PCR對神經(jīng)組織(外胚層)的特異性基因檢測，發(fā)現(xiàn)AM-AMSCs誘導(dǎo)前后均表達(dá)，但在AM-AMSCs誘導(dǎo)7天后,Nestin表達(dá)量增加,細(xì)胞拉長呈神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài),經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，MAP2 (神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白微管相關(guān)蛋白2)和GFAP (神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸蛋白)陽性表達(dá)。目前此研究已經(jīng)進(jìn)入帕金森疾病及VII型疾病的動(dòng)物模型治療中。與此同時(shí)，用相同的方法也證實(shí)了 AM-AMSCs有向胰臟細(xì)胞、肝臟(內(nèi)胚層)分化潛能，及心肌細(xì)胞(中胚層)的分化潛能。AM-AMSCs在合適的培養(yǎng)條件下高密度和長期培養(yǎng)，呈同心圓向四周放射型生長，與胚胎細(xì)胞相類似。這些細(xì)胞維持了干細(xì)胞的特性，他們不需要其它細(xì)胞提供的營養(yǎng)物質(zhì)支撐，仍然能表達(dá)0ct-4，Nanog，而不表達(dá)端粒酶，呈現(xiàn)正常的核型。移植以后無致瘤性。所有這些與胚胎細(xì)胞相反，胚胎細(xì)胞有很高的端粒酶活性，培養(yǎng)時(shí)非整倍性擴(kuò)增，在小鼠實(shí)驗(yàn)中將其注入形成畸胎瘤。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞簡單易行的取材方法，采取以下技術(shù)方案:1、取材:經(jīng)調(diào)查、跟蹤優(yōu)秀女性冰雪運(yùn)動(dòng)員，(簽署知情同意書經(jīng)其本人允許，所有操作符合倫理道德標(biāo)準(zhǔn))在其分娩后獲得其胎盤羊膜等組織，4°C保存樣本迅速將羊膜剝離，并將羊膜組織放入含有青霉素、鏈霉素、兩性霉素B的PBS中反復(fù)清洗，在清洗的同時(shí)剝離羊膜周圍附帶的血管及其他結(jié)締組織，直到羊膜清洗到透明無其他雜質(zhì)，將羊膜剪成4-5cmX4-5cm的方塊，放入培養(yǎng)皿中平鋪整齊；2、貫序消化:胰蛋白酶消化法，其目的是去除羊膜上的羊膜上皮細(xì)胞避免后續(xù)分離羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞中其在中夾雜影響細(xì)胞純度，第一步:在培養(yǎng)皿中加入3ml0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA放置于37.5°C恒溫?fù)u床震蕩消化5min后棄掉消化液，第二步:繼續(xù)向培養(yǎng)皿中加入3ml的0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液，消化5min后棄掉消化液，第三次向培養(yǎng)皿中加入3ml的0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液消化5min后棄掉消化液并用預(yù)熱后的PBS沖洗幾遍后，觀察發(fā)現(xiàn)羊膜組織已經(jīng)被消化成為膠凍樣物質(zhì)；3、膠原酶聯(lián)合消化:將上述消化后的膠凍樣物質(zhì)小心轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)皿中，用剪刀將其剪成肉糜樣，向培養(yǎng)皿中加入含有DNA消化酶I+IV膠原酶，放置于37.5°C恒溫?fù)u床震蕩消化30min后，用L-DMEM基礎(chǔ) 培養(yǎng)基稀釋消化液，將消化液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，室溫1200rpm，離心lOmin，用含有10% FBS+L-DMEM+10ng/ml bFGF+Iml非必須氨基酸的全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分離后細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示純度達(dá)到95%以上。
具體實(shí)施例方式(一 )實(shí)施例中所 用的主要儀器1、倒置顯微鏡:TH4-200 日本 Olympus2、激光掃描共聚焦顯微鏡:TE-2000-E日本Nikon3、流式細(xì)胞儀:FC-500MPL 美國 Beckman4、CO2 培養(yǎng)箱:BB160UV/BB5060UV 德國 Heraeus5、培養(yǎng)箱/干燥箱:PH030A上海一恒科技有限公司6、超凈工作臺(tái):DL-CJ_2N哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司7、超純水凈化系統(tǒng):美國Pall公司8、電動(dòng)移液器:德國Eppendorff公司9、移液槍:德國Eppendorff公司10、培養(yǎng)板:無錫Nest生物科技有限公司11、0.22 μ m注射器式微孔濾器:美國Pall公司( 二 )實(shí)施例中所用的主要試劑1、L-DMEM 美國 Gibco 公司2、bFGF 美國 Peprotech 公司3、IV膠原酶美國Sigma公司
