專利名稱：一種優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員耐力素質(zhì)的遺傳評估方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從遺傳角度評估優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員耐力素質(zhì)的分子生物學(xué)方法，具體是以優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員線粒體DNAD-loop區(qū)的序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系評估其耐力素質(zhì)。適合于優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員在遺傳上的早期選材，屬于運(yùn)動遺傳學(xué)、生物信息學(xué)與分子生物學(xué)交叉的學(xué)科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著我國越野滑雪運(yùn)動競技水平的提高，越野滑雪運(yùn)動受到越來越多的關(guān)注。為了使我國越野滑雪運(yùn)動的優(yōu)勢能夠持續(xù)發(fā)展，優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員的培養(yǎng)顯得尤其重要。只有把科學(xué)系統(tǒng)的訓(xùn)練與科學(xué)選材緊密地結(jié)合起來，才能達(dá)到目的。競賽后運(yùn)動員的生理指標(biāo)顯示，越野滑雪按其項(xiàng)目的屬性劃分，屬于集耐力、速度、力量為一體的有氧耐力運(yùn)動項(xiàng)目。越野滑雪其比賽距離長，所需時間多，對運(yùn)動員的身體素質(zhì)要求是很高的。如男子項(xiàng)目最長距離為50km，約需滑行2個多小時；女子項(xiàng)目最長距離為30KM，約需滑行1.5小時左右。在這樣長的距離內(nèi)，運(yùn)動員需要克服雪板、雪杖重量的負(fù)擔(dān)；雪板與雪面的摩擦力；身體在滑行中的空氣阻力；快速越過各種上坡地段的難度；在高速下坡滑行中保持身體平衡，克服轉(zhuǎn)彎時的離心力；甚至在平地滑行中的每一滑步、每一次撐杖都要有力量素質(zhì)做保證。越野滑雪是一項(xiàng)周期性運(yùn)動項(xiàng)目，除了要有良好的力量、速度、靈敏、協(xié)調(diào)、柔韌性和專業(yè)技術(shù)外，還必須具備很高有氧耐力和無氧耐力的能力。根據(jù)其項(xiàng)目的特點(diǎn)，應(yīng)為有氧與無氧混合供能的項(xiàng)目，因而越野滑雪需要運(yùn)動員具有良好的耐力素質(zhì)?？梢哉f耐力能力的強(qiáng)弱，是越野滑雪運(yùn)動員取得優(yōu)異成績重要因素之一。國內(nèi)外比賽的經(jīng)驗(yàn)證明:運(yùn)動員只有具備了高水平的力量耐力素質(zhì)，才能在預(yù)定的比賽距離內(nèi)，有效地克服各種阻力因素，充分發(fā)揮技術(shù)水平。從這點(diǎn)上說，高水平的力量耐力素質(zhì)是越野滑雪運(yùn)動員取得優(yōu)異成績的重要先決條件。因此，對越野滑雪運(yùn)動員力量耐力素質(zhì)的進(jìn)行科學(xué)有效的評估顯得尤為重要。越野滑雪運(yùn)動員身體耐力素質(zhì)潛能主要取決于控制各項(xiàng)身體素質(zhì)的基因，選材的核心是從遺傳角度選材。人的耐力素質(zhì)是基于多種基因的表達(dá)調(diào)控和環(huán)境影響的復(fù)雜性狀，從單基因入手進(jìn)行選材考慮的候選基因較多，較為復(fù)雜困難，也存在不夠全面的缺點(diǎn)。因而需要一種行之有效的方法全面綜合的對優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員的耐力素質(zhì)進(jìn)行遺傳評估，從而科學(xué)準(zhǔn)確的對越野滑雪運(yùn)動員進(jìn)行早期遺傳選材。人線粒體DNA (mitochondria, mtDNA)的 D-1oop 區(qū)(control region,或 D-環(huán)，控制區(qū))為高變區(qū)，具有進(jìn)化速度快、母系遺傳等特點(diǎn)，是研究群體遺傳分化的理想材料。目前研究認(rèn)為，mtDNA多態(tài)性可能造成群體中有氧代謝能力的個體差異，是決定有氧能力和訓(xùn)練敏感性的分子機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，最大攝氧量在母子之間存在顯著相關(guān)，家系研究也表明I2max的遺傳因素中30%是由mtDNA遺傳決定的。mtDNA/D-Loop (Mspl，Kpnl, HinfI,HaelII)限制性片段長度多態(tài)性(res triction fragment length polymorphism,RFLPs)在優(yōu)秀耐力運(yùn)動員與常人的分布頻率有顯著性差異，其中，MorphVII, VIII，IX為優(yōu)秀耐力運(yùn)動員所特有。相較于RFLP分析，對mtDNA D-1oop區(qū)進(jìn)行全序列分析獲得的遺傳信息量更大，更加全面而準(zhǔn)確。通過對優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系mtDNA D-1oop區(qū)的全序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)合優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員的耐力及訓(xùn)練相關(guān)數(shù)據(jù)資料，可對其進(jìn)行耐力素質(zhì)的遺傳評估。分析優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系mtDNA D-1oop區(qū)的遺傳多樣性將提供一種優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員耐力素質(zhì)的遺傳評估方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員耐力遺傳素質(zhì)的評估方法。本發(fā)明以優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系為研究對象，提取血基因組DNA，擴(kuò)增mtDNAD-1oop區(qū)全序列并進(jìn)行克隆測序，擴(kuò)增引物序列分別為:F:5， -CCACCATTAGCACCCAAAGCTAAG-3，；R: 5 ’ -AGGCTAAGCGTTTTGAGCTG-3’。