專利名稱：識(shí)別含對(duì)硝基苯磺酰胺基的化合物的核酸適體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種識(shí)別含對(duì)硝基苯磺酰胺基的化合物的核酸適體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化(SystematicEvolution of Ligands by Exponentialenrichment, SELEX)技術(shù)是一種在體外從組合核酸文庫(kù)中篩選出特異識(shí)別某一個(gè)或一類革巴標(biāo)的核酸分子(核酸適體)的新的組合化學(xué)技術(shù)。目前，SELEX技術(shù)在基礎(chǔ)研究、生物篩選等方面得到了很好的應(yīng)用，并且在臨床診斷方面也有廣闊的應(yīng)用前景。核酸適體(aptamer)是一類能特異緊密結(jié)合相應(yīng)靶分子的單鏈核酸序列，通常由15到150個(gè)核苷酸組成,包括DNA、RNA、肽核酸或化學(xué)修飾的核酸。核酸適體通過(guò)范德華力、氫鍵或靜電作用與靶分子高親和力，高特異性地相互結(jié)合作用。它的高親和力和特異性可以與抗體相媲美，因此它又稱為核酸或者化學(xué)的“抗體”。迄今為止，已篩選出了數(shù)百個(gè)核酸適體，它們的靶物質(zhì)范圍很廣，包括無(wú)機(jī)金屬離子、有機(jī)小分子、生物大分子、以及病毒、細(xì)菌、細(xì)胞和組織切片等。與單克隆抗體相比,核酸適體具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)在體外篩選,無(wú)需免疫動(dòng)物或細(xì)胞。因此其靶目標(biāo)范圍更廣，可以是無(wú)機(jī)金屬離子、激素、毒素，還可以是細(xì)胞，從理論上上講任何靶標(biāo)都可以篩選得到其核酸適體；(2)低毒性或免疫源性，且具有很好的水溶性，可以直接進(jìn)行大劑量的皮下靜脈注射；(3)可以在生理?xiàng)l件以外的條件下進(jìn)行篩選和應(yīng)用；可進(jìn)行大量化學(xué)合成制備，批間差異??；(5)很容易進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造、修飾、標(biāo)記或固定化；(6)穩(wěn)定性好，容易保存和運(yùn)輸；(7)分子量小，一般在4-50KD?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，核酸適體作為一種新型識(shí)別分子已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生物傳感器、疾病治療和診斷等諸多領(lǐng)域。目前所篩選得到的核酸適體都是識(shí)別某一單一靶標(biāo)，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)一類化合物或某一特定基團(tuán)進(jìn)行識(shí)別和用于對(duì)該類化合物的富集、分析檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種識(shí)別含對(duì)硝基苯磺酰胺基的化合物的核酸適體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的核酸適體是序列表的序列I、序列3或序列5所示的單鏈DNA片段。將序列表的序列I、序列3或序列5所示的單鏈DNA片段進(jìn)行修飾或改造得到的核酸適體的衍生物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述核酸適體衍生物可為如下任意一種①將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；③將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸脂骨架，得到與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；④將所述核酸適體改為肽核酸，得到與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；⑤將所述核酸適體的一端或中間接上信號(hào)分子(如熒光素FITC，F(xiàn)AM，羅丹明B，或放射性分子)、活性分子(如生物素、氨基、羧基、酶)或其它功能基團(tuán)后，得到與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。本發(fā)明還保護(hù)核酸探針，為核酸探針甲、核酸探針乙或核酸探針丙；所述核酸探針甲由DNA片段甲-I和DNA片段甲_2組成；所述DNA片段甲-I由序列表的序列I所示核苷酸組成 且5’末端具有熒光報(bào)告基團(tuán)(核酸適體元件)；所述DNA片段甲-2由9-11個(gè)與序列表的序列I反向互補(bǔ)的核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)(互補(bǔ)元件)；所述核酸探針乙由DNA片段乙-I和DNA片段乙-2組成；所述DNA片段乙-I由序列表的序列3所示核苷酸組成且5’末端具有熒光報(bào)告基團(tuán)(核酸適體元件)；所述DNA片段乙-2由9-11個(gè)與序列表的序列3反向互補(bǔ)的核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)(互補(bǔ)元件)；所述核酸探針丙由DNA片段丙-I和DNA片段丙-2組成；所述DNA片段丙-I由序列表的序列5所示核苷酸組成且5’末端具有熒光報(bào)告基團(tuán)(核酸適體元件)；所述DNA片段丙-2由9-11個(gè)與序列表的序列5反向互補(bǔ)的核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)(互補(bǔ)元件)。所述DNA片段甲_1、DNA片段甲_2、DNA片段乙_1、DNA片段乙_2、DNA片段丙-I和DNA片段丙-2均為單鏈DNA。所述核酸探針的功能為如下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f) (a)檢測(cè)待測(cè)化合物是否為含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；(b)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；(c)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的濃度；(d)檢測(cè)待測(cè)化合物是否為烷基胺類化合物；(e)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在烷基胺類化合物；(f)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中烷基胺類化合物的濃度。所述DNA片段甲-2具體可由序列表的序列2所示核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)。所述DNA片段乙-2具體可由序列表的序列4所示核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)。所述DNA片段丙-2具體可由序列表的序列6所示核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)。所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM(如6-FAM)、羅丹明B、FITC、TAMRA、Cy3或Cy5。所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQl、DABCYL或BHQ2。所述(a)和/或(b)和/或(C)中，所述含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物具體可為Ne -對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸。所述(d)和/或(e)和/或(f)中，所述烷基胺類化合物為氨基上連接有兩個(gè)以上碳的烷基鏈化合物。所述(d)和/或(e)和/或(f)中，所述烷基胺類化合物具體可為L(zhǎng)-賴氨酸。所述DNA片段或所述核酸探針可用于如下(A)、(B)、(C)、(D)、(E)或(F) (A)檢測(cè)待測(cè)化合物是否為含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；(B)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；(C)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的濃度；(D)檢測(cè)待測(cè)化合物是否為烷基胺類化合物；(E)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在烷基胺類化合物；(F)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中烷基胺類化合物的濃度。
