用于生產(chǎn)己二酸的重組質(zhì)粒、基因工程菌、其制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于生產(chǎn)己二酸的重組質(zhì)粒和一種己二酸高產(chǎn)基因工程菌及其制備方法。本申請同時公開了上述重組質(zhì)粒以及基因工程菌在制備用于基因工程發(fā)酵生產(chǎn)己二酸的生物產(chǎn)品中的用途以及使用本發(fā)明的基因工程菌發(fā)酵多種碳源生產(chǎn)己二酸的方法。
【專利說明】用于生產(chǎn)己二酸的重組質(zhì)粒、基因工程菌、其制備方法及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)己二酸的重組質(zhì)粒和一種己二酸高產(chǎn)的基因工程菌。本申請還涉及所述重組質(zhì)粒和基因工程菌的制備方法。本申請同時涉及所述重組質(zhì)粒和基因工程菌用于基因工程發(fā)酵生產(chǎn)己二酸的生物產(chǎn)品中的用途以及使用本發(fā)明的基因工程菌發(fā)酵多種碳源生產(chǎn)己二酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)今世界能源問題成為世界經(jīng)濟發(fā)展的瓶頸，利用生物材料等可再生資源進行物質(zhì)的生產(chǎn)成為當(dāng)今科學(xué)研究的熱點。
[0003]己二酸又名己烷二羧酸，是脂肪族二元酸中最有應(yīng)用價值的二元酸，廣泛應(yīng)用于塑料、樹脂、食品等領(lǐng)域，可用于制造尼龍、增塑劑、潤滑脂、聚氨酰泡沫塑料，少量用于食品的增酸劑，以及醫(yī)藥、香料等方面的生產(chǎn)。
[0004]目前己二酸的生產(chǎn)工藝主要采取石油路線以環(huán)己醇及其混合物為原料的硝酸氧化法，該方法使用強氧化性的硝酸，設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，而且產(chǎn)生的N2O是引起全球變暖和臭氧減少的污染物之一，給環(huán)境造成了極大的污染。隨著人們環(huán)保意識和可持續(xù)發(fā)展意識的提高，發(fā)酵法生產(chǎn)己二酸成了新的研究熱點。一旦實現(xiàn)了己二酸發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)，就可以取代石油化工產(chǎn)品苯及基于石油化工中間產(chǎn)品的多種商品，大大降低對環(huán)境的污染。己二酸發(fā)酵消耗Imol的葡萄糖，同時固定Imol的CO2,消耗溫室效應(yīng)氣體，因此發(fā)酵法產(chǎn)的己二酸將是一種綠色平臺化學(xué)品。然而目前發(fā)酵法生產(chǎn)己二酸的難度大，底物轉(zhuǎn)化率低，成本偏高，因此，迫切需要尋找或構(gòu)建能代謝多種廉價碳源，發(fā)酵條件簡單，己二酸高產(chǎn)的新菌株。
[0005]與乳酸、乙醇等有`機物的發(fā)酵研究相比，己二酸的發(fā)酵研究起步較晚，。綜合已有文獻來看，菌種研究方面，比較有應(yīng)用前景的包括能夠降解己二酸的產(chǎn)黃青霉菌、經(jīng)基因改造的假單胞菌和經(jīng)基因改造的大腸桿菌。其中大腸桿菌的培養(yǎng)條件簡單，菌種本身有己二酸代謝途徑，具有代謝靈活性，易于基因工程改造。對大腸桿菌己二酸代謝的研究表明，在以葡萄糖為底物的混合酸的發(fā)酵中，己二酸生成過程如下:(I)通過丁二酸合成途徑，合成丁二酸，并在由葡萄糖發(fā)酵生成丁二酸的過程中固定了 C02 ;(2)在乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(paaj)作用下由丁二酸生成六碳化合物3-羰基-己二酰輔酶A(3-0xoadipyl_CoA) ； (3)3-羰基-己二酰輔酶A在羥酰脫氫酶的作用下生成3-羥基-己酰輔酶A ; (4)3-羥基-己酰輔酶A脫水酶脫水形成5-羧基-2-戊烯基輔酶A ; (5)5-羧基-2-戊烯基輔酶A還原酶生成己二酰輔酶A ; (6)己二酰輔酶A在水解酶的作用下水解為己二酸。
[0006]目前國內(nèi)外對大腸桿菌生產(chǎn)己二酸的代謝網(wǎng)絡(luò)途徑改造有兩種:1、表達異源的 Klebsiella pneumoniae aroZ 酶、aroY 酶和 Acinetobacter calcoaceticus catA酶；2、過量表達大腸桿菌的paaj酶、paaH酶、maoC酶、sucO)酶、異源的Clostridiumacetobutylicum bed 酶、etfA 酶和 etfB 酶。(Journal of the American ChemicalSociety, 1994，116 (1):399 ;美國專利第US2010/0330626號)第一種改造的出發(fā)點是將由葡萄代謝產(chǎn)生粘糠酸途徑的三個酶在大腸桿菌進行異源表達；第二種改造的出發(fā)點是在大腸桿菌內(nèi)過量表達經(jīng)3-羥基-己酰輔酶A產(chǎn)己二酸代謝途徑的所有酶。第一種改造的缺陷是生成的粘糠酸需要經(jīng)過進一步的化學(xué)催化才能生成己二酸。第二種改造的缺陷是大腸桿菌本身產(chǎn)生的丁二酸的量很低，僅僅過量表達由丁二酸開始的下游基因，對己二酸的最終產(chǎn)量影響不大。