利用BioEdit7.1.3.0、Clustal W2和MEGA 5.0軟件應(yīng)用鄰接法和非加權(quán)成組配對法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時利用NETW0RK4.1軟件進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化分析，DnaSP v5和Arlequin3.5軟件分析優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系遺傳多樣性，根據(jù)優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系及運(yùn)動員本人耐力及訓(xùn)練相關(guān)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，評估優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員的耐力遺傳素質(zhì)。
具體實(shí)施例方式
以下以優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系mtDNA D-1oop區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與耐力素質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析為例，詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實(shí)施。實(shí)施例1:優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系mtDNA D-1oop區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與耐力素質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析1、研究對象選擇以優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系為研究對象?！皟?yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系”定義為一級親屬中至少有I人為優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員，對每位優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員進(jìn)行調(diào)查，確定研究對象，根據(jù)每位優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員確定其三代以內(nèi)直系親屬家系成員(包括祖父母、外祖父母、父母、同胞、子女、孫子女及外孫子女，年齡、性別不限)。以年齡18 75歲，與試驗(yàn)組優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員無血緣關(guān)系的健康成年人為參照，進(jìn)行優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員耐力遺傳素質(zhì)的評估。每位受試者均須簽署知情同意書。2> mtDNA D-loop 區(qū)序列測定(I)血樣采集:靜脈采血5mL,EDTA抗凝,經(jīng)3000r/min離心IOmin分離血清后,冰盒冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室，4 °C冷藏保存?zhèn)溆谩?2)基因組DNA提取采用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒(Axygen公司)提取人血樣中基因組DNA,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測基因組DNA的純度和濃度。(3)目的片段擴(kuò)增
根據(jù)GenBank發(fā)表的人線粒體DNA序列(登錄號:NC_012920)，采用PrimerPremier 6.0和01igo6.0軟件設(shè)計(jì)引物,經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Primer-BLAST進(jìn)行引物在線比對。擴(kuò)增目的區(qū)域包含人mtDNA D-1oop區(qū)全序列。擴(kuò)增引物序列分另Ij為 F:5’ -CCACCATTAGCACCCAAAGCTAAG-3’ ；R:5’ -AGGCTAAGCGTTTTGAGCTG-3’。D-Loop 區(qū)的 PCR 擴(kuò)增體系為 50 ii L:2 X Long Taq PCR MasterMix (0.1U/ U LLong Taq Polymerase/U L, 500 U M dNTP each,3mM 1%(:12等)25 ii L ;ddH20，18 ii L ;引物F、R(IOiiM)，各 2iiL ;DNA 模板(50ng/u L), 3 u L0擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，36個循環(huán)；72°C延伸5min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物濃度及純度，4°C保存。(4)目的片段克隆測序PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠回收(Axygen凝膠回收試劑盒)純化后，由pMD19_T載體(Takara公司)連接,轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli DH5 a菌株(天根公司)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌液PCR鑒定后，挑選陽性克隆,送上海Invitrogen公司進(jìn)行序列測定。3、數(shù)據(jù)分析(I)系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建利用BioEdit7.1.3.0 (www.mbi0.