專利名稱：一種重組抗opn單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種新的抗OPN單克隆抗體，及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
Osteopontin(OPN)為早期的T淋巴細(xì)胞活化分子I (Etal),是具有多種功能的分泌型糖蛋白。其可能的功能包括參與骨骼代謝，免疫調(diào)節(jié)，創(chuàng)傷愈合，細(xì)胞生存及腫瘤的進(jìn)展。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)及染色體位置，OPN是整合素結(jié)合配體家族成員，為一小分子的N連接糖蛋白(SIBLING)，該家族還包括骨骼唾液酸蛋白(BSP)，牙基質(zhì)蛋白I (DMPl)，牙齒唾液酸磷酸蛋白(DSPP)以及磷酸化糖蛋白細(xì)胞外基質(zhì)(MEPE)。人OPN cDNA編碼314個(gè)氨基酸殘基的前體蛋白，其中包含16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，剪切后形成298個(gè)氨基酸的成熟蛋白。OPN為一高度酸化的多功能域的蛋白，理論分子量約33kDa，但由于高度的糖苷化及磷酸化，其分子量可以達(dá)到75kDa。OPN主要由骨骼、腎臟和上皮組織表達(dá)，但也可在子宮內(nèi)膜組織、內(nèi)皮細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及許多的腫瘤組織中檢測(cè)到。在某些病理過程中組織中OPN的表達(dá)會(huì)上調(diào)，包括動(dòng)脈硬化、瓣膜狹窄、心肌梗塞及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。OPN在數(shù)種生物體液中都可檢測(cè)到，包括人血漿、血清、乳汁及尿液，在某些惡性腫瘤、爆發(fā)性肝炎、結(jié)核及自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化和紅斑狼瘡中其表達(dá)上調(diào)。OPN的活性可通過一系列受體介導(dǎo)，包括許多整合素和透明質(zhì)酸受體⑶44。OPN含有多個(gè)與整合素結(jié)合的功能域。其典型的Arg-Gly-Asp (RGD)位點(diǎn)可與數(shù)種v類型的整合素(vl，v3, v5)及51，81結(jié)合，含有Iopinavir(LPV)的區(qū)域可以結(jié)合41，SVVYGLR位點(diǎn)可以結(jié)合41，47和91。OPN和可以結(jié)合⑶44的變異體，可能通過與整合素的共同作用促進(jìn)細(xì)胞遷移。細(xì)胞內(nèi)的OPN通過與⑶44及ERM(ezrin/radixin/moesin)蛋白的相互作用或是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的⑶44表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞的遷移。OPN及其蛋白酶解產(chǎn)物具有相互調(diào)節(jié)的作用。OPN被凝血酶、MMP-3、MMP-7或MMP-12酶解后產(chǎn)生OPN片段，與完整的OPN具有不同的生物學(xué)功能。例如，凝血酶、MMP-3、 MMP-7酶切后可以增強(qiáng)整合素依賴的細(xì)胞粘附和遷移。反之，OPN通過包括轉(zhuǎn)化/活化前體或是再活化TIMP抑制的酶的機(jī)制活化MMP-2和MMP-3。如其命名，OPN在骨骼的代謝中發(fā)揮一定的作用。在體外，OPN可刺激破骨細(xì)胞向骨骼粘附，如果抑制這種相互作用，則可以阻斷骨骼的再吸收。OPN基因敲除的小鼠骨骼的發(fā)育表觀上是正常的，但表現(xiàn)出出生后某些部位骨骼再吸收的缺陷，因此也支持OPN對(duì)破骨細(xì)胞的作用。OPN還直接參與調(diào)節(jié)礦物晶體的形成及生長。在體內(nèi)和體外，OPN與羥基磷灰石結(jié)合可抑制晶體的形成。炎癥反應(yīng)的介導(dǎo)因子包括LPS，N0，IL-UP TNF均可刺激OPN的表達(dá)。OPN調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的分化和聚集。OPN還具有趨化因子及T細(xì)胞共刺激分子的功能，其可促進(jìn)Thl細(xì)胞因子IL-12的產(chǎn)生。OPN基因敲除的小鼠表現(xiàn)為Thl反應(yīng)的缺陷以及易于發(fā)生細(xì)菌和病毒的感染。但OPN在某些條件下也可抑制炎癥反應(yīng)。如在體外，OPN可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞數(shù)種炎性介質(zhì)的釋放。由于OPN具有重要的生理及病理學(xué)意義，因此，檢測(cè)OPN的血清濃度具有潛在的生理及病理學(xué)意義，所以迫切需要一種能有效、快速檢測(cè)OPN在血清中濃度的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的需要解決的技術(shù)問題之一是提供一種重組的抗OPN單克隆抗體，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明需要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種編碼上述抗OPN單克隆抗體的DNA分子。本發(fā)明需要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種上述單克隆抗體的用途。
本發(fā)明需要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供一種該單克隆抗體的制備方法。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明一方面提供了一種重組的抗OPN抗體，該抗體含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。本發(fā)明另一方面提供了編碼上述單克隆抗體的DNA分子。在一個(gè)較佳的實(shí)例中，該DNA分子含有SEQID NO :3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQID NO 4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明第三方面提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有上述DNA序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。本發(fā)明第四方面提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它被上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。在一個(gè)較佳的實(shí)例中，該宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。本發(fā)明第五反面提供了一種試劑盒，含有重組的抗OPN抗體。本發(fā)明第六方面提供了一種制備上述單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括a)提供一表達(dá)載體,該表達(dá)載體含有上述DNA序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞c)在適合所述單克隆抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細(xì)胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的單克隆抗體能快速、靈敏的檢測(cè)患者血清中OPN的濃度。


