專利名稱：一種頭孢菌素c的發(fā)酵方法
技術領域：
本發(fā)明涉及頭孢菌素C的發(fā)酵方法。
背景技術：
頭孢菌素C由頂頭孢霉(Cephalosporium acremonium)產生,是繼青霉素之后又一重要的內酰胺抗生素，其結構與青霉素的結構相似，有一?；鶄孺溑c一雙環(huán)母核上的氨基相接，與青霉素一樣都具有一個四元內酰胺環(huán)，但頭孢菌素C具有六元二氫噻嗪環(huán)，代替了青霉素特征五元噻唑環(huán)。頭孢菌素C的分子式C16H21O8N3S,分子量為415. 4，結構式 為
H
匪2 O o#-NY^cH2OCOCH3
COOH
O頭孢菌素類抗生素由于其抗菌譜廣和過敏性弱的特點，是臨床上廣泛使用的消炎、抗菌藥物。頭孢菌素C是生產各種注射用半合成頭孢菌素的基本原料。頭孢菌素C是頂頭孢霉菌的次級代謝產物，在其合成過程中，需要補充足夠的碳源。葡萄糖是常用的碳源，但是糖類物質會抑制頭孢菌素C合成的關鍵酶，進而影響其正常合成。油脂則有利于頭孢菌素C前提氨基酸的合成，進而可以促進頭孢菌素C的合成，但其難溶于發(fā)酵液，過高濃度的油脂會導致發(fā)酵液供氧速率降低，因此會影響到菌體的生長，最終導致產物得率下降。補充合適的碳源，是決定頭孢菌素C產量極為關鍵的因素。郭元昕等，“豆油對頭孢菌素C發(fā)酵影響的初步研究”，中國抗生素雜志，2010，35( 10): 747-750研究發(fā)現(xiàn)，用頂頭孢霉AC0508菌株發(fā)酵制備頭孢菌素C，發(fā)酵培養(yǎng)基(％):葡萄糖I. 67，KH2PO4 O. 4，(NH4) SO4
O.8，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 O. 005, CaCO3 1，發(fā)酵 140h，在 72h，84h，96 三個時間添加點中，以 72h 添加豆油為最佳，72h的豆油添加以O. 8%的添加效果最好，制備的頭孢菌素C效價約為18000U/
mLo現(xiàn)有文獻報道的發(fā)酵方法制備的頭孢菌素C的效價低，難以滿足工業(yè)化應用的需求。

發(fā)明內容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的頭孢菌素C的發(fā)酵方法。本發(fā)明頭孢菌素C的發(fā)酵方法，它包括如下步驟(I)取頂頭孢霉，制備一級種子、二級種子；(2)取步驟(I)制備的二級種子，接種至頂頭孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，在發(fā)酵過程的以下時間段內補入葡萄糖和植物油，工藝如下葡萄糖40-80h,流加4-llg/L · h ;80_140h,流加 9_21g/L · h ；植物油50_90h，流加l-6g/L · h ;90_140h，流加 3_8g/L · h ；(3)將步驟(2)所得發(fā)酵液過濾，得上清，分離純化，即得頭孢菌素C。其中，步驟(I)所述頂頭孢霉是保藏號為ATCC 36225的頂頭孢霉。其中，步驟(I)中一級種子和二級種子按照本領域常規(guī)方法即可制備得到，其中，活化后用于制備一級種子的頂頭孢霉菌液濃度應不小于25% (mg/ml)。其余步驟可以按照冀志霞等，“頭孢菌素C發(fā)酵過程代謝特征”，華東理工大學學報(自然科學報2006-11第32卷1275-1279)第I. 2. 6三級發(fā)酵記載的方法制備；也可按如下方法制備a、一級種子取頂頭孢霉，按照1-2% (v/v)接種量接種至種子培養(yǎng)基，在pH為6. 5-7. 5、27-29°C培養(yǎng)50-65h，所述種子培養(yǎng)基含有如下成分玉米漿20-30重量份、葡萄糖13-20重量份、蔗 糖10-20重量份、植物油35-50體積、碳酸鈣1-1. 5重量份、消沫劑O. 5-1. O體積份；b、二級種子取一級種子，按照8-10% (v/v)接種量接種至種子培養(yǎng)基，在pH為6. 0-7. 0,27-29°C培養(yǎng)50-65h，所述種子培養(yǎng)基含有如下成分為玉米漿16-25重量份、花生粉4_7重量份、黃豆粉4-7重量份、硫酸鈣5-10重量份、葡萄糖6-10重量份、植物油40-50體積份、碳酸鈣
