專利名稱：日本沼蝦MnRXR基因、其擴(kuò)增引物組及擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及日本沼蝦MnRXR基因、其擴(kuò)增弓丨物組及擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
維甲酸X受體(RXR,retinoid x receptor)是動物核受體(nuclear receptor)超家族最保守的成員之一，在脊椎動物和無脊椎動物中都有發(fā)現(xiàn)。RXR具有重要的生物學(xué)功能，在脊椎動物發(fā)育、代謝、細(xì)胞分化、凋亡等多個(gè)生物學(xué)過程都發(fā)揮重要作用，而在無脊椎動物中主要與脫皮激素受體(ecdysteroid receptor, ECR)作用形成異源二聚體,脫皮激素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與之結(jié)合形成有功能的形式從而調(diào)控下游一系列蛻皮相關(guān)的基因的表達(dá)，最終觸發(fā)動物的蛻皮反應(yīng)。RXR-ECR異源二聚體是甲殼類等蛻皮分子信號途徑必不可少的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。 日本沼奸(Macrobrachium nipponense),俗名青奸，河奸，隸屬甲殼綱(Crustacean)、十足目(Decapoda)、長臂蟲下科(Palaemonidae)、沼蟲下屬(Macrobrachium),在中國各地都有分布,是我國重要的淡水養(yǎng)殖種類。與高等動物的連續(xù)生長不一樣，甲殼類動物的生長是跳躍式的，每蛻皮一次體重增長近一倍，蛻皮對甲殼類動物生長極為重要。探求蝦蟹蛻皮的分子機(jī)制，掌握其中的主要變化，對經(jīng)濟(jì)蝦蟹類養(yǎng)殖獲得更高的產(chǎn)量具有重要的指導(dǎo)意義。目前，有幾種奸蟹類RXR基因已被克隆，包括-Marsupenaeus Japonicas^Fenneropenaeus chinensis^ Crangon crangon 等，而日本沼奸的 RXR 基因(這里命名為MnRXR')還未見報(bào)道。我們利用 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)克隆技術(shù)克隆了日本沼蝦基因全長cDNA，并發(fā)現(xiàn)基因有兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和ifo/MTP-&這些結(jié)果對了解日本沼蝦的蛻皮過程具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供日本沼蝦ifo/MTP基因、其擴(kuò)增引物組及擴(kuò)增方法。本發(fā)明所述的日本沼蝦基因，有兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和ifo/MTP-S，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增日本沼蝦基因，包括兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和ifo/MTP-S的引物組，M7TMTP-Z和共用一組擴(kuò)增引物，其由如下引物組成
3'正向外引物3aMnRXR-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示;
3'正向內(nèi)引物3aMnRXR-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示;
5'反向外引物5aMnRXR-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示;
5'反向外引物5aMnRXR-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。本發(fā)明還提供了一種擴(kuò)增日本沼蝦基因，包括兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和MnRXR-S的方法，包括如下步驟
步驟1:獲得日本沼蝦肝胰腺組織的總RNA ；步驟2 :從日本沼奸高通量測序數(shù)據(jù)庫(NCBI accession number SRA051767. 2)中篩選到基因片段，以此作為中間序列；
步驟3 :以步驟I所得總RNA為模板，以所述的引物組為引物，通過PCR擴(kuò)增獲得日本沼蝦MnRXR基因的3'和5'端片段；
步驟4 :將所述基因中間序列、所述基因的3'和5'端片段拼接，即得。作為優(yōu)選，步驟4所述擴(kuò)增為套式兩輪PCR。對所得序列用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行blastx在線分析,與JfoTPiTP序列一致性(Sequencesproducing significant alignments )最高的前100個(gè)序列都是RXR或RXR在昆蟲中的同源蛋白超氣門蛋白(ultrspiracle, USP),其中前12個(gè)序列分別是七種不同的蟲下蟹類Crangon crangon、Uca pugila tor^Marsupenaeus japonicus、Fenneropenaeus chinensis.、Carcinus maenas.、Homarus americanus 取 Gecarcinus lateralis 白勺 RXR (包f舌不同白勺異型體或可變剪切體)，顯著性檢驗(yàn)達(dá)到極大(e〈2xl0_18°)，可以確定所得序列為日本沼蝦RXR 基因。日本沼蝦基因推測的氨基酸序列具有典型的RXR核受體序列特征，包括N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DBD)，主要有C2C2鋅指結(jié)構(gòu)組成，C端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ligand binding domain, LBD)。使用Clustalx1. 81將日本沼蝦MnRXR基因，包括兩種可變剪切體MnRXR-L和ifo/MTP-S所編碼的氨基酸序列與已公布的部分蝦蟹類RXR氨基酸序列進(jìn)行比對，使用MEGA3.1軟件計(jì)算遺傳距離，結(jié)果顯和ifo/PZ/P-5·與一種褐奸(Oaflgo/ crangon)相似度最高(89. 1%)。通過對日本沼蝦MnRXR基因，包括兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和MnRXR-S所編碼的氨基酸序列與其他物種RXR氨基酸序列利用Clustalx1. 81軟件進(jìn)行序列比對分析和使用MEGA3.1軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1)，由系統(tǒng)發(fā)育樹可見，甲殼類RXR聚類在一個(gè)大的分支上。本發(fā)明以日本沼蝦肝胰腺組織為材料，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nested-PCR)、3,端cDNA快速擴(kuò)增(3' RACE)以及Y端cDNA快速擴(kuò)增(5' RACE)的方法，對日本沼蝦MnRXR基因進(jìn)行了研究，首次從日本沼蝦肝胰腺組織中克隆到了 MnRXR基因全長cDNA序列，包括兩種可變剪切體MnRXR-L和MnRXR-S，并對其所編碼的MnRXR的序列特征、同源性、進(jìn)化地位及表達(dá)譜進(jìn)行了分析，確定其為日本沼蝦RXR基因，這些結(jié)果對了解日本沼蝦的蛻皮過程具有重要意義。