圖I :載體pMG18，并且標(biāo)明了其中的元件及酶切位點(diǎn)。圖2 :本發(fā)明所構(gòu)建的PM載體。其中，hCMV pro為人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子；Ck為小鼠輕鏈恒定區(qū)基因；IgGl constant為小鼠、I重鏈恒定區(qū)基因；pA為多聚腺苷化信號(hào)；DHFR為二氫葉酸還原酶基因；AmpR為氨節(jié)青霉素抗性基因。圖3 :本發(fā)明所構(gòu)建的pM(H+L)載體，含有重組抗OPN抗體重鏈全長和輕鏈全長基因。
圖4 :抗OPN單克隆抗體與市售OPN單克隆抗體檢測(cè)OPN靈敏度的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種重組的抗OPN單克隆抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ IDNO: 2所示的氨基酸序列。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個(gè)抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)多克隆抗體制劑(通常是具有針對(duì)不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)來合成的，不會(huì)被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用 任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。本文所用的術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。本文所用的術(shù)語“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個(gè)抗體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)中的三個(gè)片段中。可變區(qū)中較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個(gè)FR區(qū)，它們大致上呈P —折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個(gè)⑶R相連，在某些情況下可形成部分p折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR—起形成了抗體的抗原結(jié)合部位(參見 Kabat 等，NIH Publ. No. 91-3242，卷 I，647-669 頁(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細(xì)胞毒性。單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來制得。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature, 256 :495(1975)首先提出)制得，或用重組DNA方法(美國專利No. 4，816，567)制得。單克隆抗體也可用例如Clackson等，Nature, 352 :624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :581-597(1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離獲得。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明重組抗OPN單克隆抗體的DNA分子。在一個(gè)較佳的實(shí)例中，該DNA分子含有SEQ ID NO :3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID NO :4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。在獲得編碼本發(fā)明重組抗OPN單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列后，通?？赏ㄟ^以下方法來制備本發(fā)明的單克隆抗體。
首先，提供含有編碼本發(fā)明單克隆抗體的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)載體。本文所用的術(shù)語“表達(dá)調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達(dá)的序列。表達(dá)調(diào)控序列包括與目標(biāo)核苷酸序列操作性相連的啟動(dòng)子和終止信號(hào)。它們通常還包括核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列?！安僮餍韵噙B”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段來制得。例如，可根據(jù)本發(fā)明公開的序列人工合成或用PCR法擴(kuò)增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。然后，用本領(lǐng)域熟知的各種方法通過選擇合適的酶切位點(diǎn)將這些核苷酸序列插入合適的表達(dá)載體中，使它們分別在表達(dá)載體所攜帶的重鏈恒定區(qū)編碼序列和輕鏈恒定區(qū)編碼序列之前，并使它們?cè)谕蛔x框內(nèi)。本發(fā)明中所用的表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種市售的表達(dá)載體，例如購自Qiagen和Promega公司的表達(dá)載體，以及可購得的表達(dá)載體pMG 18 (《根據(jù)INCP-9質(zhì)粒序列進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)的工具的開發(fā)》(DEVELOPMENT OF TOOLS FORENVIRONMENTAL MONITORINGBASED ON INCP-9 PLASMIDS SEQUENCES)，A.Created, R. Krasowiak, M.Titok, C. M. ThomasSchool of Biological Sciences,University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B152TT， UKand Faculty of Biology, Dept of Microbiology, Belarus State UniversityScoring Av. 4，Minsk 220080Belarus)。