包含配體的vlp及其相關(guān)方法
【專(zhuān)利摘要】本公開(kāi)內(nèi)容涉及增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物和方法。在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及在外部包含TLR5激動(dòng)劑、無(wú)抗原的病毒樣載體。
【專(zhuān)利說(shuō)明】包含配體的VLP及其相關(guān)方法
[0001]關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明
[0002]本發(fā)明根據(jù)美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)提供的基金A1068003和UL1RR025008 ;和美國(guó)國(guó)家過(guò)敏癥和傳染病學(xué)會(huì)(National Instituteof Allergy and Infectious Diseases)提供的基金 1R43A1091230、1R01A1068003 和1R01A1087798，在政府的支持下進(jìn)行。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0003]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0004]本申請(qǐng)要求2011年8月I日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/513，695、2011年8月I日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/513，905、和2011年8月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/527,636的優(yōu)先權(quán)，所有這些申請(qǐng)通過(guò)引用全文并入本文。
[0005]背景
[0006]病毒樣顆粒(VLP)疫苗是遺傳改造的顆粒病毒樣結(jié)構(gòu)的多拷貝蛋白抗原的復(fù)合體。以VLP或重組疫苗呈現(xiàn)的病毒蛋白是免疫原性的。產(chǎn)生VLP的方法在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)2006/02167702中提供。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)2006/0088909、2010/0047277、2010/0196419、2010/0 330190、2011/0097358、2012/0052082、和美國(guó)專(zhuān)利 7，763，450。
[0007]流感是人類(lèi)最重要的病毒性疾病之一，具有顯著的醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。接種疫苗是預(yù)防流感感染的有效方法?？色@得的季節(jié)性流感疫苗是三價(jià)滅活的(殺死的)病毒疫苗(TIV)或活的、減毒的、三價(jià)流感病毒疫苗(LAIV)。這些疫苗被靶向以主要針對(duì)與用于接種的病毒同源的毒株的病毒包膜蛋白HA以及NA誘導(dǎo)中和抗體。然而，流感病毒隨著時(shí)間經(jīng)歷其表面蛋白的變化，稱(chēng)為抗原漂移，允許它們躲避宿主免疫系統(tǒng)和減少對(duì)先前感染的免疫效力。由于與疫苗毒株的抗原錯(cuò)配，這種漂移的毒株可危害疫苗引起的免疫，且所得的血清保護(hù)比可根據(jù)疫苗毒株與循環(huán)毒株之間的抗原距離而改變。此外，漂移的毒株的意外出現(xiàn)(由HA亞型和較不頻繁地NA亞型被新的亞型代替造成)可導(dǎo)致流感流行?，F(xiàn)有疫苗的主要缺陷包括需要每個(gè)季節(jié)產(chǎn)生新的疫苗、選擇正確毒株的不確定性、長(zhǎng)的生產(chǎn)時(shí)間、以及疫苗通過(guò)需要含胚卵的緩慢過(guò)程制備的事實(shí)。而且，現(xiàn)有的疫苗不針對(duì)未來(lái)的流感流行進(jìn)行保護(hù)。因此，不僅對(duì)于季節(jié)性流感，而且對(duì)于可能的新的流感流行毒株都需要改進(jìn)的疫苗。
[0008]因?yàn)楝F(xiàn)有疫苗的這些缺陷，基于相對(duì)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域的通用疫苗將是有希望的方法。前提是抗體對(duì)傳染性病毒顆粒、完整的受感染細(xì)胞、或二者上這些結(jié)構(gòu)域的可及性。甲型流感病毒的M2蛋白是四聚III型膜蛋白，展現(xiàn)pH依賴性質(zhì)子運(yùn)輸活性。它以高密度在受感染細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)，且其保守的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(M2e)是M2e特異性抗體可及的。然而，因?yàn)閮HM2的數(shù)個(gè)拷貝被摻入流感病毒的包膜中，且小的M2e被大的表面HA和NA隔離不與免疫效應(yīng)細(xì)胞有效相互作用，M2e是免疫原性差的，盡管其是高度保守的。研究已經(jīng)顯示，盡管M2e特異性抗體不能阻止感染，它們限制隨后的病毒復(fù)制并減少生病和死亡。參見(jiàn)Treanor 等人，J Virol, 1990，64(3): 1375-7。
[0009]細(xì)菌鞭毛抗原鞭毛蛋白是Toll樣受體(TLR)5的天然配體。而且，其可被胞內(nèi)受體Ipaf識(shí)別。當(dāng)與抗原一起以物理相關(guān)形式或在混合物中共施用時(shí)，其可用作佐劑。作為蛋白佐劑，鞭毛蛋白可被遺傳修飾以產(chǎn)生不同的疫苗制劑。已經(jīng)知道，在沙門(mén)氏菌的大多數(shù)分離株中，兩種基因編碼鞭毛抗原。FliC編碼I相鞭毛蛋白FliC，且fljB編碼II相鞭毛蛋白FljB。這些基因通過(guò)相變化(phase-variation)機(jī)制協(xié)同表達(dá)。FliC和FljB 二者共有形成鞭毛細(xì)絲骨架的保守的N和C末端，并包含被細(xì)胞表面TLR5和胞質(zhì)Ipaf識(shí)別的基序。
[0010] 鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella Typhimurium) I相鞭毛蛋白(FliC)的膜錨定形式可被共摻入到流感VLP中作為佐劑分子。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)2010/0330190和Wang等人，J Virol, 2008, 82 (23): 11813-23。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FliC的可變中心區(qū)對(duì)其TLR5結(jié)合活性是不必要的。參見(jiàn) Smith 等人，Nat Immunol, 2003，4(12): 1247-53。Huleatt 等人，Vaccine2008; 26 (2):201-14公開(kāi)了包含連接流感M2e與II相鞭毛蛋白(FljB)的重組融合蛋白的通用候選流感疫苗。W0/2009/079564公開(kāi)了病毒樣顆粒和構(gòu)造為具有M2e的重復(fù)的膜錨定的鞭毛蛋白。Wang等人，PLoS One.，2010,5(11):el3972公開(kāi)了用摻有膜錨定的鞭毛蛋白的流感VLP鼻內(nèi)免疫引起強(qiáng)的異亞型的保護(hù)。
[0011]呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界嬰兒和兒童下呼吸道生病的主要原因。RSV具有編碼11個(gè)蛋白的10個(gè)基因。RSV融合(F)和附著糖蛋白(G)包含中和抗體表位和數(shù)個(gè)T細(xì)胞表位。參見(jiàn) 01 son&Varga, Expert Rev Vaccines, 2008; 7:1239 - 55,Moore 等人，J Virol2009;83:4185 - 94，和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)2011/0097358。
[0012]本文引用的參考文獻(xiàn)不是對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。
[0013]概述
[0014]本公開(kāi)內(nèi)容涉及增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物和方法。在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及在外部包含TLR5激動(dòng)劑、無(wú)抗原的病毒樣載體。在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及接種受治療者的方法，包括在使得足以在健康人類(lèi)受治療者、50、60或65歲以上的受治療者、或4、8或12歲以下的受治療者中阻止最近的未來(lái)感染的量產(chǎn)生抗體和/或記憶性B細(xì)胞或T細(xì)胞的條件下，聯(lián)合包含TLR5激動(dòng)劑的病毒樣載體施用抗原，其中所述病毒樣載體不包含所述抗原。在某些實(shí)施方案中，抗原是病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng)衍生的分子。
[0015]在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及針對(duì)病毒免疫受治療者的方法，包括聯(lián)合包含TLR5激動(dòng)劑的病毒樣載體向受治療者施用抗原。在某些實(shí)施方案中，TLR5激動(dòng)劑是以膜錨定形式的鞭毛蛋白，例如，是FliC或缺失可變區(qū)的FliC。在某些實(shí)施方案中，抗原不是病毒樣載體的部分，而是聯(lián)合病毒樣載體被施用。在某些實(shí)施方案中，抗原是具有由連接基團(tuán)連接的重復(fù)單元的分子。在某些實(shí)施方案中，抗原包含流感蛋白，諸如M2e或M2e的重復(fù)序列，例如，重復(fù)2、3、4、5或6次或更多次的M2e序列。通常，M2e半胱氨酸氨基酸，即，蛋白的半胱氨酸氨基酸，被絲氨酸或丙氨酸氨基酸代替。
[0016]在某些實(shí)施方案中，抗原是包含SEQ ID NO:1的M2e多肽或其片段。在某些實(shí)施方案中，片段是SEQ ID N0:1中的四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，抗原包括M2e多肽SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD(SEQ IDNO:29)、 SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSS(SEQ ID NO:30)、 SLLTEVETPIRNEffGSRSNDS(SEQID NO:31), SLLTEVETPIRNEffGSRSND(SEQ ID NO:32), SLLTEVETPIRNEffGSRSN (SEQID NO:33), SLLTEVETPIRNEffGSRS(SEQ ID NO:34), SLLTEVETPIRNEffGSR (SEQ IDNO:35), SLLTEVETPIRNEffGS (SEQ ID NO:36), SLLTEVETPIRNEffG (SEQ ID N0:37)、SLLTEVETPIRNEff (SEQ ID NO:38)、SLLTEVETPIRNE(SEQ ID NO:39)、SLLTEVETPIRN(SEQ IDNO:40)、SLLTEVETPIR(SEQ ID NO:41)、SLLTEVETPI (SEQ ID NO: 42)、SLLTEVETP (SEQ IDNO:43), SLLTEVET(SEQ ID NO:44), SLLTEVE(SEQ ID NO:45)、SLLTEV(SEQ ID NO:46)、SLLTE (SEQ ID NO: 47)、SLLT (SEQ ID NO: 48)、LLTE (SEQ ID NO: 49)、LLTEV (SEQ IDNO: 50)、LLTEVE (SEQ ID NO: 51)、LLTEVET (SEQ ID NO: 52)、LLTEVETP (SEQ ID NO:53),LLTEVETPI (SEQ ID NO: 54)、LLTEVETP IR (SEQ ID NO:55), LLTEVETP I RN (SEQ ID NO: 56)、LTEV(SEQ ID NO:57)、LTEVE(SEQ ID NO:58)、LTEVET(SEQ ID NO:59)、LTEVETP(SEQ IDNO:60), LTEVETPI (SEQ ID NO: 61)、LTEVETPIR(SEQ ID NO: 62)、LTEVETPIRN(SEQ IDNO:63)、TEVE(SEQ ID NO:64)、TEVET(SEQ ID NO:65)、TEVETP(SEQ ID NO:66)、TEVETPI (SEQID NO:67), TEVETPIR(SEQ ID NO: 68)、TEVETPI RN (SEQ ID NO: 69)、EVET (SEQ ID NO: 70)、EVETP(SEQ ID NO:71)、EVETPI(SEQ ID NO:72)、EVETPIR(SEQ ID NO:73),EVETPIRN(SEQ IDNO:74)、VETPI(SEQ ID NO:75)、VETPIR(SEQ ID NO:76)、VETPIRN(SEQ ID NO:77),ETPI(SEQID NO:78)、ETPIR(SEQ ID NO:79)、ETPIRN(SEQ ID NO:80)或 TPIRN(SEQ ID NO:81)。