所述(A)和/或(B)和/或(C)中，所述含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物具體可為Ne -對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸。所述(D)和/或(E)和/或(F)中，所述烷基胺類化合物為氨基上連接有兩個(gè)以上碳的烷基鏈化合物。所述(D)和/或(E)和/或(F)中，所述烷基胺類化合物具體可為L(zhǎng)-賴氨酸。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)化合物是否為含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的方法，包括如下步驟將溶液甲與核酸探針溶液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將溶液乙與所述核酸探針溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著高于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)、所述待測(cè)化合物為候選的含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)沒(méi)有顯著差異、所述待測(cè)化合物為候選的不含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；所述核酸探針溶液為以上任一所述核酸探針的溶液；所述溶液甲由所述待測(cè)化合物和緩沖液組成；所述溶液乙為所述緩沖液。 所述方法中，所述孵育條件具體可為室溫、30分鐘。所述方法中，具體可將195 μ L核酸探針溶液與5 μ L所述溶液甲混合并將195 μ L核酸探針溶液與5μ L所述溶液乙混合。所述核酸探針溶液可由所述核酸適體元件、所述互補(bǔ)元件和探針緩沖液組成，所述核酸適體元件的濃度為O. 05 μ Μ，所述互補(bǔ)元件的濃度為O. 15 μ Mo所述緩沖液具體可為探針緩沖液。所述探針緩沖液具體如下含100mMNa2HP04、20mM KH2PO4和500禮NaCl，其它為水。所述探針緩沖液的pH具體可為7. 4。所述溶液甲中，所述待測(cè)化合物的濃度可為4 μ Μ-4000 μ M0所述“檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)”的參數(shù)具體如下激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm。具體可米用酶標(biāo)儀 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)進(jìn)行檢測(cè)。所述含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物具體可為Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的方法，包括如下步驟將溶液甲與核酸探針溶液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將溶液乙與所述核酸探針溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著高于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)、所述待測(cè)物質(zhì)疑似存在含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)沒(méi)有顯著差異、所述待測(cè)物質(zhì)疑似不存在含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；所述核酸探針溶液為以上任一所述核酸探針的溶液；所述溶液甲由所述待測(cè)化合物和緩沖液組成；所述溶液乙為所述緩沖液。所述方法中，所述孵育條件具體可為室溫、30分鐘。所述方法中，具體可將195 μ L核酸探針溶液與5 μ L所述溶液甲混合并將195 μ L核酸探針溶液與5μ L所述溶液乙混合。所述核酸探針溶液可由所述核酸適體元件、所述互補(bǔ)元件和探針緩沖液組成，所述核酸適體元件的濃度為O. 05 μ Μ，所述互補(bǔ)元件的濃度為O. 15 μ Mo所述緩沖液具體可為探針緩沖液。所述探針緩沖液具體如下^lOOmM Na2HPO4^20mM KH2PO4和500禮NaCl，其它為水。所述探針緩沖液的pH具體可為7. 4。所述溶液甲中，所述待測(cè)化合物的濃度可為4 μ Μ-4000 μ M0
所述“檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)”的參數(shù)具體如下激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm。具體可米用酶標(biāo)儀 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)進(jìn)行檢測(cè)。所述含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物具體可為Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)化合物是否為烷基胺類化合物的方法，包括如下步驟將衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液與溶液丙混合孵育，然后再將混合液與核酸探針溶 液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將衍生劑的N，N-二甲基甲酰胺溶液與溶液丁混合孵育，然后再將混合液與核酸探針溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著高于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)、所述待測(cè)化合物為候選的烷基胺類化合物，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)沒(méi)有顯著差異、所述待測(cè)化合物為候選的非烷基胺類化合物；所述核酸探針溶液為以上任一所述核酸探針的溶液；所述衍生劑為硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘；所述溶液丙由所述待測(cè)化合物和緩沖液組成；所述溶液丁為所述緩沖液。所述衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，所述衍生劑的濃度具體可為1M。所述核酸探針溶液可由所述核酸適體元件、所述互補(bǔ)元件和探針緩沖液組成，所述核酸適體元件的濃度為O. 05 μ Μ，所述互補(bǔ)元件的濃度為O. 15 μ M0所述探針緩沖液具體如下^lOOmM Na2HPO4,20mM KH2PO4和500mM NaCl，其它為水。所述探針緩沖液的pH具體可為7. 4。所述溶液丙中，所述待測(cè)化合物的濃度為10mM。所述緩沖液可為Na2C03/NaHC03緩沖液。所述緩沖液的PH具體可為10. O。所述緩沖液具體為由Na2C03、NaHCO3和水組成，Na2CO3的濃度為0. 06M, NaHCO3的濃度為0. 04M。所述方法中，具體可將10 μ L衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液和100 μ L所述溶液丙混合并室溫孵育30分鐘，然后再將5uL混合液與100 μ L核酸探針溶液混合并室溫孵育3h。所述方法中，具體可將10 μ L衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液和100 μ L所述溶液丁混合并室溫孵育30分鐘，然后再將5uL混合液與100 μ L核酸探針溶液混合并室溫孵育3h。所述“檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)”的參數(shù)具體如下激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm。具體可米用酶標(biāo)儀 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)進(jìn)行檢測(cè)。所述待測(cè)化合物可為乙醇胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-纈氨酸、L-賴氨酸或含L-賴氨酸的多肽。