專利名稱：一種優(yōu)秀冰雪運動員血液mRNA反轉(zhuǎn)錄方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及優(yōu)秀冰雪運動員血液mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)，屬于運動生理學(xué)、運動生化學(xué)、分子生物學(xué)交叉學(xué)科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
RNA反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription)是以RNA為模板,通過反轉(zhuǎn)錄酶,合成DNA的過程,是DNA生物合成的一種特殊方式。1970年Temin等在致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的DNA聚合酶，該酶以RNA為核板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序(其中V與A配對)合成DNA。這一過程與一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄，催化此過程的DNA聚合酶叫做反轉(zhuǎn) 錄酶(reverse transcriptase)。后來發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，哺乳動物的胚胎細胞和正在分裂的淋巴細胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3'術(shù)端上，按5' —3'方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA (complementary DNA, cDNA),它與RNA模板形成RNADNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過程。由于目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物易于制備，可將mRNA反向轉(zhuǎn)錄形成DNA用以獲得目的基因。通過RNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得目的基因已成為研究特定基因表達的常用的方法，基因在不同個體不同細胞間及不同生長階段的選擇性表達決定了生命活動的多樣性，如發(fā)育與分化、衰老與死亡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細胞周期調(diào)控等。探求基因表達的差異為我們揭示生命個體某種能力的差異提供依據(jù)。隨著我國體育事業(yè)的快速發(fā)展，優(yōu)秀冰雪運動員的不斷涌現(xiàn)，為運動醫(yī)學(xué)的深入研究帶了契機，如果我國運動科學(xué)工作者充分利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，了解優(yōu)秀冰雪運動員相關(guān)運動基因的結(jié)構(gòu)與功能，探明運動能力表型的基因標記，并定位這些基因，那么對冰雪運動員的運動能力預(yù)測、評定以及科學(xué)選材系統(tǒng)的建立將有十分重要的意義。目前，在基因定位及標記的技術(shù)層面上，多是通過基因多態(tài)分析、微衛(wèi)星DNA等遺傳標記的反向遺傳學(xué)定位克隆策略，先獲得某一表型在染色體上的定位，再在候選區(qū)選擇已知基因，進行相關(guān)基因的篩選，以獲得cDNA及全基因，而mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)則是構(gòu)建cDNA文庫的先行技術(shù)。優(yōu)秀冰雪運動員外周血液樣品易于采集，而且量少，不會對運動員產(chǎn)生損傷，血液mRNA的提取簡易，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA的插入片段范圍大，可用于cDNA文庫構(gòu)建，為優(yōu)秀冰雪運動員運動相關(guān)基因進一步的研究提供豐富的材料。因此，優(yōu)秀冰雪運動員血液mRNA反轉(zhuǎn)錄可為運動相關(guān)基因研究提供技術(shù)基礎(chǔ)，能夠推進運動醫(yī)學(xué)分子領(lǐng)域的研究，進一步揭示優(yōu)秀成績的分子原因，從而推動祖國冰雪運動乃至整個體育事業(yè)的發(fā)展
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供簡易、高效的優(yōu)秀冰雪運動員血液mRNA反轉(zhuǎn)錄方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下實驗方案:本發(fā)明涉及優(yōu)秀冰雪運動員血液mRNA的反轉(zhuǎn)錄，具體步驟為:(I)采集優(yōu)秀冰雪運動員外周血液樣本；(2)改良Trizol法提取血液mRNA。(3)改良磁珠法提純血液mRNA ；(4)血液mRNA反轉(zhuǎn)錄。其中，步驟(1)選取現(xiàn)役冰雪運動員為樣本采集對象；步驟(2)改良Trizol法以氯仿-異戊醇抽提和異丙醇沉淀為特征；步驟(3)改良磁珠法純化mRNA以高鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液漂洗生物素標記的Oligo (dT)探針配合低鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液漂洗生物素標記的Oligo (dT)探·針-磁珠雜交體為特征，其中，高鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液為2X溶液，低鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液為0.1X溶液，使用高鹽3XSSC漂洗生物素標記的Oligo (dT)探針能夠洗去部分非特異性結(jié)合的探針，使用低鹽0.1 X SSC漂洗生物素標記的Oligo (dT)探針-磁珠雜交體能夠增加核酸鏈的嚴緊性，使得RNA/DNA之間的排斥力增加，得到純度更高的mRNA。
具體實施例方式UmRNA 的提取(I)取優(yōu)秀冰雪運動員新鮮血液3ml ；(2)取Rnase 的 2mL離心管，加入9OO μ ITrizoI,加入 3O μ l5mol/L冰醋酸和 0.5ml
新鮮全血，蓋上離心管，震蕩搖勻，室溫靜置5min。(3)加入等體積氯仿-異戊醇(24: I)，上下顛倒混勻10次，室溫靜置3min。4°C 12000r/min 離心 15min ；(4)取上層水相到另一離心管中，加入0.7倍體積異丙醇，混勻后室溫靜置IOmin ；(5) 4°C 12000r/min離心IOmin,去上清,用1111175%乙醇洗漆沉淀一次；(6) 37°C 5 IOmin 晾干乙醇；(7)將RNA溶于50 100 μ I無Rnase的DEPC處理過的水中。；2、磁珠法純化mRNA(I)生物素標記的T重復(fù)寡核苷酸(Oligo dT)探針與mRNA的煺火①在DEPC處理過的1.5ml收集管中，加入0.2_lmg的總RNA和無Rnase的水至終體積為0.5ml。②65O加熱 IOmin.