[0017]在某些實(shí)施方案中，抗原是活的減毒的病毒或殺死的病毒，即滅活疫苗。在某些實(shí)施方案中，鞭毛蛋白是FliC或其中不存在可變區(qū)的FliC且病毒樣載體不包含抗原，即基本上由作為佐劑的鞭毛蛋白組成的病毒樣載體。在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及包含本文公開(kāi)的鞭毛蛋白序列的病毒樣載體。在某些實(shí)施方案中，鼻內(nèi)或肌內(nèi)施用抗原和病毒樣載體。
[0018]在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及用于本文公開(kāi)的用途的藥物組合物，所述藥物組合物包含在外部包含鞭毛蛋白、無(wú)抗原的病毒樣載體。在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及本文公開(kāi)的病毒樣載體在制備用于治療或預(yù)防病毒感染的藥物中的用途。
[0019]在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及包含抗原和/或包含鞭毛蛋白的病毒樣載體的免疫原性組合物，其中病毒樣載體包含TLR5激動(dòng)劑，其中病毒樣載體不包含抗原。抗原可以是病毒蛋白，諸如M2e，其中M2e半胱氨酸氨基酸被絲氨酸氨基酸代替?？乖怯蛇B接基團(tuán)連接的重復(fù)多肽序列。TLR5激動(dòng)劑可以是鞭毛蛋白，或鞭毛蛋白是FliC或其中不存在可變區(qū)的FliC，例如，本文公開(kāi)的多肽，諸如SEQ ID N0:28的多肽。
[0020]在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及包含表面具有流感病毒基質(zhì)蛋白和RSV蛋白或糖蛋白的病毒樣載體的免疫原性組合物。在某些實(shí)施方案中，流感病毒基質(zhì)蛋白是Ml。在某些實(shí)施方案中，RSV蛋白是F蛋白或G蛋白。在某些實(shí)施方案中，免疫原性組合物還包括包含TLR5激動(dòng)劑的病毒樣載體，例如鞭毛蛋白。在某些實(shí)施方案中，鞭毛蛋白是FliC或其中不存在可變區(qū)的FliC。在某些實(shí)施方案中,病毒樣載體在同一病毒樣載體中包括鞭毛蛋白和RSV蛋白或糖蛋白。在某些實(shí)施方案中，病毒樣載體包括鞭毛蛋白且不包含RSV蛋白或糖蛋白。在某些實(shí)施方案中，病毒樣載體是病毒樣顆粒。
[0021] 在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及接種受治療者的方法，包括聯(lián)合包含TLR5激動(dòng)劑的病毒樣載體施用表面具有流感病毒基質(zhì)蛋白和RSV蛋白的病毒樣載體。通常，流感病毒基質(zhì)蛋白是Ml且RSV蛋白是F蛋白或G蛋白。通常，TLR5激動(dòng)劑是鞭毛蛋白，例如，F(xiàn)liC或其中不存在可變區(qū)的FliC。在某些實(shí)施方案中，包含鞭毛蛋白的病毒樣載體和RSV蛋白或糖蛋白在同一病毒樣載體中。在某些實(shí)施方案中，包含鞭毛蛋白的病毒樣載體不包含RSV蛋白或糖蛋白。通常，病毒樣載體是病毒樣顆粒。[0022]在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及包含表面具有流感病毒基質(zhì)蛋白和RSV蛋白，任選地包含鞭毛蛋白，而不存在F蛋白或糖蛋白的病毒樣載體的免疫原性組合物，其中流感病毒基質(zhì)蛋白是Ml且RSV蛋白是G蛋白或糖蛋白。
[0023]通過(guò)用編碼RSV-G和Ml，任選地包含編碼鞭毛蛋白的基因，而非RSV-F基因的重組病毒，例如rBV感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，例如Sf9或Sf21細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生的RSV-G病毒樣顆粒。
[0024]在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及接種受治療者的方法，包括施用本文公開(kāi)的免疫原性組合物。在某些實(shí)施方案中，受治療者是人類(lèi)。
[0025]在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及編碼本文公開(kāi)的多肽的核酸序列。
[0026]附圖簡(jiǎn)述
[0027]圖1顯示氨基酸序列和構(gòu)建體的示意圖。顯示的M2e序列是人類(lèi)甲型流感病毒M2e的共有序列。在位點(diǎn)17和19的半胱氨酸被絲氨酸氨基酸取代。在4.M2e中，四個(gè)重復(fù)性M2e區(qū)域(加下劃線的序列)串聯(lián)定位。斜體的序列是柔性接頭。在4.M2e-tFliC融合蛋白中，F(xiàn)liC的中央免疫原性區(qū)域(結(jié)構(gòu)域3，D3，Aal77-401)被4.M2e序列代替。在膜錨定的 4.M2e-tFliC 中，蜂毒肽(mellitin)信號(hào)肽(SP)與 4.M2e_tFliC 的 N 末端(FliC 中N末端結(jié)構(gòu)域I和2，NDl-2)融合以使得其胞外域能夠到達(dá)細(xì)胞外途徑，且在成熟蛋白中被昆蟲(chóng)細(xì)胞信號(hào)肽酶去除。A/PR8HA的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(TM/CT)附著到4.M2e_tFliC融合蛋白的C末端(FliC中C末端結(jié)構(gòu)域2和I，⑶2-1)。
[0028]圖2顯示對(duì)融合蛋白和M2e VLP表征的數(shù)據(jù)。A.Ml衍生的VLP的簡(jiǎn)圖。4M2e_tFliC融合蛋白的膜錨定形式插 入包膜的雙層脂質(zhì)中VLP的EM ;C、D和E.VLP的表征。將VLP樣品施加到SDS-PAGE，隨后為蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1，4.M2e_tFliC/MlVLP ;泳道2，F(xiàn)liC/MlVLP ;泳道3，MlVLP。蛋白條帶通過(guò)以下檢測(cè):C，抗FliC抗體;D，抗M2e(14C2)抗體；E,抗Ml抗體；F.融合蛋白或VLP中鞭毛蛋白的TLR5激動(dòng)劑活性。表達(dá)TLR-2和-4而未表達(dá)TLR-5的小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7用于確定M2e-鞭毛蛋白融合蛋白或包含鞭毛蛋白的VLP的生物活性。表達(dá)TLR-5的RAW264.7細(xì)胞通過(guò)用表達(dá)人類(lèi)TLR-5的載體pUN0_hTLR5轉(zhuǎn)染來(lái)制備。數(shù)據(jù)代表三次重復(fù)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0029]圖3顯示血清IgG端點(diǎn)滴度㈧和M2特異性IgG結(jié)合⑶的數(shù)據(jù)。A.為了確定血清IgG滴度，用100 μ I/孔的合成的M2e肽(5 μ g/ml)包被ELISA檢驗(yàn)板。最后一次免疫后4周的免疫血清以2X步幅(step)稀釋?zhuān)?00 μ I稀釋的樣品施加到板用于抗體結(jié)合。結(jié)合的抗體通過(guò)結(jié)合HRP-山羊抗小鼠IgG抗體來(lái)檢測(cè)并用TMB底物來(lái)顯色。展示高于陰性對(duì)照(未處理組)的0D450 2X的0D450的最高稀釋被標(biāo)為端點(diǎn)滴度。代表性數(shù)據(jù)是最后一次免疫后4周每組中六只小鼠的M2e特異性IgG滴度的幾何平均值(GM) ±95%置信區(qū)間(Cl)。B.利用細(xì)胞表面ELISA確定識(shí)別天然M2蛋白的血清IgG。用A/PR8病毒以MOIl感染MDCK細(xì)胞。未感染的細(xì)胞用作對(duì)照。感染后12h，用PBS洗滌細(xì)胞并用10%甲醛固定。施加稀釋的樣品以檢測(cè)抗體結(jié)合。數(shù)據(jù)描述感染的細(xì)胞的0D450(平均值+SD)減去未感染的細(xì)胞的背景。組I至4代表分別用4.M2e、4.M2e_tFliC、4.M2e_tFliC/Ml VLP,和 4.M2e 加 FliC/MlVLP 免疫的小鼠組。Ρ〈0.05 O，Ρ〈0.01 O，Ρ〈0.001 (***)。
[0030]圖4顯示免疫的小鼠肺灌洗液中分泌型IgA(A)和IgG⑶端點(diǎn)滴度的數(shù)據(jù)。最后一次免疫后四周，收集肺并用每個(gè)肺Iml含0.05%Tween 20的PBS灌洗兩次。A.slgA端點(diǎn)滴度如圖3A中對(duì)血清IgG端點(diǎn)滴度描述的確定，但使用的二抗是HRP共軛的山羊抗小鼠IgA抗體。B.1gG滴度如對(duì)血清IgG滴度描述的確定。代表性數(shù)據(jù)是每組中六只小鼠的GM±95%CI。
[0031]圖5顯示A/Philippines (H3N2)活病毒攻擊的數(shù)據(jù)。最后一次免疫后4周，用5XLD5tl的小鼠適應(yīng)的A/PhiIippines病毒(250pfu) 1.η.感染每組的6只小鼠。持續(xù)15天監(jiān)測(cè)和記錄小鼠存活(A)和體重變化(B)來(lái)指示疫苗的保護(hù)效力。在B中，數(shù)據(jù)代表每組中6只小鼠體重變化(攻擊前的百分比)的平均值。
[0032]圖6顯示A/PR8(H1N1)病毒攻擊的數(shù)據(jù)。最后一次免疫后4周，用5XLD50的小鼠適應(yīng)的A/PR8(125pfu)1.n.感染小鼠。如圖5所述地監(jiān)測(cè)和記錄小鼠存活(A)和體重變化⑶。
[0033]圖7顯示攻擊后第4天肺病毒載量的數(shù)據(jù)。最后一次免疫后4周，用5LD50的小鼠適應(yīng)的PR8 (HlNl)或Philippines (H3N2)病毒1.η.感染每組的3只小鼠。攻擊后第4天收集小鼠肺。研磨每個(gè)肺并在Iml DMEM中澄清。肺提取物的病毒滴度利用標(biāo)準(zhǔn)空斑測(cè)定以MDCK細(xì)胞 滴定。肺病毒滴度表示為pfu/肺。數(shù)據(jù)描述每組3只小鼠的幾何平均值±95%CI。組 I 至 4 代表分別用 4.M2e、4.M2e_tFliC、4.M2e_tFliC/MlVLP、和 4.M2e 加 FliC/Ml VLP 1.m.或1.n.免疫的小鼠組。
[0034]圖8顯示對(duì)pFastBac載體的病毒樣顆粒(VLP)-構(gòu)建體的表征的數(shù)據(jù)。呼吸道合胞病毒(RSV)融合F基因(A)、附著糖蛋白G基因⑶和流感Ml基因(C)在pFastBac載體中。通過(guò)PCR或RT-PCR擴(kuò)增基因。載體中F、G和Ml的大小通過(guò)用EcoRI和XhoI切割來(lái)證實(shí)，且核苷酸序列通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)證實(shí)。包含Ml和RSV F (D)或RSV G (E)的VLP通過(guò)蔗糖梯度超速離心從SF9細(xì)胞培養(yǎng)物上清液純化,并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡顯現(xiàn)。如所示地每泳道上樣 20yg、5yg 和 Iyg VLP (D、E)。
