專利名稱：植物種胚微創(chuàng)非組培轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因轉(zhuǎn)化方法，具體涉及一種植物種胚微創(chuàng)非組培轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
目前植物基因工程所包含的轉(zhuǎn)化方法很多。如基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、電穿孔法、激光穿孔法等等。這些方法要么需要專門的貴重的儀器設(shè)備，要么轉(zhuǎn)化周期太長，一般在普通實(shí)驗(yàn)室里是不易操作完成的。社會(huì)的進(jìn)步和其它科學(xué)領(lǐng)域的飛速發(fā)展，需要相適應(yīng)的技術(shù)來帶動(dòng)植物基因工程學(xué)科的發(fā)展。各國科學(xué)家通過不懈的努力，僅轉(zhuǎn)化方法本身的技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)令人目不暇接。這其中包括新的轉(zhuǎn)化方法的建立和對傳統(tǒng)方法的改良。孫毅、王景雪、劉少翔申請的中國發(fā)明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化方法，申請?zhí)柎a:CN01104185，授予日期:2004/5/19，該技術(shù)用刀尖進(jìn)行劃胚處理，對胚的微創(chuàng)傷面積太大，出苗率太低。并且種子萌發(fā)時(shí)間過長，對種子在其后的胚創(chuàng)傷處理中影響較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物種胚微創(chuàng)非組培轉(zhuǎn)化方法，它能避免農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等所需的較長時(shí)間的組織培養(yǎng)過程，節(jié)省大量的時(shí)間；且不需要貴重的儀器設(shè)備，普通實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行操作完成。為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方:I)、選擇飽滿、無機(jī)械損傷的子粒若干；2)、將子粒于0.1%氯化汞浸泡2分鐘左右，70%酒精浸泡10分鐘左右滅菌；最后用無菌水或煮沸冷卻以后 的自來水漂洗子粒3-5次以上，以除去子粒表面黏附的滅菌液；3)、將滅菌種子放在一個(gè)預(yù)先滅菌的容器中，加無菌水至淹沒種子為止，燒杯口用透氣的封口紙包裹，于搖床上120轉(zhuǎn)/分28°C培養(yǎng)，讓種子充分吸水膨脹；4)、培養(yǎng)4-12小時(shí)，依據(jù)種子類型而定，停止培養(yǎng)，準(zhǔn)備切胚；5)、將吸水膨脹種子放在一個(gè)干凈的器皿內(nèi)，操作人員事先戴上衛(wèi)生手套，用注射針在種子胚部進(jìn)行穿刺，深度不超多2-4_，依據(jù)種子類型而定，穿刺使胚致傷但又不影響種子的進(jìn)一步萌發(fā)；6)、將傷胚種子進(jìn)行超聲波處理，超聲波的功率依據(jù)種子類型而定。超聲波處理后劃胚的種子置于帶有目的基因的質(zhì)粒菌液中共培養(yǎng)或再次進(jìn)行低功率的超聲波處理，處理后的傷胚種子于搖床上震蕩120轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)1-2天，以種子露白為準(zhǔn)；7)、露白種子先用無菌水或煮沸冷卻以后的自來水漂洗3-5次，然后播種于事先滅菌的并用相關(guān)標(biāo)記抗性基因的適當(dāng)濃度的抗生素溶液澆至飽和的蛭石苗床上，進(jìn)行抗性基因篩選，蛭石呈現(xiàn)干旱狀態(tài)時(shí)，用同樣的抗生素溶液澆灌；記錄播種的種子顆粒數(shù)和出苗情況，出苗初步認(rèn)定為抗生素抗性苗；8)、3葉期，將苗移栽到大田進(jìn)一步生長，記錄移栽苗數(shù)及成活苗數(shù)，正常生產(chǎn)管理，直至收獲種子；
