專利名稱：無dna殘留的rna提取試劑盒及rna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNA提取，屬于核酸純化領(lǐng)域，特別涉及無DNA殘留的無DNA殘留的RNA提取試劑盒及RNA提取方法。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)研究中提取純化RNA是一個(gè)基礎(chǔ)性的工作，各種臨床檢測(cè)或者基礎(chǔ)科研中都需要提取純化RNA。RNA提取純化的一個(gè)難點(diǎn)就是經(jīng)常會(huì)殘留DNA。而殘留DNA導(dǎo)致的RNA純度不高可能對(duì)下游實(shí)驗(yàn)造成不利的影響。目前國(guó)內(nèi)外提取純化RNA的方法過程中去除DNA殘留的主要方法有兩類一類是異硫氰酸胍一步法提取RNA (Trizol法)通過苯酚氯仿有機(jī)分相的方法來去除；另一類是加上DNA酶消化的方法來去除。前一類方法缺點(diǎn)主要是兩點(diǎn)一是使用了苯酚氯仿等毒性物 質(zhì)；二是很多樣品尤其是植物樣品含多糖多酚或者復(fù)雜次級(jí)代謝產(chǎn)物，往往會(huì)干擾苯酚氯仿有機(jī)分相的過程，從而導(dǎo)致無法去除DNA殘留。后一類方法雖然是目前主流的去除DNA殘留的解決方案，但是也有一系列缺點(diǎn)，例如DNA酶消化的操作時(shí)間長(zhǎng)，步驟繁瑣，消化過程中經(jīng)常導(dǎo)致RNA降解，殘留DNA多的情況下常有消化不完全的情況發(fā)生，DNA酶成本也非常高。因此，目前迫切需要一種更好的方法來解決RNA提取純化中DNA的殘留問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種不使用苯酚、氯仿等毒性物質(zhì)的無DNA殘留的RNA提取試劑盒及RNA提取方法，并且能夠有效解決RNA提取純化中的DNA殘留問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的無DNA殘留的RNA提取試劑盒，包括RNA洗脫液、DNA洗脫液、至少一個(gè)與RNA洗脫液配合使用的DNA吸附柱以及至少一個(gè)與DNA洗脫液配合使用的RNA吸附柱。上述無DNA殘留的RNA提取試劑盒，所述RNA洗脫液含有濃度為2-5mol/L的異硫氰酸胍，以及體積分?jǐn)?shù)為0. 5-25%的無水乙醇。上述無DNA殘留的RNA提取試劑盒，所述DNA洗脫液含有濃度為0. 1-lmol/L的異硫氰酸胍，以及體積分?jǐn)?shù)為3-30%的無水乙醇。上述無DNA殘留的RNA提取試劑盒，還包括裂解液和漂洗液。 上述無DNA殘留的RNA提取試劑盒，所述裂解液中含有濃度為2-5mol/L的異硫氰酸胍。上述無DNA殘留的RNA提取試劑盒，所述漂洗液中含有濃度為lO-lOOmmol/L的氯化鈉，以及體積分?jǐn)?shù)為60-80%無水乙醇。上述無DNA殘留的RNA提取試劑盒，所述RNA洗脫液和/或所述DNA洗脫液中含有pH為6. 0 8. 0的Tris-HCl、濃度為5-50mmol/L。Tris-HCl為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知常識(shí)。上述無DNA殘留的RNA提取試劑盒，DNA吸附柱和RNA吸附柱均為硅膜吸附柱。利用上述RNA提取試劑盒的無DNA殘留的RNA提取方法，至少包括如下兩個(gè)步驟A步驟，用RNA洗脫液將DNA吸附柱上的RNA洗脫下來；B步驟，用DNA洗脫液將RNA吸附柱上的DNA洗脫下來。上述無DNA殘留的RNA提取方法，包括如下步驟(I)利用裂解液對(duì)樣品進(jìn)行裂解得到裂解物；(2)將裂解物轉(zhuǎn)入離心管，離心，取上清液，加入上清液的1/2體積的無水乙醇混勻轉(zhuǎn)入DNA吸附柱進(jìn)行吸附離心，離心，棄掉濾液；⑶A步驟，用RNA洗脫液將DNA吸附柱上的RNA洗脫下來將RNA洗脫液加入所述DNA吸附柱，離心，收集濾液；(4)向步驟(3)中得到的濾液中加入其體積的二分之一的無水乙醇混勻后加入RNA吸附柱中，離心，棄掉濾液； (5) B步驟，用DNA洗脫液將RNA吸附柱上的DNA洗脫下來將DNA洗脫液加入RNA吸附柱，離心，棄掉濾液；(6)向RNA吸附柱中加入漂洗液，離心，棄掉濾液；(7)用無核糖核酸酶水洗脫得到RNA洗脫液。 上述無DNA殘留的RNA提取方法，步驟(6)重復(fù)2次或2次以上。