隨后，用上述獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。“宿主細(xì)胞”一般包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明中，較佳的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法有很多種，所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域所知的，其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene (I, 5—二甲基一 I, 5—二氮^ 亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發(fā)明中，較佳的方法是電穿孔法或脂質(zhì)體介導(dǎo)法等。例如可采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒來轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。然后，在適合本發(fā)明單克隆抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞。然后用常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose輕基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的重組抗OPN單克隆抗體。所得單克隆抗體可用常規(guī)手段來鑒定。單克隆抗體的結(jié)合特異性可用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)(如放射性免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來測(cè)定。單克隆抗體的結(jié)合親和力例如可用Munson等,Anal. Biochem. , 107 :220(1980)的Scatchard分析來測(cè)定。下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。實(shí)施例I :從抗體庫中篩選OPN的抗體基因可變區(qū)、
I)鼠源抗體庫的構(gòu)建Osteopontin (購自R&D System)與弗氏佐劑免疫Balb/C小鼠，免疫4次后，小鼠血清I : 500稀釋后與OPN顯強(qiáng)陽性反應(yīng)，取免疫后小鼠脾臟，按照Marks等人J. Mol.Biol.，222，581-597. Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.，227，381-388. Haidaris CG 等人J Immunol Methods. 2001Nov I ；257(l-2) :185-202, Griffiths, A. D.等人 EMBO J. , 13,3245-3260 (1994) .Nissim，A.等人 EMBOJ.，13，692-698 (1994)中描述的方法，構(gòu)建鼠源抗體庫。
2)篩選將復(fù)蘇的抗體庫菌株I毫升加入新鮮LB培養(yǎng)基14毫升，于50毫升三角瓶中37°C培養(yǎng)16小時(shí)。12000rpm高速離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至無菌的50毫升離心管中，保存?zhèn)溆谩４_保其滴度應(yīng)在2 X IO11以上。用純化的OPN作為抗原，用常規(guī)方法包被25毫升細(xì)胞培養(yǎng)瓶。包被后的細(xì)胞瓶中加入不少于3X IOltl噬菌體，37°C溫育I小時(shí)。倒掉瓶中的液體，用10毫升加入了 1% Tween-20的PBS洗滌培養(yǎng)瓶10次。在培養(yǎng)瓶中加入I毫升對(duì)數(shù)期的TGl細(xì)胞，37°C溫育震蕩培養(yǎng)16小時(shí)。重復(fù)上段所述步驟4次。將上述獲得的細(xì)胞稀釋至IO5細(xì)胞/毫升后在加有0. I氨芐青霉素的I. 5%瓊脂平板上培養(yǎng)，獲得單克隆。取上述平板上的克隆在96孔深孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，每孔一個(gè)克隆，共作960個(gè)克隆(10塊96孔板)。將上述深孔板在96孔板離心機(jī)上5000RPM離心20分鐘后，將上清轉(zhuǎn)移到新的無菌深孔板，封口后保藏于4°C備用。取96孔板10塊，每孔中加入OPN (10微克/毫升)10微升常規(guī)包被后，分別加入上述保存的上清10微升，37°C溫育I小時(shí)后用含有I % Tween-20的PBS洗滌20次。加入I微升HRP標(biāo)記的羊抗M13單抗(購自Pharmacia公司)，37°C溫育30分鐘后用I % Tween-20的PBS洗滌10次。加入含有0. 025% DAB顯色劑的PBS 200微升和I微升I %的H2O2, 37°C溫育顯色20分鐘后在讀板機(jī)上讀取595納米處的光吸收。根據(jù)光吸收讀數(shù)確定顯色反應(yīng)強(qiáng)的孔，這些孔相對(duì)應(yīng)的克隆即為親和力較強(qiáng)的抗體可變區(qū)克隆。本試驗(yàn)結(jié)果共篩選出316個(gè)陽性克隆，根據(jù)其讀數(shù)確定其中5個(gè)親和力最強(qiáng)的克隆，用于下一步的研究。3)抗體可變區(qū)編碼序列向表達(dá)載體的克隆使上述5個(gè)克隆的菌株在100毫升LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，然后按照生產(chǎn)商說明書用Promega公司的pMG18質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒純化質(zhì)粒DNA。用XbaI和NheI限制性酶酶切上述質(zhì)粒DNA后在I. 5%瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取357bp左右的帶進(jìn)行膠回收，所得片段即為重鏈可變區(qū)。PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行序列測(cè)定。用XbaI和BsiWI限制性酶酶切上述質(zhì)粒DNA后在I. 5%瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取339bp左右的帶進(jìn)行膠回收，所得片段即為輕鏈可變區(qū)。PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行序列測(cè)定。確定正確序列后，化學(xué)合成法合成輕鏈全長序列，5’端設(shè)計(jì)HindIII酶切位點(diǎn)，恒定區(qū)為小鼠K輕鏈恒定區(qū)序列，3’端設(shè)計(jì)EcoRI酶切位點(diǎn)。