9)、收獲的種子來年播種得到下一代，稱為T1代；10) ,T0和T1植株在5葉期取幼嫩葉片進(jìn)行PCR檢測，并對PCR檢測呈陽性結(jié)果的植株樣品進(jìn)行Southern blot雜交分析,確定是否得到轉(zhuǎn)基因植株；11)、在確定得到轉(zhuǎn)基因植株及種子的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行田間生物學(xué)鑒定和純系選育。所述的步驟5用注射器針頭進(jìn)行處理，可以避免大面積創(chuàng)傷，也可以利用注射器進(jìn)行負(fù)壓處理，增大對胚的微創(chuàng)傷，而不增加面積。所述的步驟6是將帶有目的基因的質(zhì)粒菌在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在菌對數(shù)生長期間停止培養(yǎng)。取少量菌液按梯度稀釋，測OD6tltl值，以O(shè)D6tltl值在0.04——0.08為所需菌液濃度。超聲波功率100-1000W之間進(jìn)行選擇，工作時(shí)間和工作頻率都依據(jù)種子類型而定。本發(fā)明具有以下有益效果:能避免農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等所需的較長時(shí)間的組織培養(yǎng)過程，節(jié)省大量的時(shí)間；且不需要貴重的儀器設(shè)備，普通實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行操作完成。
具體實(shí)施例方式本具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案:I)、選擇飽滿、無機(jī)械損傷的子粒若干；2)、將子粒于0.1%氯化汞浸泡2分鐘左右，70%酒精浸泡10分鐘左右滅菌；最后用無菌水或煮沸冷卻以后的自來水漂洗子粒3-5次以上，以除去子粒表面黏附的滅菌液；3)、將滅菌 種子放在一個(gè)預(yù)先滅菌的容器中，加無菌水至淹沒種子為止，燒杯口用透氣的封口紙包裹，于搖床上120轉(zhuǎn)/分28°C培養(yǎng)，讓種子充分吸水膨脹；4)、培養(yǎng)4-12小時(shí)，依據(jù)種子類型而定，停止培養(yǎng)，準(zhǔn)備切胚；5)、將吸水膨脹種子放在一個(gè)干凈的器皿內(nèi)，操作人員事先戴上衛(wèi)生手套，用注射針在種子胚部進(jìn)行穿刺，深度不超多2-4_，依據(jù)種子類型而定，使胚致傷但又不影響種子的進(jìn)一步萌發(fā)；6)、將傷胚種子進(jìn)行超聲波處理，超聲波的功率依據(jù)種子類型而定。超聲波處理后劃胚的種子置于帶有目的基因的質(zhì)粒菌液中共培養(yǎng)或再次進(jìn)行低功率的超聲波處理，處理后的傷胚種子于搖床上震蕩120轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)1-2天，以種子露白為準(zhǔn)；7)、露白種子先用無菌水或煮沸冷卻以后的自來水漂洗3-5次，然后播種于事先滅菌的并用相關(guān)標(biāo)記抗性基因的適當(dāng)濃度的抗生素溶液澆至飽和的蛭石苗床上，進(jìn)行抗性基因篩選，蛭石呈現(xiàn)干旱狀態(tài)時(shí)，用同樣的抗生素溶液澆灌；記錄播種的種子顆粒數(shù)和出苗情況，出苗初步認(rèn)定為抗生素抗性苗；8)、3葉期，將苗移栽到大田進(jìn)一步生長，記錄移栽苗數(shù)及成活苗數(shù)，正常生產(chǎn)管理，直至收獲種子；9)、收獲的種子來年播種得到下一代，稱為T1代；10) ,T0和T1植株在5葉期取幼嫩葉片進(jìn)行PCR檢測，并對PCR檢測呈陽性結(jié)果的植株樣品進(jìn)行Southern blot雜交分析,確定是否得到轉(zhuǎn)基因植株；11)、在確定得到轉(zhuǎn)基因植株及種子的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行田間生物學(xué)鑒定和純系選育。所述的步驟5用注射器針頭進(jìn)行處理，可以避免大面積創(chuàng)傷，也可以利用注射器進(jìn)行負(fù)壓處理，增大對胚的微創(chuàng)傷，而不增加面積。所述的步驟6是將帶有目的基因的質(zhì)粒菌在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在菌對數(shù)生長期間停止培養(yǎng)。取少量菌液按梯度稀釋，測OD6tltl值，以O(shè)D6tltl值在0.04——0.08為所需菌液濃度。超聲波功率100-1000W之間進(jìn)行選擇，工作時(shí)間和工作頻率都依據(jù)種子類型而定。本具體實(shí)施方式
能避免農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等所需的較長時(shí)間的組織培養(yǎng)過程，節(jié)省大量的時(shí)間；且不需要貴重的儀器設(shè)備，普通 實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行操作完成。
權(quán)利要求