上述無DNA殘留的RNA提取方法，步驟(7)重復(fù)2次或2次以上。本發(fā)明的有益效果是傳統(tǒng)的試劑盒均采用一根硅膜吸附柱，整個(gè)提取過程中只有一次RNA吸附先洗脫DNA以將DNA和RNA進(jìn)行分離，然后將RNA洗脫下來得到RNA洗脫液。在實(shí)際操作，只采用一根硅膜吸附柱(一次RNA吸附)的RNA提取方法和試劑盒去除DNA效果不好，殘留DNA多。本發(fā)明采用兩根吸附柱二次RNA吸附RNA洗脫液和DNA吸附柱組合使用可以實(shí)現(xiàn)吸附DNA洗脫RNA，DNA洗脫液和RNA吸附柱組合使用可以實(shí)現(xiàn)吸附RNA洗脫DNA，最后從RNA吸附柱上將RNA洗脫下來得到RNA的方法和試劑盒可以大大提高去除DNA效果，殘留DNA少。裂解液裂解樣品后加入乙醇可以盡可能的將RNA吸附到DNA吸附柱上的同時(shí)減少DNA吸附；RNA洗脫液可以盡可能洗脫RNA的同時(shí)，將DNA保留在DNA吸附柱上從而減少殘留。DNA洗脫液可以選擇性的漂洗去除RNA吸附柱上的DNA而保留RNA。漂洗液漂洗掉蛋白和雜質(zhì)。本發(fā)明綜合利用了兩次硅膜柱吸附RNA和配套優(yōu)化的溶液系統(tǒng)在RNA提取過程中來消除基因組DNA殘留。能夠有效地解決RNA提取純化中基因組DNA殘留問題，和現(xiàn)有的方法和試劑盒相比，不用苯酚、氯仿等毒性物質(zhì)，也不需要乙醇沉淀等步驟，操作更簡(jiǎn)單快速單個(gè)樣品操作一般可在30分鐘內(nèi)完成，大大簡(jiǎn)化了步驟和操作時(shí)間，適應(yīng)性廣泛，可重復(fù)性好，成本大幅度降低。本發(fā)明提取的RNA純度及濃度檢測(cè)完整性RNA用普通瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件膠濃度I. 2% ；0. 5XTBE電泳緩沖液；150v，15分鐘)檢測(cè)完整性。由于細(xì)胞中70% -80%的RNA為rRNA，電泳后UV下應(yīng)能看到非常明顯的rRNA條帶。
純度0D26(i/0D28。比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)。高質(zhì)量的RNA，OD26tlAD280讀數(shù)(lOmMTris，pH7. 5)在I. 8-2. I之間。本發(fā)明提取的RNA的OD26(l/OD28(l典型的比值為
I.9 2. O。


圖I泳道I為標(biāo)記(Marker)，泳道2、3、4是用北京艾德萊生物科技有限公司的RN09EASYspin植物RNA提取試劑盒分別提取的百合花瓣、雌蕊、雄蕊RNA的電泳圖；泳道5、
6、7是實(shí)施例I中分別提取的百合花瓣、雌蕊、雄蕊RNA的電泳圖。圖2泳道8是用北京艾德萊生物科技有限公司的RN09EASYspin植物RNA提取試劑盒提取的草莖干RNA的電泳圖；泳道9是本發(fā)明提取的草莖干RNA的電泳圖
具體實(shí)施例方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明實(shí)施例I.提取百合花瓣、雌蕊、雄蕊的RNA(I)分別取50mg百合花花瓣、50mg百合花雌蕊、50mg百合花雄蕊，并分別與0. 5mL裂解液勻漿，得到裂解物。所述裂解液含有濃度為lOmmol/L、pH為7. 0的Tris-HCl，濃度為3mol/L的異硫氰酸胍。裂解液的制備方法是稱取異硫氰酸胍35. 45克，加入適量無核糖核酸酶水溶解，再加入PH為7. O、濃度為lmol/L的Tris-HCl ImL,混勻，定容到100mL。(2)將裂解物轉(zhuǎn)入離心管，劇烈搖晃振蕩15秒，13000rpm離心5_10分鐘取上清液，加入上清液的1/2體積的無水乙醇混勻轉(zhuǎn)入一個(gè)DNA吸附柱進(jìn)行吸附離心。DNA吸附柱為硅膜吸附柱。(3)向DNA吸附柱中加入0. 5mL RNA洗脫液，13000rpm離心I分鐘將RNA從DNA吸附柱上洗脫后得RNA洗滌液，并丟棄DNA吸附柱。所述RNA洗脫液含有濃度為IOmmol/L、pH為6. 5的Tris-HCl，濃度為3mol/L的異硫氰酸胍和體積分?jǐn)?shù)為2%的無水乙醇。RNA洗脫液制備方法是稱取異硫氰酸胍35. 45克，加入適量無核糖核酸酶水溶解，再加入pH為
