一種制備malforminC的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了生物發(fā)酵法制備malforminC的一個菌株和從其代謝產(chǎn)物中分離純化malforminC的方法。該菌株是從2007年6月采自泰國普吉島的土壤中分離獲得，在PDA培養(yǎng)基上菌落呈黑色，被鑒定塔賓曲霉(Aspergillus?tubingensis)，實驗室保藏編號SYP2612，CGMCC編號為XXX。該發(fā)明生產(chǎn)工藝先進，原料成本低，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，而且生產(chǎn)過程中無有害物質的排放，對周圍環(huán)境無污染、無公害、符合環(huán)保要求。
【專利說明】—種制備malformin C的方法
【技術領域】:
[0001]發(fā)明涉及藥品【技術領域】，即利用生物發(fā)酵生產(chǎn)malformin C的方法，即提供了微生物發(fā)酵制備malformin C的一個菌株和用其發(fā)酵液生產(chǎn)malformin C的方法。
技術背景:
[0002]環(huán)肽類化合物malformin C是1968年由Steenbergen S等人從發(fā)霉的大米上找到的一株黑曲霉產(chǎn)生，其發(fā)酵產(chǎn)率極低，只有200ug/ml (Steenbergen, S.,and E.D.Weinberg.Trace metal requirements for malformin biosynthesis.Growth.1968, 32:125-134)。此外,Yasuhiro Kojimal等米固相合成的方法合成malformin C,收率只有15% (YasuhiroKojimal, Toshiaki Sunazukal, Kenichiro Nagail, et al.Solid-phase synthesisand biological activity of malformin C and its derivatives.The Journal ofAntibiotics2009，62:681-686)。Keiichi HAGIMORI 等人在 2007 年闡述了 malformin C的抗癌機制。即malformin C作為一個G2期檢驗點(checkpoint)的抑制劑來達到抗癌的效果(Keiichi HAGIMORI, Takashi FUKUDA，Yoko HASEGAffA, et al.Fungal MalforminsInhibit Bleomycin-1nduced G2 Checkpoint in Jurkat Cells.Biol.Pharm.Bull.2007,30(8):1379-1383)。因此，找到一個收率高、成本低的新方法來積累malformin C對于開發(fā)這類抗腫瘤藥物具有非常重要的作用。

【發(fā)明內容】
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[0003]本發(fā)明提供了一套完整的從生產(chǎn)到分離純化malformin C的方法。選擇菌株SYP2612，采用需氧微生物發(fā)酵法，從其發(fā)酵液中分離純化獲得malformin C。
[0004]該方法包括原始菌種的活化、搖瓶種子培養(yǎng)、微生物發(fā)酵、以及后提取的各種步驟。其生產(chǎn)工藝包括:
[0005]脫脂牛奶凍干管菌種一斜面活化一搖瓶種子一微生物發(fā)酵一終止發(fā)酵，提取純化獲得 malformin C。
[0006]本發(fā)明所述的搖瓶種子培養(yǎng)是指采用菌株生長所需要的碳源、氮源、無機鹽等，經(jīng)過滅菌后，挖取適量菌體斜面，轉移到種子搖瓶中，在自動旋轉搖瓶機上震蕩培養(yǎng)，50-300rpm, 25~30°C，培養(yǎng)24-48小時獲得搖瓶種子。本發(fā)明涉及的菌株SYP2612已提交相關單位保藏，其分類命名及保藏信息如下:
[0007]分類命名:塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)
[0008]保藏單位全稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0009]保藏單位簡稱:中國普通微生物菌種保藏管理中心
[0010]保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所
[0011]保藏日期:2012年12月14日
[0012]保藏編號:CGMCCN0.6992
[0013]本發(fā)明所述的微生物發(fā)酵是指采用菌株生長所需要的碳源、氮源、無機鹽等，經(jīng)過滅菌后，按照一定比例(1-15%)轉入種子液。既可以采用在自動旋轉搖瓶機上震蕩，100-300rpm, 25~30°C培養(yǎng)96~144小時后，停止發(fā)酵；也可以使用發(fā)酵罐進行微生物有氧發(fā)酵，100-400rpm，25~30°C培養(yǎng)96~144小時后，停止發(fā)酵。均可獲得發(fā)酵產(chǎn)物malformin C。