[0035]圖9顯示在負(fù)染EM(H-7500，Hitachi)后顯現(xiàn)的包含Ml和呼吸道合胞病毒(RSV)F(A)或RSV G(C)的病毒樣顆粒(VLP)和確定的其尺寸分布(B、D)。來(lái)自170個(gè)顆粒的五十五(55%)的RSV F VLP分布在60nm和IOOnm之間⑶，且來(lái)自161個(gè)顆粒的66%的RSV-G VLP分布在尺寸40nm和IOOnm之間⑶。
[0036]圖10顯示實(shí)驗(yàn)安排和對(duì)RSV-F或RSV-G病毒樣顆粒(VLP)的呼吸道合胞病毒(RSV)-A2特異性抗體響應(yīng)。A，如所示地以4周間隔肌內(nèi)免疫小鼠組兩次。加強(qiáng)免疫后4周，用RSV-A2病毒感染攻擊小鼠，并在攻擊后第4天時(shí)收集小鼠肺以確定肺病毒載量。用完整RSV病毒包被酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)板。在初免和加強(qiáng)后使用連續(xù)稀釋的血清。確定來(lái)自RSV-FVLP免疫的小鼠的對(duì)RSV-F VLP的總免疫球蛋白(Ig)G(B)、同種型IgG2a(C)、IgGl (D)響應(yīng)、和 IgG2a 與 IgGl 的比(E)，和對(duì) RSV-G VLP 的總 IgG(F)、同種型 IgG2a(G)、IgGl (H)響應(yīng)、和 IgG2a 與 IgGl 的比(I)。
[0037]圖11顯示在攻擊后第4天收集的肺提取物樣品中呼吸道合胞病毒(RSV) A2特異性免疫球蛋白(Ig)G, IgG2a、和IgGl響應(yīng)和IgG2a與IgGl的比的數(shù)據(jù)。使用連續(xù)稀釋的肺樣品以確定用RSV-F病毒樣顆粒(VLP)免疫或用RSV-G VLP免疫的小鼠中的IgG(A、C)、IgG2a、和 IgGl(B、D)響應(yīng)和比(E)。
[0038]圖12顯示針對(duì)細(xì)胞表面表達(dá)的呼吸道合胞病毒(RSV)-A2蛋白的免疫球蛋白(Ig)G、IgGl和IgG2a響應(yīng)的數(shù)據(jù)。如方法中所述地用RSV A2感染96孔培養(yǎng)板中的HEp_2細(xì)胞。將連續(xù)稀釋的小鼠血清加到孔中。確定來(lái)自RSV-F病毒樣顆粒(VLP)免疫(A、B)或用RSV-G VLP免疫(D、E)的小鼠的IgG、IgG2a和IgGl響應(yīng)。還利用RSV A2感染的HEp-2細(xì)胞或未感染的對(duì)照通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)確定總IgG響應(yīng)。在初免后第2周，從用RSV-F VLP(C)或RSV-G VLP(F)免疫的小鼠獲得血清。
[0039]圖13顯示血清中和活性的數(shù)據(jù)。檢驗(yàn)補(bǔ)體滅活的小鼠血清對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV) -A2空斑形成的抑制。補(bǔ)體滅活連續(xù)稀釋的加強(qiáng)后第3周的小鼠血清并與活的RSV-A2一起培養(yǎng)。稀釋病毒并以750PFU/孔使用。
[0040]圖14顯示呼吸道合胞病毒(RSV)-A2攻擊后肺病毒載量和體重變化的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。A，肺病毒載量。在攻擊后第4天收集每組出只小鼠)中來(lái)自單獨(dú)小鼠的肺，并確定每只小鼠中的肺病毒載量(空斑形成單位[PFU]的數(shù)目)。病毒檢測(cè)的限值是50PFU/mL。B，RSV-F與RSV-G病毒樣顆粒(VLP)的肺病毒載量的比較。Y軸的刻度下段(lowerscale)用于觀察RSV-F與RSV-G VLP免疫之間的肺病毒載量差異。C，體重變化。用活的RSV-A2病毒攻擊接種的小鼠(6只小鼠)。每天監(jiān)測(cè)體重，其中在第O天觀察到100%體重。
[0041]詳細(xì)討論
[0042]流感
[0043]現(xiàn)有的流感疫苗誘導(dǎo)針對(duì)HA和以較低程度針對(duì)NA蛋白的中和抗體，并對(duì)緊密匹配的病毒毒株是保護(hù)性的。然而突變的快速出現(xiàn)允許病毒躲避現(xiàn)存的抗流感免疫。高致病性禽病毒對(duì)人類(lèi)的適應(yīng)的可能性還增加了現(xiàn)有的流感疫苗策略的風(fēng)險(xiǎn)。
[0044]在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涵蓋包括表位諸如流感M2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(M2e)的流感候選疫苗的寬保護(hù)效力的使用。M2e在所有甲型流感病毒中是保守的。使用系統(tǒng)化方法以靶向M2e用 于通用流感疫苗的開(kāi)發(fā)。首先，通過(guò)用多個(gè)M2e肽(4.M2e)代替FliC的可變區(qū)來(lái)產(chǎn)生融合蛋白(4.M2e-tFliC)。第二，將來(lái)自流感HA的膜-錨(membrane-anchor)遺傳附著到4.M2e_tFliC融合蛋白并將這一膜錨定形式摻入到Ml衍生的VLP中。VLP作為免疫原在誘導(dǎo)強(qiáng)的免疫應(yīng)答方面是有益的，因?yàn)樗鼈兡M免疫系統(tǒng)逐步形成以攻擊的病毒的結(jié)構(gòu)。
[0045]HA胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含引導(dǎo)包膜糖蛋白組裝到Ml衍生的VLP中的信號(hào)?？蓪⒕哂蠬A膜-錨的融合蛋白摻入Ml衍生的VLP中。將可以以顆粒形式遞送M2e，并將在其天然外-膜-微環(huán)境(external-membrane-microenvironment)中展不。這使得能夠使用FliC的顆粒形式(FliC VLP)作為佐劑以增強(qiáng)由多個(gè)M2e肽誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。盡管串聯(lián)重復(fù)的使用增加分子中靶表位的密度，可能的顧慮是，誘導(dǎo)的抗體響應(yīng)可能不識(shí)別天然M2。Mozdzanowska 等人,Vaccine 2003; 21 (19-20): 2616-26 暗不，由多個(gè) M2e 重復(fù)誘導(dǎo)的總抗體響應(yīng)的平均10%與病毒感染的細(xì)胞表面的天然M2交叉反應(yīng)。然而在本研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在合適的條件中，M2e誘導(dǎo)高水平的M2特異性免疫和針對(duì)致死劑量的活病毒攻擊的完全保護(hù)。
[0046]由于FliC的可變區(qū)是高免疫原性的，缺失FliC的可變區(qū)或用M2e重復(fù)代替FliC的可變區(qū)的益處避免可能的抗體介導(dǎo)的其TLR5信號(hào)傳導(dǎo)的中和。FliC的特有先天TLR5信號(hào)傳導(dǎo)活性可將任何適合的外來(lái)B細(xì)胞決定簇轉(zhuǎn)化為可能強(qiáng)的免疫原。
[0047]幾種不同免疫途徑已經(jīng)被用于遞送M2e衍生的抗原用于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。發(fā)現(xiàn)
1.η.免疫與其他途徑相比在誘導(dǎo)保護(hù)性免疫方面是有益的方法。用4.M2e-tFliC融合蛋白或VLP 1.η.免疫誘導(dǎo)高的系統(tǒng)免疫應(yīng)答以及強(qiáng)的粘膜免疫，并賦予對(duì)活病毒攻擊的更有效的保護(hù)，如由針對(duì)PR8或Philippines攻擊的完全保護(hù)、和最少的體重減少證明的。而且，病毒復(fù)制被限制在肺中，如由較低肺病毒滴度揭示的。1.n.免疫刺激鼻咽相關(guān)的淋巴網(wǎng)狀組織(NALT)，并誘導(dǎo)局部粘膜免疫。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可變區(qū)截短的鞭毛蛋白作為如以上討論的粘膜佐劑是更有效的。這些觀察結(jié)果提供以下發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ):特定M2e-tFliC融合蛋白還促進(jìn)增強(qiáng)的粘膜免疫。
[0048]最令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，用1.η.施用的4.M2e加FliC VLP混合物免疫的小鼠實(shí)現(xiàn)最佳的免疫應(yīng)答。
[0049]呼吸道合胞病毒(RSV)
[0050]在小鼠模型中，肌內(nèi)接種后研究以病毒樣顆粒形式產(chǎn)生的RSV疫苗的保護(hù)效力。VLP接種提供針對(duì)RSV感染的有效保護(hù)。RSV-F或RSV-G VLP引起顯著水平的主要IgG2a的RSV特異性IgG抗體響應(yīng)并顯著減少攻擊后的肺病毒復(fù)制和體重減少。
[0051]VLP靶向全長(zhǎng)RSV融合F蛋白(RSV-F)和附著G糖蛋白(RSV-G)，它們具備中和表位以及多個(gè)T細(xì)胞表位。在VLP中使用流感Ml蛋白而非RSV基質(zhì)(M)作為核心蛋白，因?yàn)榛|(zhì)蛋白對(duì)于病毒粒子形態(tài)重要且RSV是比流感病毒更多形的。而且，在不存在NP和包膜糖蛋白共表達(dá)時(shí)一些副粘病毒M蛋白對(duì)于VLP形成不是足夠的。RSV-F或RSV-G VLP顯示球形的顆粒形狀。從無(wú)血清的昆蟲(chóng)細(xì)胞rBV產(chǎn)生的VLP疫苗具有超過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的VLP的益處，因?yàn)樾枰C實(shí)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的VLP不含源自細(xì)胞和/或血清的病毒或致癌物質(zhì)。
[0052]已經(jīng)報(bào)道，包含RSV-G蛋白的RSV VLP疫苗在小鼠模型中誘導(dǎo)保護(hù)。參見(jiàn)Murawski等人，J Virol 2010;8 4:1110-23。在這一報(bào)告中，使用了其中胞外域來(lái)自RSV G蛋白、但胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域和M蛋白來(lái)自新城疫病毒(NDV)的嵌合蛋白。未確定來(lái)自用這些VLP接種的IgG亞型響應(yīng)。
[0053]現(xiàn)在公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)集中于VLP中的全長(zhǎng)RSV-F或-G蛋白。RSV-G VLP比RSV-F VLP誘導(dǎo)更好的保護(hù)。RSV-F不要求其他病毒蛋白的融合活性并可在表達(dá)后經(jīng)歷融合前至融合后的觸發(fā)。未預(yù)期某些實(shí)施方案被任何特定機(jī)制限制；然而，VLP表面的一些F可處于融合后形式是可能的，可能在攻擊病毒上低呈現(xiàn)(underrepresented)。可選地,與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，RSV-F和/或-G在用于產(chǎn)生VLP的昆蟲(chóng)細(xì)胞中可以被差異糖基化，且G的低糖基化可使得免疫集中在保護(hù)表位(protectope)(例如，G的中心區(qū))。RSV-F VLP將提供針對(duì)A和B亞組的RSV分離株的保護(hù)，而由RSV-G VLP引起的保護(hù)可以是更具亞組特異性的。在小鼠和棉鼠中，亞組混雜的保護(hù)是用F抗原免疫容易實(shí)現(xiàn)的，且用RSV G抗原通常觀察到顯著但部分的亞組混雜的保護(hù)。在抗原性亞組中，基于RSV G的高變羧基末端區(qū)的序列分析，RSV可被進(jìn)一步分為進(jìn)化枝(clade)。