圖1不同種類的動物RXR核受體的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹；
圖2基因兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和ifo/MTP-S的PCR驗(yàn)證；
圖3 Μη/PXR基因在蛻皮周期受誘導(dǎo)表達(dá)，A :肝臟組織；B :肌肉組織；
圖4 基因兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和在蛻皮周期過程中不同的表達(dá)情況，A :肝臟組織；B :肌肉組織。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
本發(fā)明中日本沼蝦由無錫太湖漁民提供，試劑均可由市場購得，RNA純化等試劑購自美國Promega公司等，3' RACE和5' RACE試劑盒購自寶生物(大連)有限公司(Takara)?？俁NA提取取IOOmg日本沼蝦肝胰腺組織在研缽中加液氮研磨，用Trizol法提取總RNA, Trizol試劑采用Invitrogen公司，提取方法根據(jù)使用說明書。日本沼蝦基因全長cDNA序列的克隆，包括兩個(gè)可變剪切體ifo/MTP-Z和MnRXR-S
以公開的甲殼動物Daphnia magna的RXR-1ike蛋白序列(GenBank accessionnumber :ABF74729.1)為比對模板,blastx 日本沼奸Roche 454測序數(shù)據(jù)庫(NCBI Sequence
Read Archive accession number :SRA051767. 2),閾值取 e=lxlCT5。,篩選到唯--條序列，
以此序列作為基因的中間序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因的3'和5'端片段的特異性引物組，用于3'端和5'端快速擴(kuò)增，得到日本沼蝦ifo/MTP基因全長cDNA序列。MnRXR 基因 cDNA 3'端快速擴(kuò)增(3' RACE )
根據(jù)ifo/MTP基因部分序列，設(shè)計(jì)特異性3'正向外引物3aMnRXR-Fl和3'正向內(nèi)引物3aMnRXR-F2，其中，3 ^正向外引物3aMnRXR_Fl與3' RACE試劑盒中提供的3 ' RACEOuter Primer組成引物對進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物用3'正向內(nèi)引物3aMnRXR_F2和3丨RACE Inner Primer進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，獲得日本沼蝦MnRXR基因的3’端片段；3aMnRXR-Fl 5/ AATACACTCGCACAACCTACCCA 3' (SEQ ID NO. 3)
3aMnRXR-F2 5/ GGTCCCAACACCAATAATCCTTC 3' (SEQ ID NO. 4)
3' RACE Outer Primer 5/ TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 3'
3' RACE Inner Primer 5/ CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG 3'
反轉(zhuǎn)錄 按照3' RACE試劑盒中的使用說明書進(jìn)行，獲得3'反轉(zhuǎn)錄液，反應(yīng)體系如下:
權(quán)利要求
1.一種日本沼蝦ifo/MTP基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO. 2所示。
2.用于PCR擴(kuò)增如權(quán)利要求1所述的日本沼蝦ifo/MTP基因的引物組，其特征在于其由如下引物組成 3'正向外引物3aMnRXR-Fl :序列如SEQ ID NO. 3所示； 3'正向內(nèi)引物3aMnRXR-F2 :序列如SEQ ID NO. 4所示； 5'反向外引物5aMnRXR-Rl :序列如SEQ ID NO. 5所示； 5'反向外引物5aMnRXR-R2 :序列如SEQ ID NO. 6所示。
3.一種擴(kuò)增如權(quán)利要求1所述的日本沼蝦ifo/MTP基因的方法，其特征在于包括如下步驟 步驟1:獲得日本沼蝦肝胰腺組織的總RNA ； 步驟2 :從日本沼奸高通量測序數(shù)據(jù)庫(NCBI accession number SRA051767. 2)中篩選到ifo/MTP基因片段，以此作為中間序列；步驟3 :以步驟I所得總RNA為模板，以如權(quán)利要求2所述的引物組為引物，通過PCR擴(kuò)增獲得日本沼蝦基因的Y和Y端片段；步驟4 :將所述基因中間序列、所述基因的3'和5'端片段拼接，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3所述擴(kuò)增為套式兩輪PCR。
全文摘要
本發(fā)明公布了日本沼蝦MnRXR基因、其擴(kuò)增引物組及擴(kuò)增方法。利用本發(fā)明提供的引物組從日本沼蝦肝胰腺組織中克隆到了MnRXR基因全長cDNA序列，該基因包括兩種可變剪切體MnRXR-L和MnRXR-S。本發(fā)明對日本沼蝦MnRXR基因功能尤其在蛻皮周期中的重要作用的研究奠定重要基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/11GK102994510SQ20121042269
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者沈懷舜, 周鑫, 柏愛旭, 任秀芳 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心