[0007]在發(fā)明人已經(jīng)獲得授權(quán)的專利ZL200710121399.9中，通過將藍藻魚腥藻碳酸酐酶經(jīng)由基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌對大腸桿菌的丁二酸代謝途徑進行了改造，成功獲得了丁二酸高產(chǎn)的大腸桿菌基因工程菌。這為在此基礎(chǔ)上對大腸桿菌的己二酸代謝途徑進行改造并獲得己二酸高產(chǎn)的大腸桿菌基因工程菌提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了充分利用大腸桿菌本身具有的己二酸代謝途徑，同時去除不利的代謝途徑，并且發(fā)揮外源基因提高二氧化碳利用率的作用，本發(fā)明將藍藻魚腥藻(Cyanobacteriumanabaena)碳酸酐酶(CA)基因和大腸桿菌(Escherichia coli)乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶paaj基因同時轉(zhuǎn)入不含有丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl酶)基因的大腸桿菌中，從而提高大腸桿菌生產(chǎn)
己二酸的產(chǎn)量。
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于生產(chǎn)己二酸的重組質(zhì)粒和一種己二酸高產(chǎn)的基因工程菌。本發(fā)明的目的還在于提供本發(fā)明的重組質(zhì)粒以及基因工程菌的制備方法。本發(fā)明的目的還在于提供本發(fā)明的重組質(zhì)粒以及基因工程菌用于基因工程發(fā)酵生產(chǎn)己二酸的用途。本發(fā)明的目的還在于提供使用本發(fā)明的基因工程菌發(fā)酵多種碳源生產(chǎn)己二酸的方法。
[0010]針對本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0011]在第一方面，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒攜帶有藍藻魚渥藻(Cyanobacterium anabaena)7120碳酸酐酶的基因和大腸桿菌(Escherichia coli)K12-MG1655乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶paaj的基因。
[0012]本發(fā)明的所述重組質(zhì)粒可為PET-CAPA。
[0013]在第二方面，本發(fā)明提供了一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通過將如權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入敲除丙酮酸甲醇裂解酶基因的大腸桿菌BL21 (DE3)P中獲得。
[0014]本發(fā)明的所述基因工程菌可為BLPCAPA。
[0015]在第三方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述方法包括:設(shè)計引物并以大腸桿菌為模板克隆獲得兩端帶有不同限制性酶切位點的包含所述大腸桿菌乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶paaj的基因序列的DNA片段，將所述DNA片段和攜帶有所述藍藻魚腥藻7120碳酸酐酶的基因的質(zhì)粒經(jīng)所述限制性內(nèi)切酶酶切并連接，其中優(yōu)選地，所述引物為:PAF:CGCGGATCCCGTGAAGCCTTTATTTGTGACGG,劃線處為 BamH I 酶切位點，PAR:AGGGTCGACTCAAACACGCTCCAGAATCATGG劃線處為Sal I酶切位點；所述限制性內(nèi)切酶為BamH I 和 Sal I 。
[0016]在第四方面，本發(fā)明提供了第二方面所述的基因工程菌株的制備方法，其特征在于，所述方法包括將如權(quán)利要求1或2中任一項所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入所述敲除丙酮酸甲醇裂解酶基因的大腸桿菌BL21(DE3)P中。
[0017]在第五方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的重組質(zhì)粒在制備用于基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)己二酸的生物產(chǎn)品中的用途。