6.5、濃度為lmol/L的Tris-HCl ImL和2mL無水乙醇，混勻，定容到IOOmLo(4)向RNA洗滌液中加入RNA洗滌液的1/2體積的無水乙醇混勻轉(zhuǎn)入一個(gè)RNA吸附柱進(jìn)行吸附離心。RNA吸附柱均為硅膜吸附柱。(5)向RNA吸附柱中加入0. 7mLDNA洗脫液，13000rpm離心I分鐘，漂洗RNA吸附柱一次。所述DNA洗脫液含有濃度10mmol/L、pH為7. 5的Tris-HCl，濃度為lmol/L的異硫氰酸胍，體積分?jǐn)?shù)為20%的無水乙醇。DNA洗脫液制備方法是稱取異硫氰酸胍11. 84克，加入適量無核糖核酸酶水溶解，再加入PH為7. 5、濃度為lmol/L的Tris-HCl ImL和20mL無水乙醇,混勻，定容到100mL。(6)加入0. 5mL漂洗液，13000rpm離心I分鐘漂洗RNA吸附柱，共二次。所述漂洗液含有濃度為10mmol/L、pH為7. 5的Tris-HCl，濃度為50mmol/L的氯化鈉，體積分?jǐn)?shù)為80%的無水乙醇。漂洗液制備方法是量取pH為7. 5、濃度為lmol/L的Tris-HCl lmL，再量取濃度為5mol/L的氯化鈉lmL，加入適量無核糖核酸酶水混勻，再加入80mL無水乙醇，混勻，定容到100mL。(7) 30-50 U L無核糖核酸酶的水加入RNA吸附柱，13000rpm離心I分鐘洗脫得到RNA洗滌液。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖I :從圖片可以看出采用本發(fā)明方法提取的百合花瓣、雌蕊、雄蕊RNA殘留DNA明顯減少甚至不可見。實(shí)施例2.提取草莖干的RNA(I)取50mg草莖干與0.5mL裂解液勻漿，得裂解物。所述裂解液含有濃度為10mmol/L,pH為8. 0的Tris-HCl，濃度為4mol/L的異硫氰酸胍。裂解液制備方法是稱取異硫氰酸胍47. 26克，加入適量無核糖核酸酶水溶解，再加入pH為8. O、濃度為lmol/L的Tris-HCl lmL，混勻，定容到 100mL。(2)將裂解物轉(zhuǎn)入離心管，劇烈搖晃振蕩15秒，13000rpm離心5_10分鐘取上清液，加入上清液的1/2體積的無水乙醇混勻轉(zhuǎn)入一個(gè)DNA吸附柱進(jìn)行吸附離心。DNA吸附柱為硅膜吸附柱。(3)向DNA吸附柱中加入0. 5mL RNA洗脫液，13000rpm離心I分鐘將RNA從DNA吸附柱上洗脫后得到RNA洗滌液，并丟棄DNA吸附柱。所述RNA洗脫液含有濃度為IOmmol/ L、pH為7. 5的Tris-HCl，濃度為3mol/L的異硫氰酸胍和體積分?jǐn)?shù)為2%的無水乙醇。RNA洗脫液制備方法是稱取異硫氰酸胍35. 45克，加入適量無核糖核酸酶水溶解，再加入pH為
7.5、濃度為lmol/L的Tris-HCl ImL和2mL無水乙醇,混勻，定容到IOOmLo(4)向RNA洗滌液中加入RNA洗滌液的1/2體積的無水乙醇混勻轉(zhuǎn)入一個(gè)RNA吸附柱進(jìn)行吸附離心。RNA吸附柱均為硅膜吸附柱。(5)向RNA吸附柱中加入0. 7mLDNA洗脫液，13000rpm離心I分鐘，漂洗RNA吸附柱一次。所述DNA洗脫液含有濃度為10mmol/L、pH為7. 5的Tris-HCl，濃度為0. 5mol/L的異硫氰酸胍，體積分?jǐn)?shù)為30%的無水乙醇。DNA洗脫液制備方法是稱取異硫氰酸胍5. 92克，加入適量無核糖核酸酶水溶解，再加入PH為7. 5、濃度為lmol/L的Tris-HCl ImL和30mL無水乙醇,混勻，定容到100mL。(6)加入0. 5mL漂洗液，13000rpm離心I分鐘，漂洗RNA吸附柱二次。所述漂洗液含有濃度為10mmol/L、pH為7. 5的Tris-HCl，濃度為50mmol/L的氯化鈉，體積分?jǐn)?shù)為60%的無水乙醇。漂洗液制備方法是量取PH為7. 5、濃度為lmol/L的Tris-HCl ImL,再量取濃度為5mol/L的氯化鈉ImL,加入適量無核糖核酸酶水混勻,再加入60mL無水乙醇,混勻，定容到100mL。(7) 30-50 u L無核糖核酸酶的水加入RNA吸附柱，13000rpm離心I分鐘洗脫得到RNA0瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2 :從圖片可以看出采用本發(fā)明方法提取的草莖干RNA殘留DNA明顯減少甚至不可見。上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明創(chuàng)造所作的舉例，而并非對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造具體實(shí)施方式