所述烷基胺類化合物可為氨基上連接有兩個(gè)以上碳的烷基鏈化合物，具體可為乙醇胺、L-賴氨酸或含L-賴氨酸的多肽。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在烷基胺類化合物的方法，包括如下步驟將衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液與溶液丙混合孵育，然后再將混合液與核酸探針溶液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將衍生劑的N，N-二甲基甲酰胺溶液與溶液丁混合孵育，然后再將混合液與核酸探針溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著高于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)、所述待測(cè)物質(zhì)疑似存在烷基胺類化合物，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)沒(méi)有顯著差異、所述待測(cè)物質(zhì)疑似不存在烷基胺類化合物；所述核酸探針溶液為以上任一所述核酸探針的溶液；所述衍生劑為硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘；所述溶液丙由所述待測(cè)化合物和緩沖液組成；所述溶液丁為所述緩沖液。所述衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，所述衍生劑的濃度具體可為1M。所述核酸探針溶液可由所述核酸適體元件、所述互補(bǔ)元件和探針緩沖液組成，所述核酸適體元件的濃度為O. 05 μ Μ，所述互補(bǔ)元件的濃度為O. 15 μ M0所述探針緩沖液具體如下^lOOmM Na2HPO4,20mM KH2PO4和500mM NaCl，其它為水。所述探針緩沖液的pH具體可為7. 4。所述溶液丙中，所述待測(cè)化合物的濃度為10mM。所述緩沖液可為Na2C03/NaHC03緩沖液。所述緩沖液的PH具體可為10. O。所述緩沖液具體為由Na2C03、NaHCO3和水組成，Na2CO3的濃度為O. 06M, NaHCO3的濃度為O. 04M。所述方法中，具體可將IOyL衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液和100 μ L所述溶液丙混合并室溫孵育30分鐘，然后再將5uL混合液與100 μ L核酸探針溶液混合并室溫孵育3h。所述方法中，具體可將10 μ L衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液和100 μ L所述溶液丁混合并室溫孵育30分鐘，然后再將5uL混合液與100 μ L核酸探針溶液混合并室溫孵育3h。所述“檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)”的參數(shù)具體如下激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm。具體可米用酶標(biāo)儀 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)進(jìn)行檢測(cè)。所述待測(cè)物質(zhì)可為乙醇胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-纈氨酸、L-賴氨酸和含L-賴氨酸的多肽中的至少一種。所述烷基胺類化合物可為氨基上連接有兩個(gè)以上碳的烷基鏈化合物，具體可為乙醇胺、L-賴氨酸和含L-賴氨酸的多肽中的至少一種。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的濃度的方法，包括如下步驟將待測(cè)物質(zhì)溶液與核酸探針溶液混合孵育后檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)物質(zhì)中所述含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的濃度；所述核酸探針溶液為以上任一所述核酸探針的溶液。所述含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物具體可為Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線具體可為用Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述方法中，所述孵育條件具體可為室溫、30分鐘。所述方法中，具體可將195 μ L核酸探針溶液與5 μ L待測(cè)化合物溶液混合。所述核酸探針溶液可由所述核酸適體元件、所述互補(bǔ)元件和探針緩沖液組成，所述核酸適體元件的濃度為0. 05 μ Μ，所述互補(bǔ)元件的濃度為0. 15 μ M0所述待測(cè)化合物溶液可由待測(cè)化合物和探針緩沖液組成。所述探針緩沖液具體如下^lOOmM Na2HPO4,20mM KH2PO4和500mMNaCl，其它為水。所述探針緩沖液的pH具體可為7. 4。所述待測(cè)化合物溶液中，所述待測(cè)化合物的濃度可為4 μ Μ-4000 μ Μ。 所述“檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)”的參數(shù)具體如下激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm。具體可米用酶標(biāo)儀 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中烷基胺類化合物的濃度的方法，包括如下步驟將衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液與待測(cè)化合物溶液混合孵育，然后再將混合液與核酸探針溶液混合孵育，然后檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)物質(zhì)中所述烷基胺類化合物的濃度；所述核酸探針溶液為以上任一所述核酸探針的溶液；所述衍生劑為硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘。所述烷基胺類化合物可為氨基上連接有兩個(gè)以上碳的烷基鏈化合物，具體可為L(zhǎng)-賴氨酸、乙醇胺或含L-賴氨酸的多肽。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線具體可為用L-賴氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，所述衍生劑的濃度具體可為1M。所述核酸探針溶液可由所述核酸適體元件、所述 互補(bǔ)元件和探針緩沖液組成，所述核酸適體元件的濃度為O. 05 μ Μ，所述互補(bǔ)元件的濃度為O. 15 μ M0所述探針緩沖液具體如下^lOOmM Na2HPO4,20mM KH2PO4和500mM NaCl，其它為水。所述探針緩沖液的pH具體可為7. 4。所述待測(cè)化合物溶液的制備方法如下將所述待測(cè)化合物溶于檢測(cè)緩沖液中，使待測(cè)化合物的濃度為10mM。所述檢測(cè)緩沖液可為Na2C03/NaHC0d^沖液。所述檢測(cè)緩沖液的PH具體可為10. O。所述檢測(cè)緩沖液具體為由Na2C03、NaHCO3和水組成，Na2CO3的濃度為 O. 06M, NaHCO3 的濃度為 O. 04M。所述方法中，具體可將IOyL衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液和100 μ L待測(cè)化合物溶液混合并室溫孵育30分鐘，然后再將5uL混合液與100 μ L核酸探針溶液混合并室溫孵育3h。所述“檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)”的參數(shù)具體如下激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm。具體可米用酶標(biāo)儀 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏、快速、特異、成本低等優(yōu)點(diǎn)。