[0018]在第六方面，本發(fā)明提供了第二方面所述的基因工程菌在制備用于基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)己二酸的生物產(chǎn)品中的用途。
[0019]在第七方面，本發(fā)明提供了第二方面所述的基因工程菌發(fā)酵多種碳源生產(chǎn)己二酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生長過程中生物量的積累及加入不同的誘導(dǎo)劑時，在完全厭氧或先有氧積累菌體量，再無氧進行酸發(fā)酵的雙階段培養(yǎng)而生產(chǎn)己二酸。
[0020]在本發(fā)明的發(fā)酵多種碳源生產(chǎn)己二酸的方法中，所述碳源可為葡萄糖和/或所述誘導(dǎo)劑可為乳糖或IPTG。
[0021]所述藍藻魚腥藻7120碳酸酐酶的基因序列為SEQ ID NO:1。
[0022]所述大腸桿菌K12-MG1655乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶paaj的基因為SEQ ID NO:2。
[0023]所述重組質(zhì)粒PET-CAPA的序列為SEQ ID NO:3。
[0024]本發(fā)明產(chǎn)生如下的技術(shù)效果:
[0025]本發(fā)明的菌株和質(zhì)粒能夠提高原始大腸桿菌的己二酸產(chǎn)量，獲得生長速率提高、具有更高己二酸產(chǎn)量的重組基因工程菌。
[0026]通過對比實驗證明，構(gòu)建出來的工程菌相對于原始菌來說，在生物量的積累速率上，在不同濃度IPTG或乳糖的誘導(dǎo)下以及在單純厭氧發(fā)酵和先有氧，后無氧的雙階段發(fā)酵時己二酸產(chǎn)量都有很大的提高。表明這株工程菌存在著較大的應(yīng)用潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
[0028]圖1是大腸桿菌產(chǎn)丁二酸的代謝途徑。
[0029]圖2是PEPC酶的三步催化反應(yīng)機制及CA酶的催化反應(yīng)機理示意圖。
[0030]圖3大腸桿菌Pfl酶敲除示意圖。
[0031]圖4大腸桿菌丁二酸合成己二酸代謝途徑。
[0032]圖5重組質(zhì)粒PET-CAPA構(gòu)建過程示意圖。
【具體實施方式】
[0033]一、培養(yǎng)基的配制
[0034]LB培養(yǎng)基成份為每升水中含有5g酵母粉，IOg胰蛋白胨和lOgNaCl。固體培養(yǎng)基為液體基中加入1.5%的瓊脂粉。為了增加培養(yǎng)基的選擇性，氨芐青霉素(Amp)的使用濃度是 50 μ g/ml。
[0035]二、藍藻魚腥藻7120總DNA的提取
[0036]用SDS-蛋白酶K裂解菌體十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀細(xì)胞碎片和多糖，再用異丙醇沉淀來提取總DNA。
[0037]I)取單菌落接種于100ml含氮培養(yǎng)基BGll中，在合適的溫度下培養(yǎng)8天。
[0038]2)取20ml菌液于離心管中，13, OOOrpm離心2min,棄上清。
[0039]3)沉淀重懸于 1.0ml 0.85%NaCl 中。[0040]4)室溫 13，OOOrpm 離心 2min,棄上清。
[0041]5)沉淀重懸于550 μ I IXTE中。
[0042]6)加 17 μ I 溶菌酶(3511^/1111)，371:溫育 30min。
[0043]7)加 3μ1 蛋白酶 K (20mg/ml)，37°C溫育 30min。
[0044]8)加 30 μ I 10% 十二烷基磺酸鈉 SDS，37°C溫育 30min。
[0045]9)加 100 μ I 5Μ NaCl 充分混勻。
[0046]10)加 80 μ I CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C水浴 lOmin。
[0047]11)加等體積(0.7-0.8ml)氯仿/異戊醇(24: 1)，輕輕振蕩混勻。
[0048]12)室溫，13, OOOrpm 離心 lOmin。
[0049]13)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25: 24: I)輕輕振蕩混勻。
[0050]14)重復(fù)第 12)步。
[0051]15)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24: I)輕輕振蕩混勻。
[0052]16)重復(fù)第 12)步。
[0053]17)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中，加入0.6體積異丙醇，混勻后室溫靜置60mino
[0054]18) 20°C 13, OOOrpm 離心 20min。
[0055]19)棄上清，加500μ I 70%乙醇，輕輕顛倒數(shù)次(洗鹽)。
[0056]20) 4°C 15, OOOrpm 離心 20min。
