專利名稱：一種重組禽流感細(xì)胞源滅活疫苗抗原病毒含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用MDCK細(xì)胞(犬腎細(xì)胞)毒含量測定，聯(lián)合紅細(xì)胞凝集試驗，對重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗抗原病毒含量實施測定，降低主觀判斷誤差，具有重要的應(yīng)用價值。
背景技術(shù)：
由于現(xiàn)行的禽流感H5N1滅活疫苗主要是在雞胚上進行培養(yǎng)，收獲尿囊液，滅活后制備成成品疫苗，其抗原的病毒含量是用雞胚半數(shù)感染量和血凝價進行檢測，但用雞胚分離流感病毒或傳代易引起病毒變異，而且雞胚殘留物還可引起過敏性反應(yīng)，雞胚作為疫苗生產(chǎn)基質(zhì)，還存在大規(guī)模生產(chǎn)時供給和潛在外源病毒污染問題，因此，細(xì)胞疫苗技術(shù)成為目前值得發(fā)展的新興技術(shù)。而傳統(tǒng)的細(xì)胞源疫苗僅用細(xì)胞病毒含量測定方法，但常常出現(xiàn)細(xì)胞陰性對照在判讀時已有大量細(xì)胞圓縮，已起不到對照的作用，或者有些細(xì)胞病變不明顯而觀察不到等，出現(xiàn)主觀錯誤。
文獻(xiàn)檢索披露中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所劉明等人進行了重組H5N3禽流感疫苗株在MDCK細(xì)胞中大規(guī)模增殖條件研究，文章未涉及對禽流感雞胚毒在MDCK細(xì)胞上的馴化。本發(fā)明構(gòu)思是將病毒抗原接種在MDCK細(xì)胞進行病毒含量測定，為了防止觀察細(xì)胞病變時出現(xiàn)主觀錯誤，又引入紅細(xì)胞凝集試驗，100%紅細(xì)胞凝集的孔即與細(xì)胞病變的孔相對應(yīng)，100%紅細(xì)胞凝集的孔數(shù)根據(jù)Reed-Muench法計算TCID5tl ;與傳統(tǒng)的方法比較，該方法更為客觀和準(zhǔn)確，大大降低了主觀判斷的誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供的測定方法，即建立用MDCK細(xì)胞聯(lián)合紅細(xì)胞凝集試驗對重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗抗原病毒含量測定方法，使病毒含量測定更準(zhǔn)確、更客觀。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種重組禽流感細(xì)胞源滅活疫苗抗原病毒含量的測定方法，采用MDCK細(xì)胞測定重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗病毒抗原TCID5tl的方法，分步驟實施
其I MDCK細(xì)胞的制備
抽取密度為2. 0 X IO6的MDCK凍存細(xì)胞I. 5ml，置于37°C水浴中，晃動溶解2_3分鐘，在1000rmp/min條件下,離心5分鐘,棄去上清,加入10_15ml細(xì)胞培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72小時，用濃度0. 25%的EDTA-胰酶消化液，再用細(xì)胞營養(yǎng)液稀釋成4. 0 X IO5的MDCK細(xì)胞懸液，以40000個/孔的細(xì)胞密度，0. Iml/孔細(xì)胞懸液鋪到96孔細(xì)胞板上，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時，成致密單層備用；接種病毒抗原之前棄去細(xì)胞營養(yǎng)液，用PH7. 2的PBS溶液清洗兩遍；
其2重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗抗原的接種抽取不同批次的重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗，用細(xì)胞維持液；做10倍的梯度稀釋，取10_3-10_7的滴度樣，分別加入上述的致密單層中，每孔IOOul ;同時設(shè)對照每孔加細(xì)胞維持液；IOOul，放入37°C、5 %的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至第4天，計算TCID5tl值；
其3紅細(xì)胞凝集，計算TCID5tl值 將病變后的96孔板按照原有順序,每孔吸取培養(yǎng)液25-50ul,置于96孔V型血凝板中，然后每孔再加入25-50ull%紅細(xì)胞懸液，在微量板振蕩器上搖勻，其溫度20 30°C，時間15 30分鐘，其中100%紅細(xì)胞凝集的孔與細(xì)胞病變的孔相對應(yīng)，依據(jù)Reed-Muench法，獲得 TCID50 值；