圖I為核酸探針檢測(cè)含對(duì)硝基苯磺酰胺基的化合物原理示意圖。圖2為實(shí)施例4中核酸適體探針檢測(cè)不同濃度Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸的熒光光譜圖。圖3為實(shí)施例4中核酸適體探針檢測(cè)不同濃度^ -對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸525nm處熒光值與對(duì)應(yīng)濃度值的比例關(guān)系圖。圖4為實(shí)施例5中核酸探針甲對(duì)L-賴氨酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液的響應(yīng)突光光譜圖。圖5為實(shí)施例6中核酸探針甲對(duì)乙醇胺的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液的響應(yīng)熒光光譜圖。圖6為實(shí)施例7中核酸探針甲對(duì)L-苯丙氨酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液的響應(yīng)熒光光譜圖。圖7為實(shí)施例8中核酸探針甲對(duì)甘氨酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液的響應(yīng)熒光光譜圖。圖8為實(shí)施例9中核酸探針甲對(duì)混合氨基酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液的響應(yīng)熒光光譜圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。Na2C03/NaHC03 緩沖液(pH10、0. 1M):由 Na2C03、NaHCO3 和水組成，Na2CO3 的濃度為
O.06M, NaHCO3 的濃度為 O. 04M。
實(shí)施例I、Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸和Ne-對(duì)硝基苯甲酰-L-賴氨酸的合成一、Ne -對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸的合成和表征UNe-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸的合成(I)將2. 5毫摩爾CuSO4和5毫摩爾L-賴氨酸溶解在15mL水中，100°C回流lh，然后用IM Na2CO3調(diào)節(jié)pH至10，過(guò)濾收集濾液。(2)取步驟(I)的濾液，邊攪拌邊在I小時(shí)左右滴加10毫升對(duì)硝基苯磺酰氯的二氧六環(huán)溶液(其中含有4. 7毫摩爾對(duì)硝基苯磺酰氯)，滴加完后繼續(xù)在室溫下攪拌12小時(shí)，然后離心(3000轉(zhuǎn)/分)收集沉淀。(3)將步驟⑵的沉淀依次用20mL水洗漆三次、用20mL 二氧六環(huán)洗漆三次,然后懸浮于IOOmL水，在強(qiáng)烈攪拌條件下慢慢滴加飽和Na2S水溶液直到再無(wú)黑色沉淀出現(xiàn)，然后離心(3000轉(zhuǎn)/分)收集上清。(4)取步驟(3)的上清，調(diào)節(jié)pH至7，重結(jié)晶后得到淺黃色固體。2、Ne -對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸的表征步驟I得到的固體的核磁譜圖(一維氫譜，400MHz，DMF_d8) δ 8. 40 (2Η, d，J =
11.2Hz)，δ 8. 05 (2H, d, J = 11. 3Hz)，δ 7. 56 (1H, s)，δ 3. 33 (2H, s)，δ 3. 07 (1Η, t, J =
12.0Hz)，δ 2. 77 (2Η, t, J = 7. OHz)，δ I. 55 (2Η, m)，δ I. 35 (4Η, m)。步驟I得到的固體的質(zhì)譜(ESI)m/z (理論值)331. I, m/z (測(cè)定值)330. I(M-H)'以上結(jié)果表明，步驟I得到的固體為Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸。二、Ne-對(duì)硝基苯甲酰-L-賴氨酸的合成和表征1、Νε_(tái)對(duì)硝基苯甲酰-L-賴氨酸的合成(I)將2.5毫摩爾&1504和5毫摩爾1^賴氨酸溶解在151^水中，1001回流111，然后用IM Na2CO3調(diào)節(jié)pH至10，過(guò)濾收集濾液。(2)取步驟(I)的濾液，邊攪拌邊在I小時(shí)左右滴加10毫升對(duì)硝基苯甲酰氯的二氧六環(huán)溶液(其中含有4. 7毫摩爾對(duì)硝基苯甲酰氯)，滴加完后繼續(xù)在室溫下攪拌12小時(shí)，然后離心(3000轉(zhuǎn)/分)收集沉淀。(3)將步驟⑵的沉淀依次用20mL水洗漆三次、用20mL 二氧六環(huán)洗漆三次,然后懸浮于IOOmL水，在強(qiáng)烈攪拌條件下慢慢滴加飽和Na2S水溶液直到再無(wú)黑色沉淀出現(xiàn)，然后離心(3000轉(zhuǎn)/分)收集上清。(4)取步驟(3)的上清，調(diào)節(jié)pH至7，重結(jié)晶后得到灰白色固體。2、Ne-對(duì)硝基苯甲酰-L-賴氨酸的表征
步驟I得到的固體的核磁譜圖(一維氫譜，400MHz，DMF_d8) : δ 8. 89 (1H，s)，δ 8. 30 (2H, d, J = 3. 1Hz)，δ 8. 10 (2H, d, J = 4. 8Hz)，δ 7. 54 (1H, s)，δ 3. 33 (5Η, m)，δ 3. 12 (1Η, s)，δ I. 73 (2Η, m)，δ I. 56 (2Η, m)，δ I. 39 (2Η, m)。步驟I得到的固體的質(zhì)譜(ESI)m/z (理論值)295. I, m/z (測(cè)定值)294. 1(M-H)_。以上結(jié)果表明，步驟I得到的固體為Ne-對(duì)硝基苯甲酰-L-賴氨酸。實(shí)施例2、核酸適體的篩選和制備結(jié)合緩沖溶液(ρΗ7·4):含 137mM NaCl、0. 5mM MgCl2,2. 7mM KCl、2mM KH2PO4 和IOmM Na2HP04。洗脫緩沖液(ρΗ8· 0):含 25mM Tris-HClUOmM EDTA 和 3.5M 尿素。一、甘氨酸和Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸的固定將O. 5g環(huán)氧活化Sepharose 6B (通用電氣醫(yī)療集團(tuán),瑞典)微球用IOOmL水反復(fù)洗滌，獲得I. 75mL濕球，然后用O. 2M Na2CO3 (pH 乂 12)置換溶脹的微球中的水分，在3. 5mL反應(yīng)體系中加入IOOmM甘氨酸或Ne -對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸，置于室溫條件下振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后用pH4. 5醋酸鈉緩沖溶液(O. IM醋酸鈉，O. 5M NaCl)和pH12碳酸鈉緩沖溶液(O. 2M NaHC03/Na2C03,0. 5M NaCl)反復(fù)交替洗滌微球，最后用水洗滌，并定容至3. 5mL,4 °C冰箱保存。二、隨機(jī)核酸文庫(kù)的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)兩端包括20個(gè)固定核苷酸、中間包括45個(gè)核苷酸的隨機(jī)文庫(kù)如下5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-N45-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；N45 代表 45 個(gè)隨機(jī)核苷酸序列。三、核酸適體的篩選I、文庫(kù)預(yù)處理將約60pmol隨機(jī)核酸文庫(kù)溶于結(jié)合緩沖液，95°C變性5min，冰上冷卻15min，室溫放置5min。2、反篩在2-11輪篩選前，將隨機(jī)核酸文庫(kù)溶液與固定有甘氨酸的微球混合，95°C下孵育I小時(shí)，離心除去甘氨酸微球。在12-20輪篩選的結(jié)合緩沖溶液中加入ImM Ne-對(duì)硝基苯甲酰-L-賴氨酸以除去和對(duì)硝基苯甲酰胺基結(jié)合的核酸適體。3、正篩將反篩過(guò)程中得到的溶液與固定Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸的微球孵育一段時(shí)間。再用結(jié)合緩沖液清洗微球幾次之后，用洗脫緩沖液在95°C加熱5min，洗脫結(jié)合在Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸微球上的DNA，測(cè)定洗脫液的熒光強(qiáng)度。然后，向洗脫液中加Λ I μ L糖原(20mg/mL)和4倍體積的酒精,置于_20°C沉淀30min, 12000rpm離心15min,去上清，真空干燥，用IOOyL millipore水定容。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C3min，56°C 30s, 72°C 30s)。用鏈霉親和素瓊脂糖球從PCR產(chǎn)物中分離得到FAM標(biāo)記的單鏈DNA(ssDNA)序列。將得到的ssDNA用NAP-5柱子(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，瑞典)脫鹽，真空干燥，用于下一輪的篩選。為了提高核酸適體的親和力和特異性，在篩選過(guò)程中逐步增加洗滌次數(shù)、減少正篩球用量和增加反篩球用量，以增加篩選的壓力。20輪篩選后，以篩選產(chǎn)物為模板通過(guò)引物(5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ 和 5’ -GTCACCAGCACGTCCATGAG-3 ’ )進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。最終選擇的核酸適體(11，12，10，14和115)如下核酸適體Ml:5，-ACGCTCGGATGCCACTACAGAA GGCATGGTGGGTATCGGCACTCGCTGGTTGCC TTCTAGTCTTACTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；核酸適體M2:5，-ACGCTCGGATGCCACTACAGGGACTA CTAAGCAGGTAGGTATGGATTGGTTGCATTAG
GAGTACTCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；核酸適體M3:
5，-ACGCTCGGATGCCACTACAGAGAGGGCC TGAGACTATGGCGGGCATTGGCAGTGAAATGGTTGGTCT CA
TGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；核酸適體M5:5，-ACGCTCGGATGCCA CTACAGTATGGTGGGTATTGGCATGCAATGGTGCTAGTAG TGCATTCGTGCCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列。4、核酸適體的優(yōu)化步驟3得到的核酸適體較長(zhǎng)，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析后，設(shè)計(jì)并合成一系列經(jīng)截短的核酸序列，通過(guò)熒光染料修飾，然后考察它們與Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸糖球的結(jié)合能力，挑選結(jié)合能力最強(qiáng)的序列用于進(jìn)一步的應(yīng)用，優(yōu)化后的序列長(zhǎng)度只有32-41個(gè)核苷酸。最終得到的截短核酸適體序列如下核酸適體I:5 ’ -TGAGACTATGGCGGGCATTGGCAGTGAAATGGTTGGTCTCA-3，；核酸適體2:5，-AGAAGGCATGGTGGGTATCGGCACTCGCTGGTTGCCTTCT-3，；核酸適體3:5’ -CTAAGCAGGTAGGTATGGATTGGTTGCATTAG-3’ ；核酸適體4:5，-CTACAGTATGGTGGGTATTGGCATGCAATGGTGCTAGTAG-3，。核酸適體5:5，-GGCATGGTGGGTATCGGCACTCGCTGGTTGCC-3，。5、進(jìn)一步優(yōu)化將核酸適體5進(jìn)一步優(yōu)化，得到核酸適體6，序列如下5，-ATCATGGTGGGTATCGGCACTCGTTGGTTGAT-3，。實(shí)施例3、核酸探針的制備
由上海生物工程公司合成如下三組核酸探針核酸探針甲由兩條DNA片段(DNA片段甲-I和DNA片段甲_2)組成；DNA片段甲-I為核酸適體且其5’末端具有6-FAM(熒光報(bào)告基團(tuán))，簡(jiǎn)稱核酸適體元件；DNA片段甲_2為核酸適體的部分反向互補(bǔ)序列且其3’末端具有BHQl (熒光淬滅基團(tuán))，簡(jiǎn)稱互補(bǔ)元件；核酸探針乙由兩條DNA片段(DNA片段乙-I和DNA片段乙-2)組成；DNA片段乙-I為核酸適體且其5’末端具有6-FAM(突光報(bào)告基團(tuán))，簡(jiǎn)稱核酸適體兀件；DNA片段乙-2為核酸適體的部分反向互補(bǔ)序列且其3’末端具有BHQl (熒光淬滅基團(tuán))，簡(jiǎn)稱互補(bǔ)元件；核酸探針丙由兩條DNA片段(DNA片段丙-I和DNA片段丙-2)組成；DNA片段丙-I為核酸適體且其5’末端具有6-FAM(熒光報(bào)告基團(tuán))，簡(jiǎn)稱核酸適體元件；DNA片段丙-2為核酸適體的部分反向互補(bǔ)序列且其3’末端具有BHQl (熒光淬滅基團(tuán))，簡(jiǎn)稱互補(bǔ)元件；各個(gè)DNA片段的核苷酸序列如下DNA 片段甲-I (序列表的序列 I) :5’ -ATCATGGTGGGTATCGGCACTCGTTGGTTGAT-3’ ；DNA 片段甲-2 (序列表的序列 2) :5’ -CACCATGAT-3’。DNA 片段乙-I (序列表的序列 3) :5’ -GGCATGGTGGGTATCGGCACTCGCTGGTTGCC-3’ ；DNA 片段乙-2 (序列表的序列 4) :5’ -CACCATGCC-3’。DNA 片段丙-I (序列表的序列 5) :5’ -AGAAGOCATGGTGGGTATCGGCACTCGCTGGTTCCTTCT-3，；DNA 片段丙-2 (序列表的序列 6) :5’ -ACCATGCCTTC-3’。核酸適體探針的檢測(cè)原理如圖I所示。當(dāng)檢測(cè)體系中不存在含對(duì)硝基苯磺酰胺基的化合物時(shí)，核酸適體兀件與互補(bǔ)兀件雜交，核酸適體兀件5’端的突光報(bào)告基團(tuán)和互補(bǔ)兀件3’端的熒光淬滅基團(tuán)靠近，熒光被淬滅。當(dāng)檢測(cè)體系中存在含對(duì)硝基苯磺酰胺基的化合物時(shí)，含對(duì)硝基苯磺酰胺基的化合物與核酸適體元件的結(jié)合能力強(qiáng)于互補(bǔ)元件與核酸適體元件的結(jié)合能力，使得熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生明顯的熒光。實(shí)施例4、核酸探針對(duì)不同濃度Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸的響應(yīng)考察探針緩沖液(ρΗ7·4):含 IOOmM Na2HPO4,20mM KH2PO4 和 500mM NaCl，其它為水。分別將實(shí)施例3制備的三組核酸探針進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)I、制備核酸探針體系核酸探針體系由核酸適體元件、互補(bǔ)元件和探針緩沖液組成，核酸適體元件的濃度為0.05 μ M，互補(bǔ)元件的濃度為O. 15 μ Mo 4°C保存。2、取195 μ L核酸探針體系，加入5 μ L Νε-對(duì)硝基苯磺酰_L_賴氨酸溶液(用探針緩沖液配制，Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸的濃度分別為4 μ M、8 μ M、20 μ M、40 μ M、80 μ Μ、200 μ Μ、400 μ Μ、1000 μ Μ、2000 μ M或4000 μ M ;將探針緩沖液作為O濃度對(duì)照)，在室溫下孵育 30 分鐘，然后用酶標(biāo)儀 SpectraMax Μ5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)500_600nm。核酸探針甲的結(jié)果見(jiàn)圖2。核酸探針甲對(duì)Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸有很好的響應(yīng)，并且其響應(yīng)信號(hào)隨著Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸濃度的增大而增大。核酸探針乙和核酸探針丙具有相似的結(jié)果。3、以不同Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸濃度下核酸探針在525nm處的熒光值(F)和O濃度對(duì)照時(shí)核酸探針在525nm處的熒光值(FO)的差值對(duì)Ne -對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸的濃度作圖。
核酸探針甲的結(jié)果見(jiàn)圖3。在O. 5-10 μ M范圍內(nèi)，核酸探針甲的熒光增強(qiáng)信號(hào)對(duì)Ne-對(duì)硝基苯磺酰-L-賴氨酸的濃度有很好地線性關(guān)系。核酸探針乙和核酸探針丙與核酸探針甲具有相似的結(jié)果。實(shí)施例5、核酸探針對(duì)L-賴氨酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液的響應(yīng)考察
分別將實(shí)施例3制備的三組核酸探針進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行如下處理I、將硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將L-賴氨酸溶于Na2C03/NaHC03緩沖液(pHIO、