的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造權(quán)利要求的保護(hù)范圍之中。
權(quán)利要求
1.無DNA殘留的RNA提取試劑盒，其特征在于，包括RNA洗脫液、DNA洗脫液、至少一個(gè)與RNA洗脫液配合使用的DNA吸附柱以及至少一個(gè)與DNA洗脫液配合使用的RNA吸附柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無DNA殘留的RNA提取試劑盒，其特征在于，所述RNA洗脫液含有濃度為2-5mol/L的異硫氰酸胍，以及體積分?jǐn)?shù)為O. 5-25%的無水乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無DNA殘留的RNA提取試劑盒，其特征在于，所述DNA洗脫液含有濃度為O. 1-lmol/L的異硫氰酸胍，以及體積分?jǐn)?shù)為3-30%的無水乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無DNA殘留的RNA提取試劑盒，其特征在于，還包括裂解液和漂洗液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無DNA殘留的RNA提取試劑盒，其特征在于，所述裂解液中含有濃度為2-5mol/L的異硫氰酸胍。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無DNA殘留的RNA提取試劑盒，其特征在于，所述漂洗液中含有濃度為lO-lOOmmol/L的氯化鈉，以及體積分?jǐn)?shù)為60-80%無水乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的無DNA殘留的RNA提取試劑盒，其特征在于，所述RNA 洗脫液和/或所述DNA洗脫液中含有pH為6. O 8. O的Tris-HCl、濃度為5-50mmol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的無DNA殘留的RNA提取試劑盒，其特征在于，DNA吸附柱和RNA吸附柱均為硅膜吸附柱。
9.利用權(quán)利要求1-8任一所述RNA提取試劑盒的無DNA殘留的RNA提取方法，其特征在于，至少包括如下兩個(gè)步驟A步驟，用RNA洗脫液將DNA吸附柱上的RNA洗脫下來；B步驟，用DNA洗脫液將RNA吸附柱上的DNA洗脫下來。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的無DNA殘留的RNA提取方法，其特征在于，包括如下步驟(1)利用裂解液對(duì)樣品進(jìn)行裂解得到裂解物；(2)將裂解物轉(zhuǎn)入離心管，離心，取上清液，加入上清液的1/2體積的無水乙醇混勻轉(zhuǎn)入DNA吸附柱進(jìn)行吸附離心，離心，棄掉濾液；(3)A步驟，用RNA洗脫液將DNA吸附柱上的RNA洗脫下來將RNA洗脫液加入所述DNA 吸附柱，離心，收集濾液；(4)向步驟(3)中得到的濾液中加入其體積的二分之一的無水乙醇混勻后加入RNA吸附柱中，離心，棄掉濾液；(5)B步驟，用DNA洗脫液將RNA吸附柱上的DNA洗脫下來將DNA洗脫液加入RNA吸附柱，離心，棄掉濾液；(6)向RNA吸附柱中加入漂洗液，離心，棄掉濾液；(7)用無核糖核酸酶水洗脫得到RNA洗脫液。
全文摘要
本發(fā)明公開無DNA殘留的RNA提取試劑盒及RNA提取方法，無DNA殘留的RNA提取試劑盒包括RNA洗脫液、DNA洗脫液、至少一個(gè)與RNA洗脫液配合使用的DNA吸附柱以及至少一個(gè)與DNA洗脫液配合使用的RNA吸附柱。RNA提取方法RNA提取方法，至少包括如下兩個(gè)步驟A步驟，用RNA洗脫液將DNA吸附柱上的RNA洗脫下來；B步驟，用DNA洗脫液將RNA吸附柱上的DNA洗脫下來。本發(fā)明簡(jiǎn)單快速，提取的RNA純度高，DNA殘留少，一般紫外燈下肉眼不能見到DNA殘留。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102703437SQ20121021169
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者張茂 申請(qǐng)人:北京艾德萊生物科技有限公司