[0057]21)重復(fù)洗鹽兩次。
[0058]22)倒置離心管，干燥DNA沉淀l(Tl5min。
[0059]DNA沉淀溶于30 μ I I X TE緩沖液，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0060]三、重組質(zhì)粒pET - CA的構(gòu)建
[0061]CA基因的克隆
[0062]以提取的藍藻魚腥藻7120總DNA為模板進行PCR反應(yīng)
[0063]PCR反應(yīng)體系為:
[0064]ddH20 14 μ I
[0065]dNTP I μ I
[0066]緩沖液2 μ I
[0067]引物F I μ I:GGGAAGCTTATGAGTAGTAC
[0068]引物R I μ I:AGGACTCGAGTTAAATGGCTTC
[0069]模板0.5 μ I
[0070]taq 酶 0.5 μ I
[0071]PCR 反應(yīng)程序為:94°C 4min
[0072]94°C 30s,45°C 30s,72°C Imin 35cycles, 72°C 5min
[0073]包含CA酶基因的DNA片段的酶切體系按如下配比組成:
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒攜帶有藍藻魚腥藻(Cyanobacteriumanabaena) 7120碳酸野酶的基因和大腸桿菌(Escherichia coli) K12-MG1655乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶paaj的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒為PET-CAPA。
3.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通過將如權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入敲除丙酮酸甲醇裂解酶基因的大腸桿菌BL21(DE3)P中獲得。
4.如權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為BLPCAPA。
5.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述方法包括:設(shè)計引物并以大腸桿菌為模板克隆獲得兩端帶有不同限制性酶切位點的包含所述大腸桿菌乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶paaj的基因序列的DNA片段，將所述DNA片段和攜帶有所述藍藻魚腥藻7120碳酸酐酶的基因的質(zhì)粒經(jīng)所述限制性內(nèi)切酶酶切并連接，其中優(yōu)選地，所述引物為:PAF:CGCGGATCCCGTGAAGCCTTTATTTGTGACGG,劃線處為 BamH I 酶切位點，PAR:AGGGTCGACTCAAACACGCTCCAGAATCATGG劃線處為Sal I酶切位點；所述限制性內(nèi)切酶為BamH I 和 Sal I 。
6.如權(quán)利要求3或4所述的基因工程菌株的制備方法，其特征在于，所述方法包括將如權(quán)利要求1或2中任一項所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入所述敲除丙酮酸甲醇裂解酶基因的大腸桿菌BL21(DE3)P 中。
7.如權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒在制備用于基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)己二酸的生物產(chǎn)品中的用途。
8.如權(quán)利要求3或4所述的基 因工程菌在制備用于基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)己二酸的生物產(chǎn)品中的用途。
9.使用如權(quán)利要求3或4所述的基因工程菌發(fā)酵多種碳源生產(chǎn)己二酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生長過程中生物量的積累及加入不同的誘導(dǎo)劑時，在完全厭氧或先有氧積累菌體量，再無氧進行酸發(fā)酵的雙階段培養(yǎng)而生產(chǎn)己二酸。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述碳源為葡萄糖和/或所述誘導(dǎo)劑為乳糖或IPTG。
【文檔編號】C12N1/21GK103484490SQ201210193345
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月12日
【發(fā)明者】邢建民, 劉誼蘭, 楊茂華 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所