O.1M)，得到濃度為IOmM的L-賴氨酸溶液，4°C保存；3、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L步驟2制備的L-賴氨酸溶液混合,室溫孵育30分鐘；4、取5uL步驟3得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h，用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm。
陰性對(duì)照組進(jìn)行如下處理I、將硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L Na2C03/NaHC03緩沖液(ρΗ10、0· 1Μ)混合，室溫孵育30分鐘；3、取5uL步驟2得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h，用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm?？瞻讓?duì)照組進(jìn)行如下處理取5uL實(shí)施例4制備的探針緩沖液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h,用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular.Devices Corporation, USA)記錄突光光譜,激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng)500_600nm。核酸探針甲的結(jié)果見(jiàn)圖4。核酸探針甲對(duì)含L-賴氨酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液響應(yīng)體現(xiàn)為熒光信號(hào)大大增強(qiáng)，而對(duì)無(wú)L-賴氨酸的對(duì)照對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液則幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)響應(yīng)，這說(shuō)明本發(fā)明的核酸適體探針體系可以很好地通過(guò)對(duì)硝基苯磺酰氯衍生來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)L-賴氨酸的檢測(cè)。核酸探針乙和核酸探針丙與核酸探針甲具有相似的結(jié)果O實(shí)施例6、核酸探針對(duì)乙醇胺的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液的響應(yīng)考察分別將實(shí)施例3制備的三組核酸探針進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行如下處理I、將硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將乙醇胺溶于Na2C03/NaHC03緩沖液(pHIO、
0.1M)，得到濃度為IOmM的乙醇胺溶液，4°C保存；3、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L步驟2制備的乙醇胺溶液混合，室溫孵育30分鐘；4、取5uL步驟3得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合,室溫孵育3h，用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng) 485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm。陰性對(duì)照組進(jìn)行如下處理I、將硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L Na2C03/NaHC03緩沖液(ρΗ10、0· 1Μ)混合，室溫孵育30分鐘；3、取5uL步驟2得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h，用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm?？瞻讓?duì)照組進(jìn)行如下處理取5uL實(shí)施例4制備的探針緩沖液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h,用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular.Devices Corporation, USA)記錄突光光譜,激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng)500_600nm。核酸探針甲的結(jié)果見(jiàn)圖5。核酸探針甲對(duì)含乙醇胺的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液響應(yīng)體現(xiàn)為熒光信號(hào)大大增強(qiáng)，而對(duì)無(wú)乙醇胺的對(duì)照對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液則幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)響應(yīng)，這說(shuō)明本發(fā)明的核酸適體探針體系可以很好地通過(guò)對(duì)硝基苯磺酰氯衍生來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)乙醇胺的檢測(cè)。核酸探針乙和核酸探針丙與核酸探針甲具有相似的結(jié)果。實(shí)施例7、核酸適體探針對(duì)L-苯丙氨酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液的響應(yīng)考察分別將實(shí)施例3制備的三組核酸探針進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行如下處理1、將硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將L-苯丙氨酸溶于Na2C03//NaHC03緩沖液(pH10、0. 1M)，得到濃度為IOmM的L-苯丙氨酸溶液，4°C保存；3、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L步驟2制備的L-苯丙氨酸溶液混合，室溫孵育30分鐘；4、取5uL步驟3得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h,用酶標(biāo)儀 SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)500_600nm。陰性對(duì)照組進(jìn)行如下處理I、將硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L Na2C03/NaHC03緩沖液(ρΗ10、0· 1Μ)混合，室溫孵育30分鐘；3、取5uL步驟2得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h，用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm?？瞻讓?duì)照組進(jìn)行如下處理取5uL實(shí)施例4制備的探針緩沖液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h,用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular.Devices Corporation, USA)記錄突光光譜,激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng)500_600nm。核酸探針甲的結(jié)果見(jiàn)圖6。核酸探針甲對(duì)含和不含L-苯丙氨酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)響應(yīng)，這說(shuō)明本發(fā)明的核酸適體探針體系對(duì)于在α碳上帶有羧基基團(tuán)的氨基并沒(méi)有響應(yīng)，可以區(qū)分氨基的α碳上是否含有羧基。核酸探針乙和核酸探針丙與核酸探針甲具有相似的結(jié)果。實(shí)施例8、核酸適體探針對(duì)甘氨酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液的響應(yīng)考察分別將實(shí)施例3制備的三組核酸探針進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行如下處理I、將硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將甘氨酸溶于Na2C03/NaHC03緩沖液(pHIO、