上述細(xì)胞營養(yǎng)液由13. 54gDMEM干粉培養(yǎng)基，用注射用水配制成1000ml，加入胎牛血清IOOml而成；
上述細(xì)胞維持液由13. 54gDMEM干粉培養(yǎng)基，用注射用水配制成1000ml，加入2mg/mlTPCK而成，其終濃度為2ug/mlTPCK ；
上述1%紅細(xì)胞懸液取2-4只2-6月齡SPF雞血液，與等量阿氏液混合，在1500r/min下離心10分鐘，用0. 85%生理鹽水離心洗滌3-4次，每次1500r/min，離心10分鐘，將沉積的紅細(xì)胞用0. 85%生理鹽水制成1%懸液。所述的方法，選用的MDCK細(xì)胞購自美國ATCC即美國模式培養(yǎng)物集存庫(Americantype culture collection) ；DMEM(高糖)干粉培養(yǎng)基為Hyclone公司生產(chǎn)，貨號SH30003. 04. OlB ;胎牛血清為蘭州百靈公司生產(chǎn)，貨號SV20091116 ;EDTA_胰酶消化液為GIBCO生產(chǎn)，貨號400660 ；TPCK為Sigma公司生產(chǎn)，貨號T8802 ;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑由市場采購。本發(fā)明采用MDCK細(xì)胞(犬腎細(xì)胞)毒含量測定聯(lián)合紅細(xì)胞凝集試驗對重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗抗原病毒含量測定方法用MDCK細(xì)胞聯(lián)合紅細(xì)胞凝集試驗對重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗抗原病毒含量測定比單純用細(xì)胞進行病毒含量測定方法更為客觀和準(zhǔn)確，大大降低了主觀判斷的誤差，即使新手操作也同樣基準(zhǔn)可靠，彰顯技術(shù)進步。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對發(fā)明作進一步說明。檢測流程復(fù)蘇、培養(yǎng)MDCK細(xì)胞步驟；病毒液稀釋、接種、紅細(xì)胞凝集；計算TCID5tl步驟；
(I) MDCK細(xì)胞的制備
抽取密度為2. OX IO6的MDCK凍存細(xì)胞I. 5ml，置于37°C水浴中，晃動溶解3分鐘，在1000rmp/min條件下，離心5分鐘，棄去上清，加入15ml細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72小時后，用濃度0. 25%的EDTA-胰酶消化細(xì)胞，再用細(xì)胞營養(yǎng)液(10%胎牛血清+DMEM)稀釋成4. OX IO5的MDCK細(xì)胞懸液，以40000個/孔(0. Iml/孔)的細(xì)胞密度鋪到96孔細(xì)胞板上，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時成致密單層備用；接種病毒抗原之前棄去細(xì)胞營養(yǎng)液(10%胎牛血清+DMEM)，用pH7. 2的PBS溶液清洗兩遍。(2)重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗抗原的接種
抽取不同批次(2010001批-2010010批)重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗抗原，用細(xì)胞維持液(2ug/mlTPCK+DMEM溶液)作10倍的梯度稀釋，取10_3_10_7的滴度樣，分別加入上述準(zhǔn)備好的細(xì)胞致密單層中，每孔lOOul，同時設(shè)對照，每孔加細(xì)胞維持液(2ug/mlTPCK+DMEM溶液)100ul，放入37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中，期間2次/天觀察細(xì)胞病變，培養(yǎng)至第4天，以出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法，計算TCID5tl值。(3)紅細(xì)胞凝集，計算TCID5011
為了防止觀察細(xì)胞病變時出現(xiàn)主觀錯誤，就將觀察病變后的96孔板按照原有順序，每 孔吸取培養(yǎng)液50ul (吸液前要充分混勻)置于96孔V型血凝板中(包括陰性對照)，然后每孔再加入50ul的1%紅細(xì)胞懸液，立即在微量板振蕩器上搖勻，其溫度為30°C，時間30分鐘，將100%紅細(xì)胞凝集的孔與細(xì)胞病變的孔相對應(yīng)，以100%紅細(xì)胞凝集的孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench 法，獲得 TCID5tl 值。(4)依據(jù)Reed-Muench法，接種量為O. Iml ;計算病毒致死(感染)量，以TCID5tl為列，見表I.