4-7重量份、消沫劑O.5-1重量份。其中，步驟(2)所述發(fā)酵的條件是發(fā)酵時間140h ;發(fā)酵溫度0_40h為28°C，40-140h 為 24-25 °C ;發(fā)酵 pH 為 5. 5-5. 8。其中，步驟(2)所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下成分玉米漿40-75重量份、花生粉10-20重量份、葡萄糖5-12重量份、水解淀粉20-30重量份、甲硫氨酸3-8重量份、植物油50-70體積份、消沫劑I. 5-3體積份、MgSO4 2-5重量份、(NH4)2SO4 8-15重量份、FeSO4 O. 05-0. I重量份、MnSO4 O. 01-0. 04 重量份、ZnSO4 O. 01-0. 04 重量份、CuSO4 O. 01-0. 04 重量份、CaCO3
5-10重量份。前述重量份與體積份的比值為g/mL。優(yōu)選地，步驟(2)中補入葡萄糖的工藝40_80h，流加5-10g/L-h ;80_140h，流加10-20g/L · h ;補入植物油的工藝50-90h，流加 2-5g/L · h ;90_140h，流加 4_7g/L · h。進一步優(yōu)選地，補入葡萄糖的工藝40_80h，流加10g/L · h ;80_140h，流加20g/L · h ;補入植物油的工藝50-90h,流加5g/L · h ;90_140h,流加6g/L · h。進一步優(yōu)選地，補入葡萄糖的工藝40_80h，流加9g/L · h ;80_140h，流加18g/L · h ;補入植物油的工藝50-90h,流加2g/L · h ;90_140h,流加4g/L · h。前述植物油為大豆油或者玉米油。本發(fā)明的發(fā)酵方法制備得到的頭孢菌素C的效價達到了 2870(T41200U/mL，顯著高于現(xiàn)有技術制備得到的頭孢菌素C，可以大幅降低生產成本，具有良好的應用前景。顯然，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式本發(fā)明效價按照劉雪惠等，“利用HPLC方法快速測定發(fā)酵液中頭孢菌素C效價”，黑龍江醫(yī)藥1996年第9期第138-139頁記載的方法測定。實施例I本發(fā)明頭孢菌素C的發(fā)酵方法I、發(fā)酵方法(I)制備一級種子—級種子培養(yǎng)基玉米衆(zhòng)20g、葡萄糖13g、鹿糖10g、植物油35ml、碳酸|丐lg、消沫劑 O. 5ml。 取保藏號為ATCC 36225的頂頭孢霉，活化，取濃度為25% (mg/ml)的菌液按照1%(v/v)接種量接種至種子培養(yǎng)基，在pH為7. 0、27°C培養(yǎng)50h。(2)制備二級種子二級種子培養(yǎng)基玉米漿16g、花生粉4g、黃豆粉4g、硫酸鈣5g、葡萄糖6g、植物油40ml、碳酸I丐4g、消沫劑O. 5g。取一級種子，按照8%(v/v)接種量接種至種子培養(yǎng)基，在pH為6. 5、27°C培養(yǎng)50h。(3)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基玉米漿50g、花生粉15g、葡萄糖Sg、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油 55ml、消沫劑 2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 O. 09g、MnSO4 0. 03g、ZnSO4 0. 025g、CuSO4 0. 025g、CaCO3 6g。取步驟(2)制備的二級種子，按照18% (v/v)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵 140h,0-40h 為 28°C,40-140h 為 24。。，pH 為 5. 6。期間，補入葡萄糖和植物油補入葡萄糖(葡萄糖的濃度為100g/L)的工藝為40_80h，流加10g/L -h ;80_140h，流加 20g/L · ho補入大豆油的工藝為50_90h,流加5g/L · h ;90_140h,流加6g/L · h。(4)發(fā)酵結束后取發(fā)酵液通過微孔濾膜過濾，得濾液。效價檢測取ImL濾液于50mL的容量瓶中加水至刻度搖勻，制備得到頭孢菌素C混合液，取制得的頭孢菌素C，分別檢測其效價；(5)分離純化將步驟(4)的濾液用吸附劑型大孔樹脂吸附，飽和的大孔樹脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯(或丙酮)溶液用陰離子樹脂進行吸附，飽和的陰離子樹脂用醋酸鈉進行解吸附，得到的醋酸鈉溶液進行干燥，然后進行結晶反應，用乙醇洗滌、干燥，最后得到頭孢菌素C鋅鹽。2、結果檢測結果見表I :表I菌濃度與頭孢菌素C的效價
