專利名稱：一種香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種香菇病毒檢測方法，具體涉及一種香菇dsRNA病毒的RT-PCR弓I物及檢測方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
病毒病是食用菌生產中較為重要的一類病害，與其他病原生物危害不同，其發(fā)生具有潛隱性，可能直到某個生長時期才開始顯癥。香Hentinus edodes (Berk. )sing、是著名的食用菌，其總產量僅次于雙孢蘑菇，為世界第二大菇類。我國是香菇栽培的起源地，也是目前全球最大的香菇產銷集散地。但隨著香菇栽培規(guī)模擴大，近年出現(xiàn)不同程度的香菇病毒病危害，香燕感染病毒后菌絲體生長緩慢，長勢減弱，子實體畸形，質量和產量嚴重下降，在湖北、浙江、福建等地曾較大規(guī)模的爆發(fā)香菇病毒病，給菇農帶來慘重經濟損失，嚴 重威脅香菇產業(yè)的健康發(fā)展。香菇病毒形態(tài)多樣，大小不同，主要包括球形、桿形和蝌蚪狀，以及一些疑似病毒顆粒，其基因組大部分屬于dsRNA。以往利用電子顯微鏡檢測病毒，常常會觀察到組織中感染了大量的不同形狀的病毒顆粒，目的病毒很難被分辨和鑒定。同時由于食用菌病毒通常不顯示癥狀，可能也就不會殼體化，所以必須依賴于檢測到可遺傳的dsRNA，才能證明它們的存在。在最近十幾年中，電子顯微鏡檢測食用菌病毒技術已經逐漸被典型的溴化乙錠熒光染色dsRNA帶型的方法所代替。與電子顯微鏡檢測技術相比，dsRNA分析在分辨形態(tài)上相似、遺傳不同的病毒上以及在分辨病毒和普通細胞成分上具有明顯優(yōu)勢，而且dsRNA分析的敏感度更強、診斷更迅速和可靠。脫毒菌株在活力、抗逆性、產量等方面與帶毒菌株相比體現(xiàn)明顯優(yōu)勢。由于香菇病毒病的研究還比較滯后，目前我們還沒有找到比較有效的方法進行防治，因而提供健康的香菇菌種是保證香菇栽培獲得高產和穩(wěn)產的關鍵。因此建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測方法，為香菇生產提供健康的菌種具有重要的意義，同時為香菇菌種脫毒技術的建立、香菇無病毒品種培育等打下良好的基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物及檢測方法，該方法通過設計香菇病毒基因的特異引物，建立香菇病毒的RT-PCR方法，為方便、快速、有效地檢測香菇菌種是否帶病毒打下基礎。本發(fā)明首先提供了一種香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物，如下
正向引物 Ll-S 5’ -ACCGCAATCAATAACT-3’，
反向引物 Ll-A 5’ -AGACAAGATGGAGACG-3’。其次，本發(fā)明還提供了一種香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測方法，首先提取香菇dsRNA,通過反轉錄成cDNA，然后以反轉錄的cDNA為模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測，RT-PCR產物大小為852bp。所述RT-PCR檢測方法具體包括以下步驟
(I)香菇dsRNA的提??；(2)將提取的香菇dsRNA通過反轉錄成cDNA:在PCR管中加入10 100 ng/ul dsRNAIulUO umol/L反向引物Ll-A O. 3 O. 5 ul、DEPC水8. 5 8. 8 ul，95 100°C保溫5 min,然后迅速放置冰上5 min，再添加 5XRT Buffer 4 ul、10 mmol/L dNTPs O. 5 2 ul、40 U/ul RNA 酶抑制劑 O. 5 ul、100 U/ul 反轉錄酶 M-MLV O. 3 O. 5 ul、DEPC 水 3 4. 7ul，放置PCR儀上，42°C反應I h，70°C滅活10 min，即得到反轉錄的cDNA ；
(3)RT-PCR檢測以反轉錄的cDNA為模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測，PCR擴增體系cDNA模板 I 3 ulUOXPCR Buffer 3 ul，含 15 mmol/L MgCl2,2. 5 mmol/L dNTPsI 2.4 ul、10 umol/L 正向引物 Ll-S O. 5 0. 7 ul、10 umol/L 反向引物 Ll-A 0. 5
0.7 ul、5 U/ul Taq DNA 聚合酶 0. 3 0. 6 ul，用 DEPC 水補足至 30 ul ;