[0054]開(kāi)發(fā)了 ELISA測(cè)定來(lái)通過(guò)利用細(xì)胞表面表達(dá)的RSV蛋白檢測(cè)IgG、IgG2a和IgGl抗體。因?yàn)槔眉?xì)胞表面RSV-A2蛋白作為結(jié)合抗原發(fā)現(xiàn)了抗體響應(yīng)與保護(hù)的相關(guān)性，利用這一方法檢測(cè)抗體可以更可靠并將有助于RSV疫苗研究。RSV-F和RSV-G VLP疫苗誘導(dǎo)非常高水平的IgG2a同種型響應(yīng)和非常低水平的IgGl同種型響應(yīng)。這是鼓舞人的，因?yàn)镽SV攻擊后增強(qiáng)的疾病被報(bào)告與Th2 (IgGl)過(guò)敏癥樣或Th2相關(guān)響應(yīng)相關(guān)。已經(jīng)報(bào)告，F(xiàn)和G蛋白亞基RSV疫苗是弱免疫原性的并引起增強(qiáng)的肺組織病理學(xué)。與之相比，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒復(fù)制子顆粒(VRP)、以及表達(dá)RSV G的新城疫VLP，是更具免疫原性的、有效的，且不引起增強(qiáng)的RSV病。由于VLP中的RSV蛋白以重復(fù)性、顆粒病毒樣結(jié)構(gòu)展現(xiàn)，它們可以是高度免疫原性的并誘導(dǎo)保護(hù)性體液、細(xì)胞和粘膜免疫應(yīng)答。
[0055]相信這是證明并比較由包含全長(zhǎng)融合(F)或附著(G)糖蛋白的VLP引起的保護(hù)的首個(gè)報(bào)告。RSV-F或RSV-G VLP成功地抑制肺中的病毒復(fù)制并保護(hù)小鼠不受感染。RSV-F或RSV-G VLP是有希望的候選疫苗。
[0056]術(shù)語(yǔ)
[0057]如本文所用的，“鞭毛蛋白”是指鞭毛中的單體亞基，例如，鼠傷寒沙門(mén)氏菌中FliC和FljB、和嗜肺性軍團(tuán)病桿菌(L.pneumophila)中FlaA的鞭毛蛋白基因產(chǎn)物、或其變體、類(lèi)似物、同源物、衍生物、片段或組合，諸如結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域中的多肽序列。通常，鞭毛蛋白單體包含D0、D1、D2和D3結(jié)構(gòu)域。來(lái)自不同革蘭氏陰性物種的氨基酸序列的比對(duì)顯示氨基和羧基末端結(jié)構(gòu)域中高程度的相似性。這些蛋白的中心區(qū)可以是相當(dāng)趨異的。Smith, K.D.等人，Nature Immunol.(2003)4:1247-1253公開(kāi)了，TLR5識(shí)別鼠傷寒沙門(mén)氏菌的鞭毛蛋白(FliC)上由N末端殘基78-129和135-173與C末端殘基395-444構(gòu)成的位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)“鞭毛蛋白”不預(yù)期限于任何特定氨基酸序列，只要其具有與已知鞭毛蛋白序列的一些同源性且分子保持刺激先天免疫應(yīng)答的能力。已知鞭毛蛋白的先天免疫應(yīng)答包括響應(yīng)于TLR(包括TLR5)活化的細(xì)胞因子產(chǎn)生和響應(yīng)于某些NLR(包括Ipaf)的半胱天冬酶-1活化和IL-1 β分泌。在某些實(shí)施方案中，設(shè)想鞭毛蛋白在序列中包括另外的氨基酸，諸如在融合或嵌合蛋白的情形中，只要這些 蛋白繼續(xù)影響包括TLR5介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、Ipaf介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或二者的先天免疫應(yīng)答。還具體設(shè)想所述鞭毛蛋白的片段、變體、類(lèi)似物、同源物、或衍生物、和其組合，只要這些分子繼續(xù)影響包括TLR5介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、Ipaf介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或二者的先天免疫應(yīng)答。鞭毛蛋白可從天然來(lái)源分離，通過(guò)合成或重組技術(shù)或其組合分離。
[0058]單獨(dú)的沙門(mén)氏菌血清型通常在產(chǎn)生兩種形式的鞭毛蛋白，稱(chēng)為I相和2相之間交替，各自由分別的結(jié)構(gòu)基因FliC和FljB指定。鼠傷寒沙門(mén)氏菌的I相鞭毛蛋白(FliC)的氨基酸序列列在SEQ ID NO: 12中，
[0059]MAQVINTNSL SLLTQNNLNK SQSALGTAIE RLSSGLRINS AKDDAAGQAI ANRFTANIKG61 LTQASRNAND GISIAQTTEG ALNEINNNLQ RVRELAVQSA NSTNSQSDLD SIQAEITQRL 121NEIDRVSGQT QFNGVKVLAQ DNTLTIQVGA NDGETIDIDL KQINSQTLGL DTLNVQQKYK 181VSDTAATVTG YADTTIALDN STFKASATGL GGTDQKIDGD LKFDDTTGKY YAKVTVTGGT 241GKDGYYEVSV DKTNGEVTLA GGATSPLTGG LPATATEDVK NVQVANADLT EAKAALTAAG 301VTGTASVVKM SYTDNNGKTI DGGLAVKVGD DYYSATQNKD GSISINTTKY TADDGTSKTA 361LNKLGGADGK TEVVSIGGKT YAASKAEGHN FKAQPDLAEA AATTTENPLQ KIDAALAQVD 421TLRSDLGAVQ NRFNSAITNL GNTVNNLTSA RSRIEDSDYA TEVS匪SRAQ ILQQAGTSVL 481AQANQVPQNV LSLLR.[0060]鼠傷寒沙門(mén)氏菌的2相鞭毛蛋白(FljB)的氨基酸序列列在SEQ ID NO:13中，
[0061]MAQVINTNSL SLLTQNNLNK SQSALGTAIE RLSSGLRINS AKDDAAGQAI ANRFTANIKG61 LTQASRNAND GISIAQTTEG LNEINNNLQ RVRELAVQSA NSTNSQSDLD SIQAEITQRL 121NEIDRVSGQT QFNGVKVLAQ DNTLTIQVGA NDGETIDIDL KQINSQTLGL DSLNVQKAYD 181VKDTAVTTKA YANNGTTLDV SGLDDAAIKA ATGGTNGTAS VTGGAVKFDA DNNKYFVTIG 241GFTGADAAKN GDYEVNVATD GTVTLAAGAT KTTMPAGATT KTEVQELKDT PAVVSADAKN 301ALIAGGVDAT DANGAELVKM SYTDKNGKTI EGGYALKAGD KYYAADYDEA TGAIKAKTTS 361YTAADGTTKT AANQLGGVDG KTEVVTIDGK TYNASKAAGH DFKAQPELAE AAAKTTENPL 421QKIDAALAQV DALRSDLGAV QNRFNSAITN LGNTVNNLSE ARSRIEDSDY ATEVS匪SRA 481QILQQAGTSV LAQANQVPQN VLSLLR.[0062]鼠傷寒沙門(mén)氏菌的鞭毛蛋白的F41片段的氨基酸序列列在SEQ ID NO: 14中，
[0063]FTANIKGLTQ ASRNANDGIS IAQTTEGALN EINNNLQRVR ELAVQ SANSTNSQSDLDSIQ6IAEITQRLNEI DRVSGQTQFN GVKVLAQDNT LTIQVGANDG ETIDIDLKQI NSQTLGLDTL121 NVQQKYKVSD TAATVTGYAD TTIALDNSTF KASATGLGGT DQKIDGDLKF DDTTGKYYAK181 VTVTGGTGKD GYYEVSVDKT NGEVTLAGGA TSPLTGGLPA TATEDVKNVQ VANADLTEAK241 AALTAAGVTG TASVVKMSYT DNNGKTIDGG LAVKVGDDYY SATQNKDGSI SINTTKYTAD 301DGTSKTALNK LGGADGKTEV VSIGGKTYAA SKAEGHNFKA QPDLAEAAAT TTENPLQKID 361AALAQVDTLR SDLAAVQNRF NSAITNLGNT VNNLTSAR.[0064]鞭毛蛋白融合蛋白的氨基酸序列列在SEQ ID NO: 15中，
[0065]MALTVNTNIA SLNTQRNLNN SSASLNTSLQ RLSTGSRINS AKDDAAGLQI ANRLTSQVNG61 LNVATKNAND GISLAQTAEG ALQQSTNILQ RMRDLSLQSA NGSNSDSERT ALNGEVKQLQ 121KELDRISNTT TFGGRKLLDG SFGVASFQVG SAANE11SVG IGGGKLMIKL KFGVFFTVLL 181SSAYAHGTPQ NITDLCAEYH NTQIHTLNDK IFSYTESLAG KREMAIITFK NGATFQVEVP 241GSQHIDSQKK AIERMKDTLR IAYLTEAKVE KLCVffNNKTP HAIAAISMAN.[0066]鞭毛蛋白的多肽片段包括
[0067]SEQ ID NO: 16，GALNEINNNL QRVRELAVQ SANSTNSQS DLDSIQAE ITQ ; SEQ ID NO:17, TQFSGVKVLAQDNTLTIQVGANDGET IDIDLKQINS QTLGLDTL ；SEQ ID NO:18, EGALNEINNNLQRVRELA VQSANSTNS QSDLDSIQAEITQRLNEIDRVNG；SEQ ID NO:19, MAQVINTNSLSLLTQNNLNK SQSALGTAI ERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANF TANIKGLTQA SRNANDGISI AQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQS ；SEQ ID NO:20, LQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNL ；SEQ ID NO:21，TLRSDLGAVQN RFN SAITN LGNTVNN LSS ;和 SEQ ID N 0:22, EQAAKTTEN PLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSS.[0068]鞭毛蛋白的片段的組合包括