③加入2 μ I生物素標記的Oligo (dT)探針和12 μ I的3X氯化鈉_檸檬酸鈉鹽溶液(saline sodium citrate, SSC)于RNA中輕輕混勻，室溫放置IOmin0(2)鏈酶抗生物素蛋白-磁珠的沖洗①將鏈酶抗生物素蛋白-磁珠輕晃開后，放入磁性分離架中，使磁珠集中于試管一側(cè)小心去除上清，用1.5ml0.1 X SSC漂洗，用磁性分離架集中磁珠，去除上清，漂洗3次。②將漂洗過的磁珠重新懸浮于0.2ml0.1 X SSC中。
(3)雜交體的生成及漂洗①將生物素標記的Oligo(dT)探針加入含磁珠收集管中輕輕混勻，室溫放置IOmin0每隔2min輕輕混勻一次。②用磁性分離架捕獲磁珠，吸棄上清。③用低鹽0.1 X SSC漂洗磁珠，用磁性分離架集中磁珠，吸棄上清，漂洗4次。(4)洗滌收集 mRNA①將漂洗過的磁珠重新懸浮于0.2mlDEPC水中。②用磁性分離架捕獲磁珠，將洗脫的水相吸至一新管中。重復(fù)洗滌一次，吸取水相，兩次水相合并。③在洗脫液中加入0.1體積的醋酸鈉，I倍體積的異丙醇，_20°C沉淀過夜，12000r/min離心IOmin, 75%乙醇洗沉淀mRNA,干燥,溶解。3、mRNA 反轉(zhuǎn)錄(I)采用禽類白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下:
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供了一種優(yōu)秀冰雪運動員血液mRNA反轉(zhuǎn)錄方法，該方法主要是改良磁珠法純化mRNA，通過以高鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液漂洗生物素標記的Oligo (dT)探針配合低鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液漂洗生物素標記的Oligo (dT)探針-磁珠雜交體為特征。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述方法，采用高鹽3XSSC漂洗生物素標記的Oligo(dT)探針能夠洗去部分非特異性結(jié)合的探針，使用低鹽0.1 X SSC漂洗生物素標記的Oligo (dT)探針-磁珠雜交體能夠增加核酸鏈的嚴緊性。
全文摘要
本發(fā)明涉及優(yōu)秀冰雪運動員血液mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)，屬于運動生理學(xué)、運動生化學(xué)、分子生物學(xué)交叉學(xué)科領(lǐng)域。提供了一種冰雪運動員血液mRNA反轉(zhuǎn)錄改進方法，該方法在血液mRNA提取中加入氯仿-異戊醇抽提方法，并且采用改良磁珠法進行mRNA純化，采用高鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液漂洗生物素標記的Oligo(dT)探針配合低鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液漂洗生物素標記的Oligo(dT)探針-磁珠雜交體，mRNA收集率高，純度高。本發(fā)明較傳統(tǒng)血液mRNA提取、反轉(zhuǎn)錄的方法更為省時、簡易、高效。為運動相關(guān)基因進一步的研究提供了豐富的材料。
文檔編號C12N15/10GK103160498SQ201310117899
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者胡萍, 黃綏平, 王飛, 熊慧, 孫婷婷, 關(guān)偉軍 申請人:哈爾濱體育學(xué)院