PCR 反應條件95°C 5min ；95°C 45second,48. 5°C 45second, 72°C lmin，30 個循環(huán)；72 °C IOmin ；
(4)RT-PCR產物的檢測結果根據電泳檢測的DNA圖譜，若擴增出分子量為852bp的 特異DNA條帶標記為香菇菌株帶有dsRNA病毒，若未擴增出特異DNA條帶則表示不攜帶dsRNA病毒。本發(fā)明提供的利用RT-PCR檢測香菇病毒的方法，與電鏡檢測病毒、dsRNA檢測病毒和酶學檢測病毒相比，具有靈敏度高、檢測時間短、檢測結果可靠、容易判斷、重復性好等優(yōu)點。具體如下
I、電鏡檢測病毒時，病毒必須以粒子的形式出現(xiàn)才能被觀察到，受時機的限制；此外，分離香菇病毒粒子難度較大，而且需要多種純化、濃縮設備，以及大型電子顯微鏡觀察，一般的生產、研究單位難以進行。2、王麗等在文獻(香菇菌株的dsRNA檢測，食用菌學報2009.)中對香菇菌株dsRNA病毒進行了檢測，雖然大多供試菌株都檢測到dsRNA的存在，但擴增到的dsRNA條帶的大小和數(shù)量有所不同的。且應用dsRNA檢測病毒時，受提取質量和濃度的影響，在dsRNA提取過程中常含有其它的RNA，通過凝膠電泳的檢測結果時往往表現(xiàn)出條帶不清或缺失，重復性和靈敏度較差。3、酶學檢測病毒受酶的性質和提取樣品量所限制，此外用同工酶檢測病毒時費時又費人力。4、以香菇病毒基因組建立的RT-PCR檢測方法，檢測時間較短、靈敏度高(檢測體系只需要IOng的dsRNA就可清晰檢測出，用病毒特有引物進行反轉錄，增強了特異性和提高檢測結果的可靠性)、檢測結果可靠、容易判斷、重復性好等優(yōu)點。基因是遺傳的物質基礎，不易受外界因素等的影響，同時得到的檢測圖譜具有特異性條帶852bp，其顯性標記判斷一目了然。本發(fā)明為香菇生產提供無病毒的菌種，提供可靠的檢測方法，并對香菇菌種脫毒技術的建立、香菇無病毒品種培育等方面有較大的應用價值。


圖I為使用引物Ll-S與Ll-A檢測香菇菌株擴增的DNA圖譜，其中M 7為泳道編號；左側的數(shù)字表示DNA片段的分子量，泳道M為DL2000的Mark，泳道I 7為帶病毒的香菇菌株，標記片段為852bp。圖2為使用引物Ll-S與Ll-A檢測香菇菌株擴增的DNA圖譜，其中M 13為泳道編號；左側的數(shù)字表示DNA片段的分子量，泳道M為DL2000的Mark，泳道8為帶病毒的香燕菌株，標記片段為852bp,泳道9 13為經脫毒后的香燕菌株,未檢測到852bp的標記片段。
具體實施例方式RT-PCR檢測方法具體包括以下步驟
(1)香菇dsRNA的提取；
(2)將提取的香菇dsRNA通過反轉錄成cDNA；
以RT反應前的保溫溫度和RT反應體系中的dsRNA濃度、反向引物濃度、dNTPs濃度、反轉錄酶M-MLV酶量等為參數(shù),對各參數(shù)的RT反應進行逐一優(yōu)化,得到香燕dsRNA的RT反應體系參數(shù)范圍如下10 100 ng/ul dsRNA、反向引物O. 15 O. 25 umol/ L、dNTPs 025 I mmol/L、反轉錄酶M-MLV 2. 5 7. 5 U/ul、保溫溫度95 100°C。經過優(yōu)化，能夠擴增出·清晰的特異條帶。(3)RT_PCR檢測以經RT反應得到的cDNA為模板，對PCR擴增體系里的cDNA添加量、Mg2+濃度、dNTPs濃度、正反向引物濃度、Taq DNA聚合酶酶量等參數(shù)進行逐一優(yōu)化，得到PCR最佳擴增體系的各參數(shù)范圍是cDNA模板I 4 ul、Mg2+濃度I. 5 2. 5 mmol/L、dNTPs 濃度 O. 12 O. 2 mmol/L、引物濃度 O. 13 O. 23 umol/ L、Taq 酶酶量 0. 07 0. IU/ul.經過優(yōu)化，能夠擴增出清晰的特異條帶。為了充分公開本發(fā)明的一種香菇病毒的檢測方法，以下結合實施例加以說明。實施例I :一種香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測方法 一種香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測方法，包括以下步驟
一、香菇病毒RT-PCR檢測弓I物的設計
根據已發(fā)表的香燕病毒序列edodes mycovirus HKB gene (AB429556. 2),
應用Primer5或其它引物設計軟件，得到香菇病毒RT-PCR的檢測引物。該引物的特點是對香菇病毒基因有特異擴增位點，得到的片段大小為852bp。香菇病毒RT-PCR引物如下Ll-S 5’ -ACCGCAATCAATAACT-3，，