權(quán)利要求
1.一種重組禽流感細(xì)胞源滅活疫苗抗原病毒含量的測定方法，其特征在于采用MDCK細(xì)胞測定重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗病毒抗原TCID5tl的方法，分步驟實施； 其I MDCK細(xì)胞的制備 抽取密度為2. OX IO6的MDCK凍存細(xì)胞I. 5ml，置于37°C水浴中，晃動溶解2_3分鐘，在1000rmp/min條件下，離心5分鐘，棄去上清，加入10_15ml細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72小時，用濃度0. 25%的EDTA-胰酶消化細(xì)胞，再用細(xì)胞營養(yǎng)液稀釋成4. 0 X IO5的MDCK細(xì)胞懸液，以40000個/孔的細(xì)胞密度，0. Iml/孔細(xì)胞懸液鋪到96孔細(xì)胞板上，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時，成致密單層備用；接種病毒抗原之前棄去細(xì)胞營養(yǎng)液，用PH7. 2的PBS溶液清洗兩遍； 其2重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗抗原的接種 抽取不同批次的重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗，用細(xì)胞維持液；做10倍的梯度稀釋，取10_3-10_7的滴度樣，分別加入上述的致密單層中，每孔IOOul ;同時設(shè)對照每孔加細(xì)胞維持液；IOOul，放入37°C、5 %的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至第4天，計算TCID5tl值； 其3紅細(xì)胞凝集，計算TCID5tl值 將病變后的96孔板按照原有順序,每孔吸取培養(yǎng)液25-50ul,置于96孔V型血凝板中，然后每孔再加入25-50ull%紅細(xì)胞懸液，在微量板振蕩器上搖勻，其溫度20 30°C，時間15 30分鐘，其中100%紅細(xì)胞凝集的孔與細(xì)胞病變的孔相對應(yīng)，依據(jù)Reed-Muench法，獲得精準(zhǔn)的TCID5tl值； 上述細(xì)胞營養(yǎng)液由13. 54gDMEM干粉培養(yǎng)基，用注射用水配制成1000ml，加入胎牛血清IOOml而成； 上述細(xì)胞維持液由13. 54gDMEM干粉培養(yǎng)基，用注射用水配制成1000ml，加入2mg/mlTPCK而成，其終濃度為2ug/mlTPCK ； 上述1%紅細(xì)胞懸液取SPF雞血液，與等量阿氏液混合，在1500r/min下離心10分鐘，用0. 85%生理鹽水離心洗滌3-4次，每次1500r/min，離心10分鐘，將沉積的紅細(xì)胞用0. 85%生理鹽水制成1%懸液。
2.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于該方法適用于紅細(xì)胞凝集試驗測定病毒含量的細(xì)胞源疫苗，即不同的病毒使用對應(yīng)的敏感細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于選用的MDCK細(xì)胞購自美國ATCC即美國模式培養(yǎng)物集存庫，即為American type culture collection ;選用試劑為國產(chǎn)分析純試劑由市場采購。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種新的重組禽流感H5N1細(xì)胞源滅活疫苗抗原病毒含量測定方法，包括(1)MDCK細(xì)胞的制備抽取密度為2.0×106的MDCK凍存細(xì)胞1.5ml，置于37℃水浴中，加入10-15ml細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)72小時后，用濃度0.25%的EDTA-胰酶消化細(xì)胞，再用細(xì)胞營養(yǎng)液稀釋成4.0×105的MDCK細(xì)胞懸液，以40000個/孔(0.1ml/孔)的細(xì)胞密度鋪到96孔細(xì)胞板上，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時成致密單層備用；(2)重組禽流感H5N1抗原的接種抽取不同批次重組禽流感H5N1細(xì)胞源抗原，分別加入上述的致密單層中，每孔100ul，加細(xì)胞維持液100ul，培養(yǎng)至第4天,以細(xì)胞病變的孔數(shù)，用Reed-Muench法，計算TCID50值。該方法適用于紅細(xì)胞凝集試驗測定病毒含量的細(xì)胞源疫苗，即不同的病毒使用對應(yīng)的敏感細(xì)胞。
文檔編號C12Q1/02GK102703602SQ20121013996
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者劉淑梅, 張先鋒, 李延濤, 李莉, 潘毅平, 王玉紅, 袁萍, 趙海源, 黃炯 申請人:新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司