[0069] SEQ ID NO:23,MetArg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser MetThrl Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Pro Met AlaGln Val lie Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn Leu Asn Lys Ser GlnSer Ser Leu Ser Ser Ala He Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg He Asn Ser Ala LysAsp Asp Ala Ala Gly Gln Ala He Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn He Lys Gly Leu ThrGln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly lie Ser He Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala LeuAsn Glu lie Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser Val Gln Ala Thr Asn GlyThr Asn Ser Asp Ser Asp Leu Lys Ser lie Gln Asp Glu He Gln Gln Arg Leu Glu Glulie Asp Arg Val Ser Asn Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ser Gln Asp AsnGln Met Lys lie Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr He Thr He Asp Leu Gln Lyslie Asp Val Lys Ser Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn Ser Pro Gly He Ser GlyGly Gly Gly Gly lie Leu Asp Ser Met Gly Thr Leu He Asn Glu Asp Ala Ala Ala AlaLys Lys Ser Thr Ala Asn Pro Leu Ala Ser lie Asp Ser Ala Leu Ser Lys Val Asp AlaVal Arg Ser Ser Leu Gly Ala He Gln Asn Arg Phe Asp Ser Ala lie Thr Asn Leu GlyAsn Thr Val Thr Asn Leu Asn Ser Ala Arg Ser Arg lie Glu Asp Ala Asp Tyr Ala ThrGlu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln He Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu AlaGln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg.[0070]這一蛋白還稱(chēng)為CBLB502(AA’)，如在通過(guò)引用特此并入的美國(guó)公布的專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?009/0011982中提供的。CBLB502目前處于治療急性輻射綜合征(ARS)的臨床研究中。
[0071]如本文所用的，“RSV G”蛋白或類(lèi)似術(shù)語(yǔ)是指附著RSV糖蛋白G和其所有已知的變體或?qū)嵸|(zhì)片段。一個(gè)實(shí)例是MSKNKDQRTA KTLERTffDTL NHLLFISSCL YKLNLKSVAQ ITLSILAMIISTSLIIAAII 61 FIASANHKVT PTTAIIQDAT SQIKNTTPTY LTQNPQLGIS PSNPSEITSQITTILASTTP 121 GVKSTLQSTT VKTKNTTTTQ TQPSKPTTKQ RQNKPPSKPN NDFHFEVFNFVPCSISNNP 181 TffAIKRIP NKKPGKKTTT KPTKKPTLKT TKKDPKPQTT KSKEVPTTKP TEEPTINTTK241 TNIITTLLTS NTTGNPELTS QMETFHSTSS EGNPSPSQVS TTSEYPSQPS SPPNTPRQ (SEQ IDNO:88)。其他實(shí)例包括由以下登錄號(hào)指定的那些:P03423.1、P27022.1、AA51765.1、AAD02944.1、AA83874.1、AAD02941.1、AA83870.1、P27021.1、AE045938.1、AA51761.1、AA83871.UAA U43727.UAE045918.UAE045888.K AE045878.UAE045849.UAEC32086.1、AEQ98767.UAEQ63333.UCAA83875.UAE045908.UAE045948.UAE045898.UAE045928.1、AAC36327.1、AC083296.1、AE045829.1、AEQ66845.1、AC103570.1、AE045868.1、P20895.2、AAD02943.UAAX23993.UAEQ66853.UAE045839.UAEJ87998.1 和 AEJ88006.1。術(shù)語(yǔ)“RSVG”不預(yù)期限于任何特定氨基酸序列，只要其與已知RSV G序列具有大致同源性。涵蓋可選的糖基化。在某些實(shí)施方案中，已知的RSV G序列具有2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)氨基酸取代，或多肽的N或C末端上2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)氨基酸已被缺失。在某些實(shí)施方案中，設(shè)想RSV G在序列中包括另外的氨基酸，諸如在融合或嵌合蛋白的情形中。在某些實(shí)施方案中，變體可包含保守的氨基酸取代或用常見(jiàn)的化學(xué)基團(tuán)諸如保護(hù)基或鹵素獲得的衍生物。在某些實(shí)施方案中，片段是250至200、200至150、150至100、100至50、或25個(gè)氨基酸。
[0072]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“佐劑分子”包括能夠在宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答的細(xì)菌表面蛋白。特別是，術(shù)語(yǔ)包括能夠靶向宿主Toll樣受體(TLR)蛋白的細(xì)菌表面蛋白，諸如但不限于，靶向宿主TLR5蛋白的細(xì)菌鞭毛蛋白。在特定實(shí)施方案中，佐劑分子是佐劑分子的“膜錨定形式”，這表示佐劑分子已被工程化以包括信號(hào)肽(SP)和膜錨定序列以指導(dǎo)蛋白的運(yùn)輸和膜定向。如此，在實(shí)施方案中，佐劑分子的膜錨定形式是包括融合于SP的細(xì)菌蛋白(諸如細(xì)菌鞭毛蛋白)的部分和膜錨序列的重組蛋白。
[0073]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“病毒樣載體”是指病毒樣顆粒、病毒核蛋白顆粒(virosome)、
或二者。
[0074]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“病毒樣顆?！?VLP)是指具有病毒包膜蛋白的膜包圍的病毒核心結(jié)構(gòu)。此外,佐劑分子可在VLP上表達(dá)。而且，病毒核心蛋白位于VLP的膜內(nèi)。如本領(lǐng)域已知的，VLP的另外組分，可被包含在VLP內(nèi)或布置在VLP上。VLP通常不包含完整病毒核酸，且它們是非感染性的。
[0075]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“病毒核蛋白顆?！笔侵概c病毒樣顆粒類(lèi)似的病毒樣載體，除了病毒核蛋白顆粒不包含病毒核心蛋白。[0076]“截短的”病毒表面包膜糖蛋白是具有少于全長(zhǎng)蛋白(例如，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的一部分已被去除)的病毒表面包膜糖蛋白，它保留針對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答、優(yōu)選地保護(hù)性免疫應(yīng)答的表面抗原決定簇，且它保留足夠的包膜序列用于適當(dāng)?shù)哪げ迦?。熟練技術(shù)人員可利用公眾容易獲得的重組DNA技術(shù)和病毒編碼序列制備截短的病毒包膜蛋白。
[0077]術(shù)語(yǔ)“蛋白”、“肽”和“多肽”是指通過(guò)偶聯(lián)氨基酸殘基產(chǎn)生的分子，即氨基酸序列。這些序列從氨基向羧基末端從左至右的方向書(shū)寫(xiě)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)命名法，氨基酸殘基序列由三字母或單字母編碼命名，如下所示:丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp, D)、半胱氨酸(Cys, C)、谷氨酰胺(Gin, Q)、谷氨酸(GIu, E)、甘氨酸(GIy, G)、組氨酸(His, H)、異亮氨酸(lie, I)、亮氨酸(Leu, L)、賴氨酸(Lys, K)、甲硫氨酸(Met, Μ)、苯丙氨酸(Phe, F)、脯氨酸(Pro, P)、絲氨酸(Ser, S)、蘇氨酸(Thr, T)、色氨酸(Trp, W)、酪氨酸(Tyr，Y)、和纈氨酸(VaI，V)。
[0078]“變體”是指與參考多肽或多核苷酸不同、但保持基本特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型變體的氨基酸序列與另一、參考多肽不同。通常，差異是有限的，從而參考多肽與變體的序列總體上緊密相似(同源)、且在一些區(qū)域中相同。變體和參考多肽可在氨基酸序列方面依據(jù)一個(gè)或多個(gè)修飾(例如，取代、添加、和/或缺失)而不同。取代或插入的氨基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。多肽的變體可以是天然存在的，諸如等位基因變體，或可以是已知非天然存在的變體。
[0079]可對(duì)本公開(kāi)內(nèi)容的多肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改變并仍產(chǎn)生具有與多肽相似的特征的分子(例如，保守氨基酸取代)。例如，序列中某些氨基酸可被其他氨基酸取代，而沒(méi)有活性的顯著喪失。由于多肽的相互作用能力和性質(zhì)決定多肽的生物功能活性，可在多肽序列中進(jìn)行某些氨基酸序列 取代而獲得具有類(lèi)似特性的多肽。
[0080]在進(jìn)行此類(lèi)改變時(shí)，可考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指數(shù)在賦予多肽相互作用的生物功能中的重要性是本領(lǐng)域一般理解的。已知某些氨基酸可被具有相似親水指數(shù)或得分的其他氨基酸取代并仍產(chǎn)生具有類(lèi)似生物活性的多肽?；谄涫杷院碗姾商卣?，每個(gè)氨基酸已被分配親水指數(shù)。這些指數(shù)是:異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)、和精氨酸(-4.5)。
[0081]認(rèn)為氨基酸的相對(duì)親水特征決定所得多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其轉(zhuǎn)而界定多肽與其他分子諸如酶底物、受體、抗體、抗原等等的相互作用。本領(lǐng)域已知，氨基酸可被具有類(lèi)似親水指數(shù)的另一氨基酸取代并仍獲得功能上相當(dāng)?shù)亩嚯?。在此?lèi)改變中，親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，在±1內(nèi)的那些是尤其優(yōu)選的，且在±0.5內(nèi)的那些是甚至更尤其優(yōu)選的。
[0082]相似氨基酸的取代還可基于親水性進(jìn)行，尤其是當(dāng)從而產(chǎn)生的生物功能上相當(dāng)?shù)亩嚯幕螂念A(yù)期用于免疫實(shí)施方案中時(shí)。以下親水性值已被分配于氨基酸殘基:精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0)、谷氨酸(+3.0)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(O)、脯氨酸(-0.5)、蘇氨酸(-0.4)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、 酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、和色氨酸(-3.4)。應(yīng)理解，氨基酸可被具有類(lèi)似親水性值的另一氨基酸取代并仍獲得生物相當(dāng)?shù)摹⑶矣绕涫敲庖呦喈?dāng)?shù)亩嚯?。在此?lèi)改變中，親水性值在±2內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，在±1內(nèi)的那些是尤其優(yōu)選的，且在±0.5內(nèi)的那些是甚至更尤其優(yōu)選的。