PCR法自小鼠脾細(xì)胞擴(kuò)增IgGl重鏈恒定區(qū)序列，并將CHl起始氨基酸突變?yōu)锳la-Ser,同時(shí)含有了 NheI酶切位點(diǎn)，3’端設(shè)計(jì)BamHI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增后測(cè)序驗(yàn)證無誤后，NheI和BamHI雙酶切小鼠IgGl恒定區(qū)片段和pMG18，將小鼠IgGl恒定區(qū)連入pMG18，構(gòu)建的新載體命名為PM，見圖2。用XbaI和NheI限制性酶酶切表達(dá)載體pM。該表達(dá)載體的酶切圖譜如圖2所示。然后將上述重鏈可變區(qū)插入該表達(dá)載體的Xbal/Nhel位點(diǎn)中。同樣，利用HindIII和EcoRI限制性酶將抗體輕鏈全長cDNA插入到pM載體的Hindlll/EcoRI位點(diǎn)中，從而構(gòu)建得到含 有重組抗OPN抗體重鏈全長和輕鏈全長基因的表達(dá)載體pM(H+L)，見圖3。4) CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與重組克隆的篩選上述構(gòu)建的帶有抗體基因的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a菌株中接種于100毫升LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增,用Qiagen公司的超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Ultrapure PlasmidDNA Purification Kit)抽提純化質(zhì)粒DNA。采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒,將上述純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，操作參照廠家的說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞在HAT選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)9周的選擇，最后在96孔板上進(jìn)行極限稀釋培養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行3次，進(jìn)行單克隆化。挑出的單克隆細(xì)胞系在RPMI 1640培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)上清進(jìn)行Western印跡試驗(yàn)，根據(jù)染色反應(yīng)判斷表達(dá)強(qiáng)度，挑選出12個(gè)表達(dá)強(qiáng)的克隆作為候選細(xì)胞株。5)單克隆抗體的純化用Protein A親和層析柱從細(xì)胞培養(yǎng)上清中直接分離純化出上述單克隆抗體,經(jīng)SDA-PAGE電泳證明，所得產(chǎn)物純度大于90%。親和層析的產(chǎn)物再次經(jīng)過分子篩層析，獲得了純度> 98%的樣品。將這些樣品用于以下的進(jìn)一步分析與研究中。實(shí)施例2抗體基因在CHO細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度將上述篩選得到的12個(gè)高表達(dá)候選克隆培養(yǎng)于IOcm的組織培養(yǎng)皿中，如下所述用ELISA法測(cè)定抗體的表達(dá)量。將羊抗鼠IgG(Fc)包被于ELISA板，4°C過夜，經(jīng)2% BSA于37°C封閉2小時(shí)，加入待測(cè)的培養(yǎng)上清和標(biāo)準(zhǔn)品(鼠IgGl)，37°C孵育2小時(shí)，加入HRP 一羊抗鼠IgG (K)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37°C孵育I小時(shí)，加入TMB于37°C作用10分鐘，最后用H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)A45tl值。下表I中顯示了上述篩選獲得的12個(gè)候選克隆的表達(dá)量。表I :候選克隆在CHO細(xì)胞中的表達(dá)量
權(quán)利要求
1.一種重組抗OPN單克隆抗體，它包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
2.—種DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求I所述的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有SEQID NO 3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID NO :4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
4.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的DNA序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
5.一種真核宿主細(xì)胞，其特征在于，它被權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的真核宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的真核宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
7.一種試劑盒，含有權(quán)利要求I所述的重組抗OPN單克隆抗體。
8.一種制備權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括 a)提供一表達(dá)載體,該表達(dá)載體含有權(quán)利要求3所述的DNA序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列； b)用步驟a)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞； c)在適合所述單克隆抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的真核宿主細(xì)胞；和 d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組抗OPN單克隆抗體，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了編碼該單克隆抗體的DNA分子，表達(dá)該單克隆抗體的載體以及被該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供的抗OPN單克隆抗體能快速檢測(cè)血清中OPN的濃度，靈敏度高，特異性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102731656SQ201210211778
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2007年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者李博華, 錢衛(wèi)珠 申請(qǐng)人:上海中信國健藥業(yè)股份有限公司