0.1M)，得到濃度為IOmM的甘氨酸溶液，4°C保存；3、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L步驟2制備的甘氨酸溶液混合，室溫孵育30分鐘；4、取5uL步驟3得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合,室溫孵育3h，用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng) 485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm。 陰性對(duì)照組進(jìn)行如下處理I、將硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L Na2C03/NaHC03緩沖液(ρΗ10、0· 1Μ)混合，室溫孵育30分鐘；3、取5uL步驟2得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h，用酶標(biāo)儀 SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA 記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng) 485nm,發(fā)射波長(zhǎng)500-600nm?？瞻讓?duì)照組進(jìn)行如下處理取5uL實(shí)施例4制備的探針緩沖液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h,用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular.Devices Corporation, USA)記錄突光光譜,激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng)500_600nm。核酸探針甲的結(jié)果 見(jiàn)圖7。核酸探針甲對(duì)含和不含甘氨酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)響應(yīng)，這說(shuō)明本發(fā)明的核酸適體探針體系對(duì)于在α碳上帶有羧基基團(tuán)的氨基并沒(méi)有響應(yīng)，可以區(qū)分氨基的α碳上是否含有羧基。核酸探針乙和核酸探針丙與核酸探針甲具有相似的結(jié)果。實(shí)施例9、核酸適體探針對(duì)混合氨基酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液的響應(yīng)考察分別將實(shí)施例3制備的三組核酸探針進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組I進(jìn)行如下處理1、將硝基苯磺酰氯溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將各種氨基酸溶于Na2C03/NaHC03緩沖液(pH10、0. 1M)，得到甘氨酸、L-組氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸濃度均為IOmM的混合氨基酸溶液,4°C保存；3、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L步驟2制備的混合氨基酸溶液混合，室溫孵育30分鐘；4、取5uL步驟3得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育 3h,用酶標(biāo)儀 SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)500_600nm。實(shí)驗(yàn)組2進(jìn)行如下處理1、將硝基苯磺酰氯溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將各種氨基酸溶于Na2C03/NaHC03緩沖液(pH10、0. 1M)，得到甘氨酸、L-組氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸和L-纈氨酸濃度均為IOmM的混合氨基酸溶液,4°C保存；3、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L步驟2制備的混合氨基酸溶液混合，室溫孵育30分鐘；4、取5uL步驟3得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育 3h,用酶標(biāo)儀 SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation,USA)記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng)500_600nm。陰性對(duì)照組進(jìn)行如下處理I、將硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到濃度為IM的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、將10 μ L步驟I制備的對(duì)硝基苯磺酰氯溶液與100 μ L Na2C03/NaHC03緩沖液(ρΗ10、0· 1Μ)混合，室溫孵育30分鐘；3、取5uL步驟2得到的溶液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h，用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄突光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng) 500-600nm?？瞻讓?duì)照組進(jìn)行如下處理取5uL實(shí)施例4制備的探針緩沖液，與100 μ L實(shí)施例4的步驟I制備的核酸探針體系混合，室溫孵育3h,用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular.Devices Corporation, USA)記錄突光光譜,激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng)500_600nm。核酸探針甲的結(jié)果見(jiàn)圖8。核酸探針甲對(duì)含L-賴氨酸的混合氨基酸的對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液響應(yīng)體現(xiàn)為熒光信號(hào)大大增強(qiáng)，而對(duì)無(wú)L-賴氨酸的混合氨基酸的對(duì)照對(duì)硝基苯磺酰氯衍生反應(yīng)液則幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)響應(yīng)，這說(shuō)明本發(fā)明的核酸適體探針體系可以很好地通過(guò)對(duì)硝基苯磺酰氯衍生來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)混 合氨基酸中的L-賴氨酸的檢測(cè)。核酸探針乙和核酸探針丙與核酸探針甲具有相似的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.序列表的序列I、序列3或序列5所示的單鏈DNA片段。
2.核酸探針，為核酸探針甲、核酸探針乙或核酸探針丙； 所述核酸探針甲由DNA片段甲-I和DNA片段甲-2組成；所述DNA片段甲-I由序列表的序列I所示核苷酸組成且5’末端具有熒光報(bào)告基團(tuán)；所述DNA片段甲-2由9-11個(gè)與序列表的序列I反向互補(bǔ)的核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)； 所述核酸探針乙由DNA片段乙-I和DNA片段乙-2組成；所述DNA片段乙-I由序列表的序列3所示核苷酸組成且5’末端具有熒光報(bào)告基團(tuán)；所述DNA片段乙-2由9-11個(gè)與序列表的序列3反向互補(bǔ)的核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)； 所述核酸探針丙由DNA片段丙-I和DNA片段丙-2組成；所述DNA片段丙-I由序列表的序列5所示核苷酸組成且5’末端具有熒光報(bào)告基團(tuán)；所述DNA片段丙-2由9-11個(gè)與序列表的序列5反向互補(bǔ)的核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的核酸探針，其特征在于所述DNA片段甲-2由序列表的序列2所示核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)；所述DNA片段乙-2由序列表的序列4所示核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)；所述DNA片段丙-2由序列表的序列6所示核苷酸組成且3’末端具有熒光淬滅基團(tuán)。