[0083]如以上概述的，氨基酸取代通常是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如，其疏水性、親水性、電荷、大小等等?？紤]到一個(gè)或多個(gè)上述特征的示例性取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并包括但不限于(最初殘基:示例性取代):(Ala.GIy, Ser)、(Arg Lys)、(Asn.Gin, His)、(Asp:GIulCys, Ser) > (Gin.Asn) > (GIu.Asp) > (GIy.Ala) > (His.Asn, Gin) > (lieLeu, VaI)、(Leu:lie, VaI)、(Lys:Arg)、(Met:Leu, Tyr)、(Ser:Thr)、(Thr:Ser)、(Tip:Tyr)、(Tyr:Trp，Phe)、和(Val-lie，Leu)。如此，本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案涵蓋如以上列出的多肽的功能或生物等價(jià)物。具體地，多肽的實(shí)施方案可包括與目標(biāo)多肽具有約50%、60%、70%、80%、90%和95%序列同一性的變體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“大致上同源”表示與參考序列具有約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、和優(yōu)選地約95%序列同一‘丨生的本公開(kāi)內(nèi)容的多肽。序列同一性百分比通過(guò)以上討論的常規(guī)方法確定。一般，本公開(kāi)內(nèi)容的同源多肽通過(guò)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、和/或添加來(lái)表征。
[0084]如本領(lǐng)域已知的“同一性”，是兩個(gè)或多個(gè)多肽序列之間的關(guān)系，如通過(guò)比較序列確定的。在本領(lǐng)域中，“同一性”還是指多肽之間序列親緣關(guān)系的程度，如通過(guò)此類(lèi)序列串之間的匹配確定的?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨赏ㄟ^(guò)已知方法容易地計(jì)算，所述方法包括但不限于以下資料中描述的那些！Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編著，Oxford University Press, New York, 1988 ；Biocomputing:1nformatics andGenome Projects, Smith, D.ff.編著，Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysisof Sequence Data, Part Il Griffin, A.M.和 Griffin, H.G.編著，Humana Press, NewJersey, 1994, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., AcademicPress, 1987 ；和 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和 Devereux, J.編著，MStockton Press,New York,1991 ；和 Carillo，H.和 Lipman, D.，SIAM J AppliedMath.，48.1073, (1988)。設(shè)計(jì)確定同一性的優(yōu)選方法以得出所測(cè)試序列之間的最大匹配。確定同一性和相似性的方法被整理在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中。兩個(gè)序列之間的同一性百分比可通過(guò)利用合并有Needelman&ffunsch (J MoI Biol, 48443-453，1970)算法的分析軟件(Sequence Analysis Software Package of the Genetics ComputerGroup, Madison, Wis)(例如NBLAST和XBLAST)確定。使用缺省參數(shù)確定本公開(kāi)內(nèi)容的多肽的同一性。通過(guò)示例，多肽序列可以與參考序列相同，即100%相同，或其可包括與參考序列相比達(dá)到某一整數(shù)的氨基酸改變，使得％同一性小于100%。此類(lèi)改變選自至少一個(gè)氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)、或插入，且其中所述改變可發(fā)生在參考多肽序列的氨基或羧基末端位置或這些末端位置之間的任何地方，在參考序列中氨基酸之間單獨(dú)地散布，或以參考序列中一個(gè)或多個(gè)連續(xù)基團(tuán)散布。對(duì)于給定％同一性的氨基酸改變數(shù)目通過(guò)如下確定:將參考多肽中氨基酸的總數(shù)乘以各自同一性百分比(除以100)的數(shù)字百分比，且然后從所述參考多肽中氨基酸的總數(shù)減去該乘積。
[0085]保守氨基酸變體還可包括非天然存在的氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸包括但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲醇基脯氨酸、順式-4-羥基脯氨酸、反式-4-羥基脯氨酸、N-甲基-甘氨酸、別蘇氨酸、甲基蘇氨酸、羥乙基半胱氨酸、羥乙基高半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷胱甘肽、哌可酸、噻唑烷羧酸、二氫脯氨酸(dehydr0pix)hne)、3-和4-甲基脯氨酸、3，3- 二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正纈氨酸、2-氮雜苯基-丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸、和4-氟苯丙氨酸。本領(lǐng)域已知將非天然存在的氨基酸殘基摻入蛋白的幾種方法。例如可采用體外系統(tǒng)，其中利用化學(xué)氨基?；囊种菩蛅RNA抑制無(wú)義突變。合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本領(lǐng)域已知的。包含無(wú)義突變的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和翻譯在包含大腸桿菌(E coli) S30提取物和市售可得的酶和其他試劑的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行。蛋白通過(guò)色譜純化(Robertson 等人，J Am Chem Soc, 113 2722，1991, Ellman 等人,Methods Enzymol, 202 301,1991, Chung 等人,Science, 259 806-9，1993,和 Chung等人，Proc Natl Acad Sci USA, 90 10145-9,1993)。在第二種方法中，通過(guò)微注射突變的mRNA和化學(xué)氨基?；囊种菩蛅RNA，在爪蟾卵中進(jìn)行翻譯(Turcatti等人，J BiolChem, 271 19991-8,1996)。在第三種方法中，在將被代替的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)不存在和在期望的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)存在下培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞。非天然存在的氨基酸被摻入蛋白中代替其天然對(duì)應(yīng)物(Koide等人，Biochem, 33 7470-6, 1994)。天然存在的氨基酸殘基可通過(guò)體外化學(xué)修飾轉(zhuǎn)化為非天然存在的種類(lèi)。化學(xué)修飾可與定點(diǎn)誘變組合以進(jìn)一步擴(kuò)展取代范圍(Wynn 等人，Protein Sci, 2 395-403，1993)。
[0086]此外，除非上下文另外要求，否則術(shù)語(yǔ)肽、多肽和蛋白可互換地使用，是指其中氨基酸殘基被共價(jià)肽鍵或替代地(其中翻譯后加工已經(jīng)去除了內(nèi)部區(qū)段)被共價(jià)二硫鍵等連接的氨基酸。氨基酸鏈可以是任何長(zhǎng)度并可包括至少兩個(gè)氨基酸，所述氨基酸鏈可包括蛋白的結(jié)構(gòu)域或全長(zhǎng)蛋白。 除非另外指出，否則術(shù)語(yǔ)肽、多肽和蛋白還涵蓋其多種修飾形式，包括但不限于糖基化形式、磷酸化形式、等等。
[0087]“施用”是指引入本公開(kāi)內(nèi)容的組合物(例如，疫苗、佐劑或免疫原性組合物)到受治療者?？墒褂萌魏问┯猛緩剑T如口服、局部、皮下、腹膜、動(dòng)脈內(nèi)、吸入、陰道、直腸、鼻、弓丨入腦脊液、或滴注到身體部位。
[0088]“免疫原性組合物”是當(dāng)注射到受治療者中時(shí)導(dǎo)致特定抗體產(chǎn)生或細(xì)胞免疫的組合物。此類(lèi)免疫原性組合物或疫苗可用于，例如，針對(duì)感染和/或病毒引起的損傷的免疫。
[0089]“免疫原性量”是指在已經(jīng)施用疫苗的宿主中能夠引發(fā)針對(duì)病毒的抗體產(chǎn)生的量。優(yōu)選地，設(shè)計(jì)施用途徑和免疫原性組合物以優(yōu)化粘膜表面的免疫應(yīng)答，例如，利用免疫原性組合物的鼻施用(經(jīng)由氣霧劑)。
[0090]本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上”或“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)適當(dāng)?shù)厥┯糜趧?dòng)物或人類(lèi)時(shí)不產(chǎn)生不利的、過(guò)敏或其他不適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)的分子實(shí)體和組合物。
[0091]本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指任何載體、賦形劑、稀釋劑、佐劑或載運(yùn)體，諸如防腐劑或抗氧化劑、填充劑、崩解劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑、等等。此類(lèi)介質(zhì)和劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或劑與活性成分不相容，否則設(shè)想了其在治療組合物中的使用。附加的活性成分也可被摻入組合物中作為適當(dāng)?shù)闹委熃M合。本文使用的術(shù)語(yǔ)“受治療者”包括人類(lèi)、哺乳動(dòng)物(例如，貓、犬、馬、等等)和家畜。本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案可施用的典型受治療者將是哺乳動(dòng)物、尤其是靈長(zhǎng)類(lèi)，特別是人類(lèi)。對(duì)于獸醫(yī)應(yīng)用，寬范圍的受治療者將是適合的，例如，家畜諸如牛(cattle)、綿羊、山羊、奶牛(cow)、豬、等等,家禽諸如雞、鴨、鵝、火雞、等等，和家養(yǎng)動(dòng)物特別是寵物諸如犬和貓。
[0092]術(shù)語(yǔ)“治療(treat)”、“治療(treating)”和“治療(treatment)”是用于獲得有益或期望臨床結(jié)果的方法。為了本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案的目的，有益或期望的臨床結(jié)果包括但不限于，癥狀的減輕、疾病程度的減少、疾病的穩(wěn)定(例如，不惡化)、阻止疾病的蔓延、延遲或減慢疾病發(fā)展、疾病狀態(tài)的改善或緩和、和可檢測(cè)或不可檢測(cè)的減輕(部分或全部)。此外，“治療(treat)”、“治療(treating)”和“治療(treatment)”還可表示與未接受治療的預(yù)計(jì)存活相比延長(zhǎng)的存活。
[0093]實(shí)驗(yàn)
[0094]細(xì)胞系和病毒