4、胰蛋白酶美國Sigma公司5、EDTA 美國 Sigma 公司6、兔抗人Vimentin抗體美國Santa Cruz公司7、FITC標(biāo)記的鼠抗兔二抗美國Santa Cruz公司8、胎牛血清美國Gibco公司9、非必須氨基酸(100X)美國Gibco公司(三)鑒定所用抗體1、兔抗人 Vimentin 抗體2、FITC標(biāo)記鼠抗兔二抗(四)羊膜來源:調(diào)查追蹤優(yōu)秀冰雪女性運(yùn)動(dòng)員懷孕分娩后獲得其胎盤、羊膜組織(五)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑配置:1、L-DMEM培養(yǎng)基:超純水溶解一袋L-DMEM干粉，2.3g NaHCO3加水定溶至1L，
0.45 μ m與0.22 μ m濾過除菌后，分裝保存?zhèn)溆谩?br> `
2、bFGF:取一只50mg bFGF加入50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分裝成50管，0.22 μ m微孔濾
膜過濾分裝備用。3,0.1% IV型膠原酶:將IOOmgIV型膠原酶與Ig BSA溶于IOOml無鈣鎂PBS中，
0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌后，-20°C保存?zhèn)溆谩?、培養(yǎng)基:L-DMEM+10% FBS+10ng/ml bFGF+Iml 非必須氨基酸組成，0.22 μ m微孔
濾膜過濾除菌后，4°C保存?zhèn)溆谩?、PBS 緩沖液:8.0g NaCl, 2.9g Na2HPO4.12Η20，0.2g KCl 和 0.2g KH2PO4,力口1000ml超純?nèi)羲芙馔耆?，分裝，高壓滅菌，4°C或常溫保存?zhèn)溆谩?、0.25%胰蛋白酶榮溶液:1.25g胰蛋白酶干粉溶解于PBS中，定容至500ml，pH7.2-7.40.22 μ m微孔濾膜過濾除菌后，4°C保存?zhèn)溆谩?六)流式細(xì)胞術(shù)分析表面抗原表達(dá)情況(間接免疫熒光法)1、將分離培養(yǎng)后的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，IOOOrpm離心，5min ；2、收集取一定量的細(xì)胞懸液(約IX IO6細(xì)胞/ml)，先加入兔抗人Vimentin抗體，室溫放置lh，待反應(yīng)完全后低速離心棄掉懸液，并加入PBS洗滌，低速離心沉淀細(xì)胞，(此步驟制備同時(shí)分一組不加一抗的陰性對照)；3、再加入FITC熒光標(biāo)記的鼠抗兔二抗，生成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，室溫下避光作用Ih ；4、作用完畢后低速離心棄掉上清液，臨上機(jī)檢測前過流式細(xì)胞篩，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞儀上樣管中，開機(jī)檢測,根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算細(xì)胞表達(dá)Vimentin陽性率。5、結(jié)論:通過本發(fā)明方法分離獲得的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞純化率能達(dá)到95%以上，所分離的細(xì)胞適用于后續(xù)的培養(yǎng)工作，用于細(xì)胞生物學(xué)特性及遺傳學(xué)等方面的研究。
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，其特征在于，步驟I中所述的消化的具體方法是:將羊膜平鋪于培養(yǎng)皿中使羊膜上皮層朝向外側(cè)，加入胰蛋白酶消化液3ml, 37.5°C恒溫振蕩貫序消化三次,每次5min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述中的方法，其特征在于，步驟2中所述的消化的具體方法是在消化步驟I剩余的羊膜組織時(shí)采用膠原酶I和DNA消化酶I聯(lián)合消化法，這一步驟加入DNA消化酶I以防 止消化過程中細(xì)胞黏附成團(tuán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了優(yōu)秀冰雪運(yùn)功員羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，包括以下步驟精細(xì)取材去除雜細(xì)胞，沖洗與胰酶膠原酶聯(lián)合貫序消化法。通過本發(fā)明方法制備的優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可為研究優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因、蛋白質(zhì)等提供種子細(xì)胞，不僅在體育運(yùn)動(dòng)生理學(xué)上能提供并豐富理論基礎(chǔ)，同時(shí)在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)治療方面更提供了新的途徑。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK103160463SQ20131011789
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者王飛, 孫玉濱, 王軍, 高玉花, 胡鵬飛, 關(guān)偉軍 申請人:哈爾濱體育學(xué)院