[0014]本發(fā)明所述的微生物發(fā)酵的提取、分離、純化過程如下:將所述的微生物發(fā)酵液用高速離心機或者布氏漏斗減壓抽濾，除去菌絲體，將發(fā)酵上清液用乙酸乙酯或水飽和正丁醇等體積分別連續(xù)萃取三次，合并乙酸乙酯或水飽和正丁醇萃取液上層部分，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至干燥，用甲醇完全溶解后取出，經(jīng)過硅膠柱層析、經(jīng)TLC獲得目標餾分后，進一步采用HPLC法制備malformin C。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]附圖1:菌株SYP2612菌落形態(tài)
[0016]附圖2:菌株SYP2612孢子囊和孢子形態(tài)
[0017]附圖3:菌株SYP2612依據(jù)ITS-5.8S rDNA序列的系統(tǒng)進化樹
[0018]附圖4:菌株SYP2612代謝產(chǎn)物的分離純化流程
[0019]附圖5:malfominC 的 ES1-MS 圖譜
[0020]附圖6: C5的HPLC檢測圖譜
[0021]附圖7:malfominC 的 13C-NMR 圖譜
[0022]附圖8:malformin C 的 1H-NMR 圖譜
[0023]附圖9:malformin C 的 HSQC-NMR 圖譜
[0024]附圖10:malformin C 的 HMBC-NMR 圖譜
【具體實施方式】
[0025]下面結合優(yōu)選實施例對本發(fā)明做進一步敘述，但保護范圍不受所述實施例的限制。 [0026]實施例1:本發(fā)明所述真菌SYP2612在不同培養(yǎng)基上的特征。
[0027]
【權利要求】
1.一種制備malforminC的方法,其特征在于:選取代謝產(chǎn)物中含有malforminC的活性菌株，采用需氧微生物發(fā)酵方法，分離提取并純化malforminC的過程。
2.根據(jù)權力要求I所述的一種制備malforminC的方法,其特征在于:選取的具有產(chǎn)生malformin C的活性菌株為塔賓曲霉。
3.根據(jù)權力要求I所述的一種制備malforminC的方法,其特征在于:采用需氧微生物發(fā)酵制備malformin C的步驟為:原始菌種的活化、搖瓶種子的制備、微生物發(fā)酵、發(fā)酵液的后處理；步驟如下: (1)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基和微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)采用常用的碳源和氮源，其中碳源可為葡萄糖、糊精、蔗糖、淀粉、麥芽糖、糖蜜等，氮源可為玉米漿、蛋白胨、熱/冷軋花生餅粉、酵母粉、黃豆餅粉，棉籽餅粉，硫酸銨，尿素，等，此外還需要添加一定比例的無機鹽，如 NH4Cl' KH2PO4' MgSO4.7H20、ZnSO4, (NH4) 2S04，等。 (2)微生物發(fā)酵工藝:通過搖瓶或發(fā)酵罐二級發(fā)酵可獲得malforminC，培養(yǎng)方法包括:搖瓶種子的制備:滅菌前培養(yǎng)基保持自然PH，滅菌后挖塊接種生產(chǎn)菌株斜面菌苔后，于自動旋轉搖瓶機上，轉數(shù)100~400rpm，溫度為25~30°C，培養(yǎng)時間為24~48小時。搖瓶微生物發(fā)酵:培養(yǎng)基PH自然，滅菌后按照I~10%的接種量轉種，于自動旋轉搖瓶機上，轉數(shù)100~300轉/分鐘，溫度為25~30°C，培養(yǎng)時間96~144小時。發(fā)酵罐微生物發(fā)酵:培養(yǎng)基PH自然，滅菌后按照1-15%的接種量轉種，于發(fā)酵罐中發(fā)酵，轉數(shù)100-400rpm，通氣比0.3~1.5vvm，溫度為25~30°C，培養(yǎng)時間96~144小時。
4.根據(jù)權力要求I所述的一種制備malforminC的方法,其特征在于:將所述的微生物發(fā)酵液用布氏漏斗減壓抽濾除去菌絲體，將上清用乙酸乙酯或水飽和正丁醇等體積萃取三次，合并乙酸乙酯或水飽和正丁醇萃取液上層部分，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，用色譜甲醇完全溶解后取出，采用硅膠拌樣進行硅膠(200-300目)柱層析，采用氯仿-甲醇梯度洗脫，根據(jù)TLC檢測分析,合并極性相近部分,得到極性較小的Section E部分。再將Section E部分進行制備液相作進一步純化，制備液相的流動相為:甲醇:水=90: 10;檢測波長為203nm,獲得單體化合物,經(jīng)過結構解析,鑒定為malformin C,其化學結構式如下:
【文檔編號】C12P21/04GK103966289SQ201310046244
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月1日 優(yōu)先權日:2013年2月1日
【發(fā)明者】張怡軒, 吳春福, 周驊 申請人:沈陽藥科大學, 北京慧寶康源醫(yī)學研究有限責任公司