[0095]草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) sf9細(xì)胞如通過(guò)引用特此并入的Wang等人，J Virol, 2008，82(23):11813-23 中所述地維持。將 Madin-Darby 犬腎(MDCK, ATCC號(hào)PTA-6500)細(xì)胞在Dulbecco最小必需培養(yǎng)基(DMEM, Cellgro)加10%胎牛血清(FBS)中培養(yǎng)。小鼠適應(yīng)的流感 A/PR/8/34(HlNl)和 A/Philippines/2/82/X_79 (H3N2)病毒如通過(guò)引用特此并入的Quan等人，JVirol 2007;81 (7):3514-24中所述地制備。這些毒株的LD50(引起50%死亡的致死劑量)通過(guò)用連續(xù)的病毒稀釋液感染小鼠來(lái)確定。將RAW264.7 (ATCC 號(hào) TIB-71)細(xì)胞在 DMEM 加 10%FBS 中培養(yǎng)。
[0096]膜錨定的鞭毛蛋白基因的構(gòu)建
[0097]全長(zhǎng)膜錨定的鞭毛蛋白編碼基因通過(guò)分別符合讀框地融合來(lái)自蜜蜂蜂毒肽蜂毒肽的信號(hào)肽(SP) MKFLVNVALVFMVVYISHYADPINMTGS (SEQ ID NO: 26)和來(lái)自甲型流感病毒PR8血凝素(HA)的跨膜(TM)和胞質(zhì)尾(CT)區(qū)的編碼序列于鞭毛蛋白基因的5'和3'末端來(lái)產(chǎn)生。流感病毒 HATM 是 DWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWAC(SEQ ID N0:24)且 CT 是QKGNIRCNICI (SEQ ID N0:25)。顯示用來(lái)自蜜蜂蜂毒肽的信號(hào)肽(SP)取代HIV Env信號(hào)肽(SP)促進(jìn)HIV-lgpl20在昆蟲(chóng)細(xì)胞中較高水平的表達(dá)和分泌。發(fā)現(xiàn)用源自小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)包膜糖蛋白、流感病毒血凝素或桿狀病毒(BV) gp64的序列取代HIV TM-CT增強(qiáng)Env向VLP中的摻入。
[0098]如在通過(guò)引用特此并入的Wang等人，J.Virol.，2007，81:10869-10878中所描述的，蜂毒肽SP-編碼片段通過(guò)使用引物5' -GGTTCTAGAATGAAATTCTTAGTC-3 ' (SEQ IDNO:2)和 5 ' -GTGGGATCCTTTCATGTTGATCGG-3 ' (SEQ ID NO:3) (XbaI 和 BamHI 位點(diǎn))從質(zhì)粒M-TM.CTmmtv PCR擴(kuò)增并克隆到帶有Xbal/BamHI位點(diǎn)的克隆載體pBluescript (-)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pBluescript-SP。腸沙門(mén)氏菌鼠傷寒血清型(Salmonella entericaserovar Typhimurium)鞭毛蛋白基因(fliC;GenBank登錄號(hào)D13689)通過(guò)使用引物5 ' -GCAGGATCCATGGCACAAGTCAT-3 ' (SEQ ID N0:4)和 5 ' -CGCGAATTCACGCAGTAAAGAGAG-3 ' (SEQ ID NO:5)從 質(zhì)粒 pEM045 pEF6 FliC stop (來(lái)自 Alan Aderem, Instituteof Systems Biology, Seattle, WA 的惠贈(zèng))擴(kuò)增并插入到 pBluescript-SP 中，產(chǎn)生pBluescript-SP-FliCo HA TM-CT 通過(guò)使用引物 5' -GCTAGAATTCCAGATTCTGGCGATC-3' (SEQ ID NO:6)和 5' -GCTAGGGCCCTTATCAGATGCATATTCT-3' (SEQ ID NO:7)從包含全長(zhǎng) HA基因的質(zhì)粒 pc/pSl 擴(kuò)增并克隆到 pBluescript-SP-FliC 中，產(chǎn)生pBluescript-SP-FliC_HA尾。全長(zhǎng)膜錨定的鞭毛蛋白基因通過(guò)使用引物V -GCTCGTCGACATGAAATTCTTAG-3'(SEQ ID NO:8)和 5 ' -GCTACTCGAGTTATCAGATGCATATTC-3 ' (SEQ ID NO:9)從pBluescript-SP-FliC-HA尾擴(kuò)增并克隆到pFastBacl中處于多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下。膜錨定的鞭毛蛋白基因的序列通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)。
[0099]編碼M2e的4個(gè)重復(fù)(4.M2e)和包含4.M2e的融合蛋白的基因的構(gòu)建
[0100]編碼共有序列M2e(SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDP) (SEQ ID NO:1)的單獨(dú)重復(fù)和柔性接頭序列(AAASLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDPAAGTSAAASLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDPAAALQAAASLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDPAAAACAAASLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDPAAAACKL)(SEQ IDNO: 11)的四個(gè)DNA片段通過(guò)引物延伸PCR產(chǎn)生，并連接在一起以產(chǎn)生編碼4.M2e的基因。M2e 在位點(diǎn) 17 和 19 包含兩個(gè)半胱氨酸殘基 SLLTEVETPIRNEWG￡R￡ NDSSDP (SEQ ID NO: 10)。因?yàn)檫@些半胱氨酸可導(dǎo)致分子內(nèi)二硫鍵的形成和氧化條件下顆粒的聚集，用兩個(gè)絲氨酸殘基代替M2e中的兩個(gè)半胱氨酸殘基。為了產(chǎn)生編碼其中FliC的可變區(qū)被4.M2e代替的融合蛋白的基因，從Fli基因(fli，GenBank登錄號(hào)D13689，來(lái)自Dr.Alan Aderem的惠贈(zèng))缺失編碼可變區(qū)(Fli中的AA 177-401)的DNA片段，并通過(guò)重疊PR用4.M2e編碼序列代替該DNA片段。將N末端蜂毒肽信號(hào)肽(SP)和末端組氨酸(His)標(biāo)簽編碼序列符合讀框地添加至以上融合構(gòu)建體用于蛋白產(chǎn)生和純化。此外，4.M2e-Fli構(gòu)建體的膜錨定形式通過(guò)符合讀框地添加流感HA(A/PR8)膜-錨編碼序列到4.M2e-Fli編碼基因的C末端來(lái)產(chǎn)生，如通過(guò)引用特此并入的Wang等人，J Virol, 2008,82 (23):11813-23中公開(kāi)的。構(gòu)建體的完整性通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)。
[0101]帶有HA跨膜/胞質(zhì)結(jié) 構(gòu)域的截短的鞭毛蛋白的DNA序列。
[0102]TGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTGTACATTTCTTACATCTATGCGGACCCGATCAACATGACCGGATCCATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCTCTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTTACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCTAACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGTGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTGAAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGATACGCTGAATGTGGGCGCGCCGGTCTACCCGTATGACGTGCCGGACTACGCGTCGCCATGGACAACCACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCTGCTTTGGCACAGGTTGACACGTTACGTTCTGACCTGGGTGCGGTACAGAACCGTTTCAACTCCGCTATTACCAACCTGGGCAACACCGTAAACAACCTGACTTCTGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGTTCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTGAATTCGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGATCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGTTCTAATGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGATAA(SEQ ID NO:27)
[0103]帶有HA跨膜/胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的截短的鞭毛蛋白的蛋白序列。
[0104]MKFLVNVALVFMVVYISYIYADPINMTGSMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDTLNVGAPVYPYDVPDYASPWTTTENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLREFGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO:28)
[0105]蛋白純化
[0106]將以上基因克隆到轉(zhuǎn)移載體pFastBac-1 (Invitrogen)中并利用Bac-to-Bac昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)根據(jù)制造商的說(shuō)明用于產(chǎn)生重組桿狀病毒(rBV)。利用鎳親和性色譜(Qiagen)通過(guò)按照制造商的說(shuō)明純化加His標(biāo)簽的4.M2e和4.M2e_tFliC。通過(guò)離心(8000rpm，20min)澄清用表達(dá)以上蛋白的rBV感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物。從上清液純化蛋白，對(duì)PBS透析并儲(chǔ)存在_80°C。
[0107]鞭毛蛋白VLP產(chǎn)生
[0108]表達(dá)膜錨定的4.M2e_tFliC的重組BV如上所述地產(chǎn)生。表達(dá)膜錨定的FliC和Ml的重組BV描述在通過(guò)引用特此并入的Wang等人，J Virol, 2008,82 (23):11813-23中。4.M2e-FliC VLP通過(guò)分別以感染復(fù)數(shù)(MOI) 6和3用表達(dá)膜錨定的4.M2e_FliC和Ml的rBV共感染sf9細(xì)胞產(chǎn)生。當(dāng)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡利用純化的4.M2e作為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，4.M2e-tFliC VLP中的M2e含量是1.5%。FliC VLP通過(guò)以M0I6和3用表達(dá)FliC和Ml的rBV共感染sf9細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。通過(guò)利用 Quixstand Benchtop 系統(tǒng)(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)的多孔纖維過(guò)濾、隨后蔗糖密度梯度超速離心，從感染后60h的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液濃縮VLP。VLP通過(guò)蛋白測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡、無(wú)菌度測(cè)定(sterility assay)和電鏡法(EM)表征。負(fù)染VLP用于EM觀察。[0109]TLR-5特異性生物活性測(cè)定