權利要求
1.一種頭孢菌素C的發(fā)酵方法，其特征在于它包括如下步驟 (1)取頂頭抱霉，制備一級種子、_■級種子； (2)取步驟(I)制備的二級種子，接種至頂頭孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，在發(fā)酵過程的以下時間段內補入葡萄糖和植物油，工藝如下葡萄糖:40-80h,流力口 4-llg/L h ;80_140h,流力口 9_21g/L h ；植物油50-90h，流加 I-6g/L h ;90-140h，流加 3_8g/L h ； (3)將步驟(2)所得發(fā)酵液過濾，得上清，分離純化，即得頭孢菌素C。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)所述頂頭孢霉是保藏號為ATCC36225的頂頭孢霉。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中 補入葡萄糖的工藝40-80h,流加 5-10g/L h ;80_140h,流加 10_20g/L h ； 補入植物油的工藝50-90h，流加2-5g/L h ;90-140h，流加4_7g/L h。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于 所述補入葡萄糖的工藝40-80h,流加10g/L h ;80_140h,流加20g/L h ； 所述補入植物油的工藝50-90h,流加5g/L h ;90_140h,流加6g/L h。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于 所述補入葡萄糖的工藝:40-80h,流力口 9g/L h ;80_140h,流力口 18g/L h ； 所述補入植物油的工藝50-90h，流加2g/L h ;90-140h，流加4g/L h。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)所述植物油為大豆油或者玉米油。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)所述發(fā)酵的條件是發(fā)酵時間140h ;發(fā)酵溫度0-40h 為 28°C，40-140h 為 24-25°C ;發(fā)酵 pH 為 5. 5-5. 8。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下成分玉米漿40-75重量份、花生粉10-20重量份、葡萄糖5-12重量份、水解淀粉20-30重量份、甲硫氨酸3-8重量份、植物油50-70體積份、消沫劑I. 5-3體積份、MgSO4 2-5重量份、(NH4) 2S048-15 重量份、FeSO4O. 05-0. I 重量份、MnSO4 0. 01-0. 04 重量份、ZnSO4 0. 01-0. 04 重量份、CuSO4O. 01-0. 04 重量份、CaCO3 5-10 重量份。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種頭孢菌素C的發(fā)酵方法，它包括如下步驟(1)取頂頭孢霉，制備一級種子、二級種子；(2)取步驟(1)制備的二級種子，接種至頂頭孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，在發(fā)酵過程的以下時間段內補入葡萄糖和植物油，工藝如下葡萄糖40-80h，流加4-11g/L·h；80-140h，流加9-21g/L·h；植物油50-90h，流加1-6g/L·h；90-140h，流加3-8g/L·h；(3)將步驟(2)所得發(fā)酵液過濾，得上清，分離純化，即得頭孢菌素C。本發(fā)明頭孢菌素C的發(fā)酵方法操作方便，成本低廉，制備的頭孢菌素C效價高，市場應用前景良好。
文檔編號C12P35/06GK102808011SQ201210310798
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月28日 優(yōu)先權日2012年8月28日
發(fā)明者楊勇, 鄧蕓, 黃海玉, 王利春, 劉思川, 梁隆, 程志鵬 申請人:伊犁川寧生物技術有限公司