Ll-A 5，-AGACAAGATGGAGACG -3'二、香菇病毒的dsRNA的提取
對不正常香菇菌種或發(fā)生病毒病的香菇菌種(王麗等，香菇菌株的dsRNA檢測，食用菌學報2009.)、經脫毒后的香菇菌種進行菌絲培養(yǎng)與收集，提取香菇的dsRNA。(I)香菇菌種菌絲體的培養(yǎng)與收集
1、在無菌操作下，將香菇菌種轉接于PDA斜面，25°C恒溫培養(yǎng)13d-15d；
2、在無菌操作下，用接種耙耙碎轉接好的香菇菌種，轉接入250ml三角瓶，含100 mlPDA液體培養(yǎng)基中；
3、放在25°C恒溫箱靜置培養(yǎng)20d-25d ；
4、戴上一次性手套，把三角瓶中培養(yǎng)好的香菇菌絲體，倒入兩層紗布中過濾，用鑷子或鑰匙挑除未消耗的瓊脂塊，無菌水沖洗，濾紙吸干；
5、稱取0.5 Ig菌絲，用濾紙包好，直接用來提取病毒dsRNA或_20°C保存?zhèn)溆谩?2 )香菇的dsRNA提取I、把收集好的香菇菌絲放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末；
余下步驟參考文獻(郭靈芳，張長青，魯紅學，等.一種簡單快速的食用菌病毒dsRNA提取方法[J].實驗技術與管理，2010，27 (12) :51 53，57.)
三、RT-PCR檢測建立
提取的香菇dsRNA通過反轉錄成cDNA，以轉錄的cDNA為模板，建立香菇病毒的RT-PCR檢測。(I)香菇 dsRNA 的 RT 反應
最佳的RT反應條件為在PCR管中加入100 ng/ul dsRNA IulUO umol/L反向引物Ll-A I. 5 ul、DEPC水7. 5 ul，95°C保溫5 min，然后迅速放置冰上5 min。再添加5 X RTBuffer 4 ul、10 mmol/L dNTPs I ul、40 U/ul RNA 酶抑制劑 0. 5 ul、100 U/ul 反轉錄酶M-MLV 0.5 ul、DEPC水5ul，放置PCR儀上，42°C反應I h，70°C滅活10 min，即得到反轉錄 的 cDNA。(2) PCR 擴增
PCR最佳擴增體系為:cDNA模板2 ulUOXPCR Buffer 3 ul(含 15 mmol/L MgCl2)'2.5 mmol/L dNTPs I. 5 ul、10 umol/L 引物 Ll-S 5，-ACCGCAATCAATAACT-3，0· 48 ul、10umol/L 引物 Ll-A 5’-AGACAAGATGGAGACG -3’0.48 ul、5 U/ul Taq DNA 聚合酶 0.24 ul,用DEPC水補足至30 ul。PCR 反應條件95°C 5min ；95°C 45second,48. 5°C 45second, 72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C IOmin。四、PCR擴增產物檢測
具體檢測方法為，取PCR擴增產物8 ul加上I. 5 ul 6 X溴酚藍上樣緩沖液，混勻，在I. 0%瓊脂糖凝膠,含Goldview DNA染料進行電泳,5V/cm恒壓電泳50 min,通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照像?；蛘?，取PCR擴增產物8 ul，與1.5 ul 6X溴酚藍上樣緩沖液混勻，點樣于1%的瓊醋糖凝膠上，于0. 5 X TBE緩沖液中，5V/cm恒壓電泳0. 5 lh，電泳結束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。PCR擴增產物檢測結果是含有香菇dsRNA病毒的菌種可特異擴增出852bp的單一片段，如圖I所示，若香菇菌種沒有帶此dsRNA病毒的則擴增不出片段，如圖2所示。試驗結果證明，用引物Ll-S 5’ -ACCGCAATCAATAACT-3’ 和引物 Ll-A5’ -AGACAAGATGGAGACG -3’對帶dsRNA病毒的香菇菌株進行RT-PCR檢測時，可檢測到一條852bp的條帶，而經脫毒的香菇菌株則檢測不到這一條帶。本發(fā)明的利用RT-PCR檢測香菇菌株是否帶dsRNA病毒的方法，其檢測時間短、靈敏度高、檢測結果可靠、容易判斷。本發(fā)明所使用的主要培養(yǎng)基、試劑和儀器如下(所有化學試劑均為分析純)
1、PDA斜面培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然，121°C滅菌30min;
2、PDA液體培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，水1000 mL，pH自然，121°C滅菌30min;
