專利名稱：一種利用mtDNA多態(tài)性預(yù)測優(yōu)秀越野滑雪運動員耐力潛能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)預(yù)測優(yōu)秀越野滑雪運動員耐力潛能的分子生物學(xué)方法，具體是通過分析mtDNA高變區(qū)I的單核苷酸多態(tài)性，得到相關(guān)多肽位點對越野滑雪運動耐力的影響，預(yù)測耐力潛能。適合于優(yōu)秀越野滑雪運動員在基因上的早期選材，屬于體育科學(xué)、遺傳學(xué)、與分子生物學(xué)交叉的學(xué)科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
越野滑雪是目前流行的極限運動項目之一。越野滑雪強調(diào)勇敢跨越心理障礙時所獲得的愉悅感、成就感，也追求競技體育超越生理極限的“更快、更高、更強”。越野滑雪運動作為體能主導(dǎo)類項目，運動員的力量和耐力素質(zhì)對運動成績起著決定性作用。越野滑雪其比賽距離長，所需時間多，對運動員的身體素質(zhì)要求是很高的。如男子項目最長距離為50km，約 需滑行2個多小時；女子項目最長距離為30KM，約需滑行1.5小時左右。在這樣長的距離內(nèi)，運動員需要克服雪板、雪杖重量的負(fù)擔(dān)；雪板與雪面的摩擦力；身體在滑行中的空氣阻力；快速越過各種上坡地段的難度；在高速下坡滑行中保持身體平衡，克服轉(zhuǎn)彎時的離心力；甚至在平地滑行中的每一滑步、每一次撐杖都要有力量素質(zhì)做保證。所以作為越野滑雪運動中最艱苦的運動項目之一，越野滑雪運動員在訓(xùn)練和比賽中，除了要求具有對寒冷和寂寞超常的適應(yīng)性，更要求身體素質(zhì)具有持久的耐力的承受長距離滑行的高強度運動。一個運動員要達(dá)到較高的運動水平，不是幾年的訓(xùn)練就可以實現(xiàn)的，必須有一個長期的科學(xué)的系統(tǒng)的過程。在這個過程中，運動員的科學(xué)選材是所有工作的前提和訓(xùn)練的基礎(chǔ)，是運動員創(chuàng)造世界高水平運動成績的重要因素。實踐證明，只有那些具有天賦的運動員，才能攀上世界頂尖運動水平的高峰。如何根據(jù)越野滑雪運動項目的特點和要求，采用現(xiàn)代的科學(xué)方法和手段，從眾多兒童少年中將天賦條件優(yōu)越且適合從事越野滑雪運動的優(yōu)秀人才選拔出來，一直是廣大體育科學(xué)工作者亟待解決的一個重要課題。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,, SNPs)作為新興的遺傳標(biāo)記，已越來越引起人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，人類基因多態(tài)性在群體遺傳信息上的本質(zhì)表現(xiàn)中90%以SNPs為標(biāo)記。由于線粒體涉及機(jī)體重大代謝過程，其編碼的蛋白直接影響人類生命活動。因此，有關(guān)mtDNA的研究備受關(guān)注。人線粒體DNA(mitochondria,mtDNA)的D-1oop區(qū)(control region，或D-環(huán)，控制區(qū))為高變區(qū)，具有進(jìn)化速度快、母系遺傳等特點，是研究群體遺傳分化的理想材料。目前研究認(rèn)為，mtDNA多態(tài)性可能造成群體中有氧代謝能力的個體差異，是決定有氧能力和訓(xùn)練敏感性的分子機(jī)制之一。研究表明，中國漢族及其耐力運動員在C16223T和37T16362C兩個位點均發(fā)生明顯的同質(zhì)性多態(tài)，其多態(tài)性頻率明顯高于其他位點。對于我國漢族及其耐力運動員mtDNA高變區(qū)I多態(tài)頻率大于10%的SNPs位點與有氧耐力參數(shù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，運動員有3個位點(npl6362，npl6085，npl6297)在劍橋序列組與非劍橋序列組V02max/kg存在差異，其中，位點16297僅男性運動員具有顯著高的V02max/kg值，在位點16362和16085中，女性運動員的具有較高的 V02max/kg 值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種優(yōu)秀越野滑雪運動員耐力素質(zhì)的預(yù)測方法。本發(fā)明利用mtDNA多態(tài)性預(yù)測優(yōu)秀越野滑雪運動員耐力潛能的分子生物學(xué)方法，具體是采用PCR技術(shù)通過擴(kuò)增mtDNA高變區(qū)I的450bp序列并測序，所用引物序列為:上游引物 F:5' -caccattagcacccaaagc-3 ';下游引物 R:5' -gggatattgatttcacggagg-3 ',檢測擴(kuò)增序列單核苷酸多態(tài)性位點，得到相關(guān)多態(tài)位點16362 (T)、16085 (C)、16297 (T)對越野滑雪運動耐力的影響，預(yù)測具有優(yōu)秀越野運動員的耐力潛能。