[0110]利用基于RAW264.7細(xì)胞的測(cè)定評(píng)價(jià)以上包含F(xiàn)liC的融合蛋白和VLP的TLR5結(jié)合活性?？扇苄訤liC用作陽(yáng)性對(duì)照。僅包含Ml的VLP用作陰性對(duì)照。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基以10倍步幅將所有蛋白或VLP從10 μ g/ml稀釋到0.001ng/ml。用這些稀釋的蛋白或VLP溶液處理細(xì)胞培養(yǎng)物。處理24h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。TLR5陽(yáng)性和陰性細(xì)胞培養(yǎng)物中被以上VLP的融合蛋白刺激的腫瘤壞死因子α (TNF-α)產(chǎn)生的水平通過(guò)ELISA利用TNF-a測(cè)定試劑盒(eBioscience, San Diego, CA)按照制造商的說(shuō)明確定。TLR5生物活性展示為T(mén)LR5陽(yáng)性細(xì)胞中TNF-α產(chǎn)生的水平減去TLR5陰性細(xì)胞中TNF-a產(chǎn)生的水平。
[0111]免疫和攻擊
[0112]將六只近交的雌性BALB/c小鼠(來(lái)自Charles River Laboratory)的組用融合蛋白或M2e VLP以如表1中所示的劑量通過(guò)肌內(nèi)(1.m.)或鼻內(nèi)(1.η.)途徑以4周間隔免疫三次。初免免疫前I周收集血清樣品作為免疫前血清。最后一次免疫后4周收集免疫血清和肺灌洗液樣品。通過(guò)眼窩后網(wǎng)狀組織穿刺收集血液樣品。對(duì)于病毒攻擊，通過(guò)吸入異氟烷輕微麻醉小鼠，并將25 μ I PBS體積中的5LD50小鼠適應(yīng)的PR8或Philippines病毒施用到小鼠鼻孔中。持續(xù)15天每天監(jiān)測(cè)小鼠體重和存活。在感染后第4天處死感染小鼠的組以確定肺病毒載量。確定肺病毒滴度。
[0113]抗體響應(yīng)
[0114]血清M2e特異性IgG端點(diǎn)滴度通過(guò)ELISA確定。在4°C用100 μ I碳酸鹽緩沖液(ρΗ9.4, 5 μ g/ml)中 M2e 肽(17 個(gè)氨基酸，2 至 18, SLLTEVETPIRNEffGCR(SEQ ID N0:89)，在Emory University Biochemical Core Facility 合成)包被 96 孔 ELISA 板(Nunc LifeTechnologies)過(guò)夜。以兩倍步幅連續(xù)稀釋血清樣品。提供兩倍于無(wú)稀釋的無(wú)處理(naive )組的0D450的最高稀釋標(biāo)為抗體端點(diǎn)滴度。利用細(xì)胞表面ELISA確定血清M2特異性抗體水平。將96孔培養(yǎng)板中的MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)到接近90%匯合，且然后用PR8病毒以MOI
I(5X 104pfu)感染。生長(zhǎng)12h后，洗滌板并在4°C用0.5%戊二醛固定細(xì)胞30min。用PBS洗滌三次后，將測(cè)試血清的連續(xù)稀釋加入孔并在室溫培養(yǎng)2h。結(jié)合未感染的MDCK細(xì)胞的抗體作為背景被減去。M2特異性抗體水平展示為0D450的值。
[0115]對(duì)于確定粘膜抗體水平，如以上對(duì)血清IgG描述的，利用HRP共軛的兔抗小鼠IgA作為二抗評(píng)價(jià)免疫的小鼠的肺灌洗液的IgA和IgG端點(diǎn)滴度。
[0116]融合蛋白的純化和VLP的產(chǎn)生
[0117]重復(fù)性形式的M2e是免疫原性的。發(fā)現(xiàn)附著于鼠傷寒(typhimurium) II相鞭毛蛋白fljB的C末端的4.M2e的融合蛋白在誘導(dǎo)抗M2免疫方面在數(shù)量和品質(zhì)上優(yōu)于M2e。Huleatt 等人，Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenzavaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2eto the TLR5 ligand flagellin.Vaccine 2008; 26 (2): 201-14。產(chǎn)生編碼共有序列 M2e 肽(圖1中的上圖)的DNA片段。還構(gòu)建了加組氨酸(His)標(biāo)簽的融合蛋白4.M2e-tFliC(圖1中的下圖)，其中FliC的可變區(qū)被4.M2e代替，且在基于BV的蛋白表達(dá)系統(tǒng)中從sf9細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生該融合蛋白。還構(gòu)建加his標(biāo)簽的4.M2e并純化作為對(duì)照。
[0118]為了進(jìn)一步改進(jìn)M2e的免疫原性，構(gòu)建膜錨定的融合蛋白4.M2e_tFliC基因(圖1中的下圖)并摻入流感Ml衍生的VLP中，如圖2A中示例的。VLP的完整性通過(guò)電鏡法證實(shí)(圖2B)。VLP中膜錨定的4.M2e-tFliC的摻入通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定利用抗FliC抗體(圖2C中的泳道I)或抗M2e 抗體(14C2，圖2D中的泳道I)證實(shí)。產(chǎn)生FliC/MlVLP作為對(duì)照。FliC向FliC/Ml VLP中的摻入通過(guò)蛋白質(zhì)印跡利用抗FliC抗體(圖2C中的泳道2)或抗Ml抗體(圖2E)證實(shí)。
[0119]因?yàn)門(mén)LR5是鞭毛蛋白的細(xì)胞外傳感器，確定了可溶性M2e_tFliC融合蛋白或VLP中膜錨定的融合蛋白作為T(mén)LR5配體起作用的能力。如圖2F中所示的，包含F(xiàn)liC的融合蛋白或VLP顯示TLR5特異性生物活性，誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7產(chǎn)生0.01ng至1000ng/ml濃度范圍的TNF- α。4.M2e_tFliC的50%有效濃度(產(chǎn)生最大活性的50%的濃度，EC50)是5ng，且4.M2e_tFliC VLP的50%有效濃度是60ng?？扇苄员廾鞍椎腅C5tl是
0.8ng/ml。考慮到可溶性FliC具有比融合蛋白或VLP低得多的分子量，EC5tl滴度在預(yù)計(jì)范圍內(nèi)。
[0120]4.M2e-tFliC融合蛋白或VLP誘導(dǎo)高的IgG響應(yīng)
[0121]為了評(píng)價(jià)多種包含M2e的融合蛋白或VLP作為通用流感疫苗的潛力，以4周的間隔用表1中所示的劑量免疫小鼠組(每組中6只小鼠)三次。通過(guò)肌內(nèi)(1.m.)或鼻內(nèi)(1.η.)免疫比較免疫應(yīng)答。圖3Α中的結(jié)果顯示,融合蛋白和VLP組二者通過(guò)1.m.或1.η.途徑觸發(fā)牢固的針對(duì)M2e的體液應(yīng)答，與之相比4.M2e組顯示非常低的血清IgG響應(yīng)。1.m.和
1.n.免疫的血清IgG滴度分別是6.5 X IO5和4.0 X105。有趣的觀察結(jié)果是，可溶性4.M2e蛋白當(dāng)用鞭毛蛋白VLP作為佐劑時(shí)誘導(dǎo)較高水平的血清IgG滴度(對(duì)于1.m 8.2X105，對(duì)于1.η 6.4Χ 105，幾何平均值)，證明顆粒形式的FliC的佐劑作用。
[0122]表1.免疫的小鼠組.[0123]
【權(quán)利要求】
1.一種接種受治療者的方法，所述方法包括在使得產(chǎn)生針對(duì)抗原的抗體的條件下，聯(lián)合包含TLR5激動(dòng)劑的病毒樣載體施用所述抗原，其中所述病毒樣載體不包含所述抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原是病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng)衍生的分子。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原包括SEQID NOl的M2e多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抗原包括具有SEQID NO:1中的四個(gè)或多個(gè)連續(xù)氨基酸的M2e多肽。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原是重復(fù)的多肽序列。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述TLR5激動(dòng)劑是膜錨定形式的鞭毛蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述鞭毛蛋白是FliC或其中不存在可變區(qū)的FliC。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述病毒樣載體包括SEQID N0:28的多肽。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中鼻內(nèi)或肌內(nèi)施用所述抗原和病毒樣載體。
10.一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含抗原和包含鞭毛蛋白的病毒樣載體，其中所述病毒樣載體包含TLR5激動(dòng)劑，其中所述病毒樣載體不包含所述抗原。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述抗原是病毒蛋白。
12.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述抗原包括SEQID NO I的M2e多肽。
13.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述抗原包括具有SEQID NO:1中的多個(gè)連續(xù)氨基酸的M2e多肽。
14.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述抗原是重復(fù)的多肽序列。
15.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述TLR5激動(dòng)劑是鞭毛蛋白。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述鞭毛蛋白是FliC或其中不存在可變區(qū)的FliC0
17.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述病毒樣載體包括SEQID N0:28的多肽。
18.一種核酸序列，所述核酸序列編碼SEQ ID NO:28的多肽。
19.一種免疫原性組合物,所述免疫原性組合物包含表面具有流感病毒基質(zhì)蛋白和RSV蛋白而不存在F蛋白或糖蛋白的病毒樣載體，其中所述流感病毒基質(zhì)蛋白是Ml且RSV蛋白是G蛋白或糖蛋白。
20.一種RSV-G病毒樣顆粒，所述RSV-G病毒樣顆粒通過(guò)用編碼RSV-G和流感Ml而非RSV-F基因的rBV感染昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。
21.一種接種受治療者的方法，所述方法包括施用權(quán)利要求19或20所述的免疫原性組合物。
【文檔編號(hào)】C12N15/33GK103945863SQ201280041666
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月1日
【發(fā)明者】理查德·W·康普斯, 汪寶忠, 馬丁·L·摩爾, 權(quán)富希 申請(qǐng)人:愛(ài)默蕾大學(xué), 亞特蘭大兒童醫(yī)療保健公司