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)軟件和Chromas Version L 45 軟件(http://www.technelysium.com.au/chromas.html)對測序獲得的原始序列進(jìn)行拼接和校對；利用Clustal W2軟件(http://www.clustal.0rg)對拼接后序列進(jìn)行多重比對；采用MEGA 5.0軟件(http://www.megasoftware.net/)分析mtDNA序列D-1oop區(qū)的變異位點(diǎn),采用Kimura的雙參數(shù)模型構(gòu)建鄰接樹和非加權(quán)成組配對進(jìn)化樹。(2)單倍型間的網(wǎng)絡(luò)分析利用NETW0RK4.1 軟件(http://www.fluxus-engineering.com)對比對后序列進(jìn)行不同單倍型間的網(wǎng)絡(luò)分析。(3)輔助分析利用DnaSP v5軟件(http://www.ub.edu/dnasp/)分析序列的多態(tài)性，并估計(jì)序列的變異程度、核苷酸替代率等。采用Arlequin3.5軟件(http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin35/)用于變異堿基分布頻率分析和Fu’ s中性檢驗(yàn)。4、耐力素質(zhì)的遺傳評估根據(jù)優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹及網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化樹，結(jié)合優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員的耐力及訓(xùn)練的個人數(shù)據(jù)，取顯著性P < 0.05，遺傳力> 0.3，評估優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員的耐力素質(zhì)。優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員間具有相同或相近體統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，表現(xiàn)為在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為同一個類別或一個大類，且優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員與普通人的聚類關(guān)系較遠(yuǎn)。
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系的耐力素質(zhì)的遺傳評估方法。
2.如權(quán)利要求1所述，評估方法是以優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系為研究對象，通過對mtDNA D-1oop區(qū)多態(tài)性進(jìn)行分析，評估優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員的耐力遺傳素質(zhì)，主要步驟是: (1)選取優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系； (2)擴(kuò)增mtDNAD-1oop區(qū)并進(jìn)行序列測定:擴(kuò)增引物序列分別為F:5’ -CCACCATTAGCACCCAAAGCTAAG-3’ ；R:5’ -AGGCTAAGCGTTTTGAGCTG-3’。
(3)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹及網(wǎng)絡(luò)分析； (4)根據(jù)mtDNAD-1oop區(qū)遺傳多樣性和進(jìn)化分析評估耐力遺傳素質(zhì)，結(jié)合優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員的耐力及訓(xùn)練的個人數(shù)據(jù)，取顯著性P < 0.05，遺傳力> 0.3。優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員間具有相同或相近體統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，表現(xiàn)為在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為同一個類別或一個大類，且優(yōu)秀越野滑雪運(yùn) 動員與普通人的聚類關(guān)系較遠(yuǎn)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員耐力遺傳素質(zhì)的評估方法。本發(fā)明以優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系為研究對象，測定mtDNA D-loop區(qū)全序列，擴(kuò)增引物序列分別為F5’-CCACCATTAGCACCCAAAGCTAAG-3’；R5’-AGGCTAAGCGTTTTGAGCTG-3’，分別應(yīng)用鄰接法和非加權(quán)成組配對法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化分析，獲得優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系遺傳多樣性及進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員家系資料評估優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員的耐力遺傳素質(zhì)。結(jié)合優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員的耐力及訓(xùn)練的個人數(shù)據(jù)，取顯著性P＜0.05，遺傳力＞0.3。優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員間具有相同或相近體統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，表現(xiàn)為在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為同一個類別或一個大類，且優(yōu)秀越野滑雪運(yùn)動員與普通人的聚類關(guān)系較遠(yuǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK103160596SQ20131011591
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者賈春佳, 冉令華, 汪宇峰, 金紅, 王文杰, 關(guān)偉軍 申請人:哈爾濱體育學(xué)院