4.權(quán)利要求I所述DNA片段、權(quán)利要求2所述核酸探針或權(quán)利要求3所述核酸探針在如下(A)、(B)、(C)、(D)、(E)或(F)中的應(yīng)用(A)檢測(cè)待測(cè)化合物是否為含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；(B)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；(C)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的濃度；(D)檢測(cè)待測(cè)化合物是否為烷基胺類化合物；(E)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在烷基胺類化合物；(F)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中烷基胺類化合物的濃度。
5.一種檢測(cè)待測(cè)化合物是否為含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的方法，包括如下步驟將溶液甲與核酸探針溶液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將溶液乙與所述核酸探針溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著高于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)、所述待測(cè)化合物為候選的含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)沒(méi)有顯著差異、所述待測(cè)化合物為候選的不含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；所述核酸探針溶液為權(quán)利要求2或3所述核酸探針的溶液；所述溶液甲由所述待測(cè)化合物和緩沖液組成；所述溶液乙為所述緩沖液。
6.—種檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的方法，包括如下步驟將溶液甲與核酸探針溶液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將溶液乙與所述核酸探針溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著高于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)、所述待測(cè)物質(zhì)疑似存在含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)沒(méi)有顯著差異、所述待測(cè)物質(zhì)疑似不存在含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；所述核酸探針溶液為權(quán)利要求2或3所述核酸探針的溶液；所述溶液甲由所述待測(cè)化合物和緩沖液組成；所述溶液乙為所述緩沖液。
7.—種檢測(cè)待測(cè)化合物是否為烷基胺類化合物的方法，包括如下步驟將衍生劑的N，N-二甲基甲酰胺溶液與溶液丙混合孵育，然后再將混合液與核酸探針溶液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液與溶液丁混合孵育，然后再將混合液與核酸探針溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著高于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)、所述待測(cè)化合物為候選的烷基胺類化合物，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)沒(méi)有顯著差異、所述待測(cè)化合物為候選的非烷基胺類化合物；所述核酸探針溶液為權(quán)利要求2或3所述核酸探針的溶液；所述衍生劑為硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘；所述溶液丙由所述待測(cè)化合物和緩沖液組成；所述溶液丁為所述緩沖液。
8.—種檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在烷基胺類化合物的方法，包括如下步驟將衍生劑的N, N- 二甲基甲酰胺溶液與溶液丙混合孵育，然后再將混合液與核酸探針溶液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將衍生劑的N，N- 二甲基甲酰胺溶液與溶液丁混合孵育，然后再將混合液與核酸探針溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著高于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)、所述待測(cè)物質(zhì)疑似存在烷基胺類化合物，如果所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)沒(méi)有顯著差異、所述待測(cè)物質(zhì)疑似不存在烷基胺類化合物；所述核酸探針溶液為權(quán)利要求2或3所述核酸探針的溶液；所述衍生劑為硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘；所述溶液丙由所述待測(cè)化合物和緩沖液組成；所述溶液丁為所述緩沖液。
9.一種檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的濃度的方法，包括如下步驟將待測(cè)物質(zhì)溶液與核酸探針的溶液混合孵育后檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)物質(zhì)中所述含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的濃度；所述核酸探針溶液為權(quán)利要求2或3所述核酸探針的溶液。
10.一種檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中烷基胺類化合物的濃度的方法，包括如下步驟將衍生劑的N, N- 二甲基甲酰胺溶液與待測(cè)化合物溶液混合孵育，然后再將混合液與核酸探針溶液混合孵育，然后檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)物質(zhì)中所述烷基胺類化合物的濃度；所述核酸探針溶液為權(quán)利要求2或3所述核酸探針的溶液；所述衍生劑為硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種識(shí)別含對(duì)硝基苯磺酰胺基的化合物的核酸適體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的核酸適體為序列表的序列1、序列3或序列5所示的單鏈DNA片段。所述核酸適體具有如下功能(a)檢測(cè)待測(cè)化合物是否為含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；(b)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物；(c)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中含對(duì)硝基苯磺酰氨基基團(tuán)的化合物的濃度；(d)檢測(cè)待測(cè)化合物是否為烷基胺類化合物；(e)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否存在烷基胺類化合物；(f)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中烷基胺類化合物的濃度。本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏、快速、特異、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102618546SQ201210111610
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者上官棣華, 劉祥軍, 梅宏成, 邴濤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所