1.植物種胚微創(chuàng)非組培轉(zhuǎn)化方法，其特征在于它的轉(zhuǎn)化方法為: 1)、選擇飽滿、無機(jī)械損傷的子粒若干； 2)、將子粒于0.1 %氯化汞浸泡2分鐘左右，70%酒精浸泡10分鐘左右滅菌；最后用無菌水或煮沸冷卻以后的自來水漂洗子粒3-5次以上，以除去子粒表面黏附的滅菌液； 3)、將滅菌種子放在一個(gè)預(yù)先滅菌的容器中，加無菌水至淹沒種子為止，用透氣的封口紙包裹，于搖床上120轉(zhuǎn)/分28°C培養(yǎng)，讓種子充分吸水膨脹； 4)、培養(yǎng)4-12小時(shí)，依據(jù)種子類型而定，停止培養(yǎng)，準(zhǔn)備切胚； 5)、將吸水膨脹種子放在一個(gè)干凈的器皿內(nèi)，操作人員事先戴上衛(wèi)生手套，用注射針在種子胚部進(jìn)行穿刺，深度不超多2-4_，依據(jù)種子類型而定，穿刺使胚致傷但又不影響種子的進(jìn)一步萌發(fā)； 6)、將傷胚種子進(jìn)行超聲波處理，超聲波的功率依據(jù)種子類型而定。超聲波處理后劃胚的種子置于帶有目的基因的質(zhì)粒菌液中共培養(yǎng)或再次進(jìn)行低功率的超聲波處理，處理后的傷胚種子于搖床上震蕩120轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)1-2天，以種子露白為準(zhǔn)； 7)、露白種子先用無菌水或煮沸冷卻以后的自來水漂洗3-5次，然后播種于事先滅菌的并用相關(guān)標(biāo)記抗性基因的適當(dāng)濃度的抗生素溶液澆至飽和的蛭石苗床上，進(jìn)行抗性基因篩選，蛭石呈現(xiàn)干旱狀 態(tài)時(shí)，用同樣的抗生素溶液澆灌；記錄播種的種子顆粒數(shù)和出苗情況，能夠正常出苗的幼苗初步認(rèn)定為抗生素抗性苗，稱為Ttl代； 8)、3葉期，將幼苗移栽到大田進(jìn)一步生長，記錄移栽苗數(shù)及成活苗數(shù)，按照一般生產(chǎn)條件進(jìn)行管理，直至收獲種子； 9)、收獲的種子來年播種得到下一代，稱為T1代； 10),T0和T1植株在5葉期取幼嫩葉片進(jìn)行PCR檢測，并對PCR檢測呈陽性結(jié)果的植株樣品進(jìn)行Southern blot雜交分析,確定是否得到轉(zhuǎn)基因植株； 11)、在確定得到轉(zhuǎn)基因植株及種子的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行田間生物學(xué)鑒定和純系選育。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物種胚微創(chuàng)非組培轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的步驟5是用注射針在種子胚部進(jìn)行穿刺；步驟6是將帶有目的基因的質(zhì)粒菌在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在菌對數(shù)生長期間停止培養(yǎng)；取少量菌液按梯度稀釋，測0D_值，以0D_值在0.04——0.08為所需菌液濃度。超聲波功率100-1000W之間進(jìn)行選擇，工作時(shí)間和工作頻率都依據(jù)種子類型而定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物種胚微創(chuàng)非組培轉(zhuǎn)化方法，它涉及一種基因轉(zhuǎn)化方法。選擇飽滿、無機(jī)械損傷的子粒若干；將子粒于0.1％氯化汞浸泡2分鐘后，用無菌水或煮沸冷卻以后的自來水漂沖洗子粒3-5次以上；放在一個(gè)預(yù)先滅菌容器中，加無菌水至淹沒種子，在搖床上培養(yǎng)4-6小時(shí)；將吸水膨脹種子放在一個(gè)干凈的容器中，操作人員事先戴上衛(wèi)生手套，用針頭在種子胚部輕輕刺一下將；劃胚的種子進(jìn)行超聲波處理，然后置于帶有目的基因的質(zhì)粒菌液中在搖床上共培養(yǎng)；發(fā)芽和出苗階段用抗生素進(jìn)行幼苗篩選。本方法能避免農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等所需的較長時(shí)間的組織培養(yǎng)過程，節(jié)省大量的時(shí)間；且不需要貴重的儀器設(shè)備，普通實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行操作完成。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103184238SQ20131011750
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月24日
發(fā)明者張麗君, 劉龍龍, 崔林, 喬治軍, 孫毅, 范銀燕, 周建萍, 曹利萍, 師穎 申請人:山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所