3、一步 RT-PCR 試劑盒(RevertiAid First Strand cDNA Synthesis Kit)購自Fermentas 公司;
4、0.5XTBE:44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3>I mmol/L EDTA ；
5、上樣緩沖液0.1%溴酚藍，40%蔗糖；6、EB10 mg/ml 溴化乙錠； 7、PCR擴增試劑購自大連寶生物公司。
權利要求
1.一種香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物，其特征在于所述RT-PCR引物如下正向引物 Ll-S 5’ -ACCGCAATCAATAACT-3’，反向引物 Ll-A 5’ -AGACAAGATGGAGACG-3’。
2.一種香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于首先提取香菇dsRNA，通過反轉錄成cDNA，然后以反轉錄的cDNA為模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測，RT-PCR產物大小為852bp。
3.根據權利要求2所述的香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述RT-PCR檢測方法具體包括以下步驟 (1)香菇dsRNA的提?。? (2)將提取的香菇dsRNA通過反轉錄成cDNA:在PCR管中加入10 100 ng/ul dsRNAIulUO umol/L反向引物Ll-A O. 3 O. 5 ul、DEPC水8. 5 8. 8 ul，95 100°C保溫5 min,然后迅速放置冰上5 min，再添加5XRT Buffer 4 ul、10 mmol/L dNTPs O. 5 2 ul、40 U/ul RNA 酶抑制劑 0.5 ulUOO U/ul 反轉錄酶 M-MLV O. 3 O. 5 ul、DEPC 水 3 4. 7ul，放置PCR儀上，42°C反應I h，70°C滅活10 min，即得到反轉錄的cDNA ;其中反向引物Ll-A為.5， -AGACAAGATGGAGACG-3，； (3)RT-PCR檢測以反轉錄的cDNA為模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測，PCR擴增體系cDNA 模板 I 3 ulUO XPCR Buffer 3 ul，含 15 mmol/L MgCl2,2. 5 mmol/LdNTPs I 2.4 ul、10 umol/L 正向引物 Ll-S O. 5 0. 7 ul、10 umol/L 反向引物 Ll-A.0.5 0. 7 ul、5 U/ul Taq DNA聚合酶0. 3 0. 6 ul，用DEPC水補足至30 ul ;其中正向引物 Ll-S 為 5’ -ACCGCAATCAATAACT-3’，反向引物 Ll-A 為 5’ -AGACAAGATGGAGACG-3’ ；PCR 反應條件95°C 5min ；95°C 45second,48. 5°C 45second, 72°C lmin，30 個循環(huán)；.72 °C IOmin ； (4)RT-PCR產物的檢測結果根據電泳檢測的DNA圖譜，若擴增出分子量為852bp的特異DNA條帶標記為香菇菌株帶有dsRNA病毒，若未擴增出特異DNA條帶則表示不攜帶dsRNA病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香菇病毒檢測方法，具體涉及一種香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物及檢測方法，屬于生物技術領域。所述RT-PCR引物見SEQNO.1-2，檢測方法首先提取香菇dsRNA，通過反轉錄成cDNA，然后以反轉錄的cDNA為模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR檢測，RT-PCR產物大小為852bp。本發(fā)明檢測時間較短、靈敏度高(檢測體系只需要10ng的dsRNA就可清晰檢測出，用病毒特有引物進行反轉錄，增強了特異性和提高檢測結果的可靠性)、檢測結果可靠、容易判斷、重復性好等優(yōu)點?；蚴沁z傳的物質基礎，不易受外界因素等的影響，同時得到的檢測圖譜具有特異性條帶852bp，其顯性標記判斷一目了然。
文檔編號C12Q1/68GK102888470SQ20121042345
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權日2012年10月30日
發(fā)明者吳小平, 劉新銳, 郭杰, 謝寶貴 申請人:福建農林大學