具體實施例方式以下以具體實施例說明利用mtDNA多態(tài)性預(yù)測優(yōu)秀越野滑雪運動員耐力潛能的方法。實施例1:利用mtDNA高變區(qū)I多態(tài)性預(yù)測優(yōu)秀越野滑雪運動員耐力潛能1、確定研究對象研究對象分2組，優(yōu)秀越野滑雪運動員組和普通人組。普通人組主要選擇與優(yōu)秀越野滑雪運動員年齡相當(dāng)?shù)谋镜貐^(qū)人，嚴(yán)格按照隨機(jī)抽樣的原則進(jìn)行，均無專業(yè)運動訓(xùn)練史。2、mtDNA高變區(qū)I序列的擴(kuò)增分析2.1基因組DNA的提取靜脈采血5mL, EDTA抗凝,經(jīng)3000r/min離心IOmin分離血清后,冰盒冷藏帶回實驗室，4°C冷藏保存?zhèn)溆?。采用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒(Axygen公司)提取人血樣中基因組DNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測基因組DNA的純度和濃度。2.2mtDNA特異性片段擴(kuò)增根據(jù)GenBank發(fā)表的人線粒體DNA序列(登錄號:NC_012920)，高變區(qū)I選擇L鏈中15978-15996之間的序列為上游引物(F), H鏈中16407-16427之間的序列為下游引物(RP)，其引物序列如下:F:5'-caccattagcacccaaagc-3'；R:5' -gggatattgatttcacggagg-3'。PCR 反應(yīng)體系:50 u L:2 X Long Taq PCR MasterMix (0.1U/ U L Long TaqPolymerase/u L, 500 u M dNTP each,3mM 1%(:12等)251^ ；ddH20,18 u L ;引物F、R(10 y M)，各 2 ii L ；DNA 模板(50ng/ uL),3uL0 擴(kuò)增程序為:94°C 預(yù)變性 3min ;95°C 變性 30s，60。。退火30s，72°C延伸30s，36個循環(huán)；72°C延伸5min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物濃度及純度，可見包含高變區(qū)I特異性450bp目的片段，4°C保存。2.3序列測定PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序。測序工作由北京華大中生科技發(fā)展有限公司完成。采用Sanger法，在377型DNA測序儀上進(jìn)行DNA測序反應(yīng)，自動實時檢測并讀出目的序列。
2.4mtDNA高變區(qū)I單核苷酸多態(tài)性分析應(yīng)用DNASTAR分析軟件在進(jìn)行mtDNA高變區(qū)I序列多態(tài)性分析，選取了優(yōu)秀越野滑雪運動員及普通人mtDNA高變區(qū)I SNPs在其群體中分布頻率高于10%的位點進(jìn)行分析，并與GenBank發(fā)表的人線粒體DNA序列(登錄號:NC_012920)對比，確定SNPs位點。檢測16362、16085、16297 位點多態(tài)性。3、多肽位點的檢測與判定結(jié)果對比NC_012920序列的16362、16085、16297位點，經(jīng)上述分析檢測后16362 (T)和16805(C)為高耐力遺傳標(biāo)記(多為女運動員)，16297 (T)為高耐力遺傳標(biāo)記(多為男運動員);16362 (C)、16805 (G)及16297(C)為不具有高耐力素質(zhì)的人所有。
權(quán)利要求
1.一種利用mtDNA多態(tài)性對優(yōu)秀越野滑雪運動員耐力素質(zhì)的預(yù)測方法。
2.如權(quán)利1所述,擴(kuò)增mtDNA高變區(qū)I450bp序列并測序,所用引物序列為:上游引物F:5' -caccattagcacccaaagc-3';下游引物 R:5' -gggatattgatttcacggagg-3'，檢測該序列單核單核苷多態(tài)性位點16362、16805及16297，以多態(tài)位點16362 (T)、16805 (C)及16297 (T)預(yù)測具有優(yōu)秀越野滑雪運動耐力潛能。
全文摘要
本發(fā)提供一種優(yōu)秀越野滑雪運動員耐力素質(zhì)的預(yù)測方法。本發(fā)明利用mtDNA多態(tài)性預(yù)測優(yōu)秀越野滑雪運動員耐力潛能的分子生物學(xué)方法，具體是利用PCR技術(shù)通過擴(kuò)增mtDNA高變區(qū)I450bp序列并測序，所用引物序列為上游引物F5′-caccattagcacccaaagc-3′；下游引物R5′-gggatattgatttcacggagg-3′，檢測擴(kuò)增序列的單核苷酸多態(tài)性位點16362、16805及16297，預(yù)測相關(guān)多態(tài)位點為16362(T)、16805(C)及16297(T)的被選者，具有優(yōu)秀越野滑雪運動耐力潛能。
文檔編號C12Q1/68GK103160598SQ20131011593
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者蒙猛, 李曉東, 張強, 金紅, 崔鵬, 關(guān)偉軍 申請人:哈爾濱體育學(xué)院