專利名稱：一種利用蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用蛹蟲草的液體發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶的方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血栓栓塞性疾病是當(dāng)前危害人類健康、導(dǎo)致死亡率最高的疾病之一，包括急性心肌梗死、缺血性心臟病、心血管疾病、心臟瓣膜病、周邊血管疾病、心律失常、高血壓、腦栓塞、肺栓塞等。日漸成脅著人類的健康。根據(jù)發(fā)表在美國(guó)心臟協(xié)會(huì)的《循環(huán)心血管質(zhì)量與結(jié)果》雜志上的一項(xiàng)研究預(yù)計(jì)，僅僅由于2010年到2030年的衰老和人口增長(zhǎng)，世界范圍內(nèi)的年心血管疾病發(fā)病率將增長(zhǎng)50%。目前治療血栓栓塞疾病的最為有效并且可靠的手段是溶栓療法，因此，溶栓抗栓藥物的研制開發(fā)已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一。目前用于血栓性疾病治療的藥物都不同程度具有纖維蛋白特異性差、體內(nèi)半衰期短、生產(chǎn)成本高、需大劑量連續(xù)用藥等缺點(diǎn)。于是國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者逐漸將目光投向?qū)ふ乙恍┌踩院?、副作用小、療效好的天然來源的溶栓藥物。蟲草菌是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，屬子囊菌門(Ascomycota)、子囊菌綱(Ascomycetes)、幾殼菌亞綱(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草菌屬(Cordyceps Frey Link.),是一種蟲生真菌。在民間，常常被稱為冬蟲夏草。藥理學(xué)研究表明在增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗細(xì)菌和抗真菌等方面具有良好功效。蛹蟲草(Cordyceps militaris)因與冬蟲夏草的活性成分上有著相似的生化結(jié)構(gòu)和藥用功能，近年來備受各界關(guān)注。由于對(duì)蛹蟲草的需求增長(zhǎng)迅速，野生蛹蟲草資源被瘋狂采摘而日益稀缺，因此其廣泛應(yīng)用受到藥源資源的嚴(yán)重制約。研究發(fā)現(xiàn)，通過液體發(fā)酵生產(chǎn)與從蛹蟲草子實(shí)體、菌絲體中直接提取得到的蟲草纖溶酶等活性成分在生化結(jié)構(gòu)、生理作用上基本是相同的，而且具有培養(yǎng)周期短、生產(chǎn)流程易控制、活性物質(zhì)易于提取等優(yōu)點(diǎn)，已有報(bào)道蛹蟲草的纖溶酶等活性物質(zhì)的提取含量及效率都要遠(yuǎn)高于利用人工栽培蟲草進(jìn)行生產(chǎn)和提取。但是目前的蛹蟲草液體培養(yǎng)研究和應(yīng)用仍是起步階段，許多發(fā)酵技術(shù)和工藝仍不成熟，整體產(chǎn)量和發(fā)酵水平較低，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。擴(kuò)張蛋白是在植物細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的一類新蛋白種類。研究表明，擴(kuò)張蛋白幾乎參與了植物的整個(gè)發(fā)育過程除具有增大細(xì)胞的功能外，擴(kuò)張蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、種子萌發(fā)、根毛形成、根系生長(zhǎng)、葉原基形成、葉子生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)成熟、器官脫離，以及花粉管生長(zhǎng)方面起著重要的作用。在擬南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多種植物中均已發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張蛋白，被認(rèn)為其普遍存在于各種雙子葉和單子葉植物的細(xì)胞壁中。試驗(yàn)表明擴(kuò)張蛋白是一類細(xì)胞壁酶蛋白，能夠通過打斷細(xì)胞壁多聚物之間的氫鍵誘導(dǎo)酸依賴的細(xì)胞壁延展和壓力松弛，進(jìn)而可能還是在植物生長(zhǎng)過程中起生理調(diào)控和細(xì)胞壁延伸過程中的一個(gè)重要調(diào)控因子。然而，關(guān)于擴(kuò)張蛋白的作用機(jī)制目前仍未有明確定論，將擴(kuò)張蛋白應(yīng)用于食藥用菌蛹蟲草的液體發(fā)酵進(jìn)行纖溶酶等次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)外目前均未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用擴(kuò)張蛋白進(jìn)行提高蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶產(chǎn)量的方法。本發(fā)明技術(shù)方案具體如下一種利用蛹蟲草的液體發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶的方法，包括如下步驟(I)將蛹蟲草菌種接種到H)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后按體積百分?jǐn)?shù)10 15%的接種量轉(zhuǎn)接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)條件為溫度 20 25°C，搖床培養(yǎng)24 72h，得種子液；(2)將步驟(I)制得種子液按5 15%的體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度20 25°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)20 30h，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為I. O 3. 5mg/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)120 168h，分離去除蛹蟲草菌絲體得纖溶酶發(fā)酵上清液；(3)從步驟(2)制得的纖溶酶發(fā)酵上清液中提取蛹蟲草胞外纖溶酶，即得蛹蟲草纖溶酶。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下馬鈴薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至1000mL。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的活化培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 160r/ min，溫度20 25 °C，暗培養(yǎng)活化24 72h。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的種子發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5顆直徑3 6_的玻璃珠。經(jīng)種子發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，菌球數(shù)量可提高60%以上、菌球直徑縮小40%以上，菌絲松散均勻。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、3g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3 g KH2PO4'
O.3 gK2HP04。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 5 3. 5mg/mL ;進(jìn)一步優(yōu)選的，擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 5 3. Omg/mL ;最優(yōu)選的，所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為 2. Omg/mL ο所述步驟(2)中的擴(kuò)張蛋白溶液可參照現(xiàn)有技術(shù)制備,如采用McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 中的記載的方法制備；也可以按照如下方法制備擴(kuò)張蛋白溶液將蠶豆或黃瓜種子經(jīng)0. 05 0. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水沖洗5 7h，栽入濕蛭石，25 28°C暗培養(yǎng)4 6天；剪取幼苗上胚軸或根系4 5cm，置_20°C預(yù)冷I 2h,加預(yù)冷至O 4°C的勻漿緩沖液勻漿后，用孔徑60 80 μ m的尼龍網(wǎng)過濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置I 3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，O 4°C下提取24 30h，過濾，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向?yàn)V液中緩慢添加 (NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置24 30h， 4°C條件下25000g離心5 IOmin,沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析，透析液經(jīng)20000g離心5 lOmin，取上清液即為制備的擴(kuò)張蛋白溶液。
上述擴(kuò)張蛋白溶液制備方法中，所述勻漿緩沖液組分為25mmol/LHEPES(4-羥乙基哌嗪乙橫酸)，3mmol/L Na2S2O5, Immo 1/L EDTA (乙二胺四乙酸)，O. Iwt % Triton X-100, pH 7. O ;所述提取液組分為25mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，I. Ommol/L EDTA,3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaCl，pH 6. 8 ;所述酸性緩沖液配制是將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至4. 0，水定容至1L。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(2)中所述的分離是在4°C 12000r/min條件下離心分離 10 15min。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中提取蛹蟲草胞外纖溶酶的方法，步驟如下在0°C條件下，向步驟(2)制得的纖溶酶發(fā)酵上清液中按O. 14g/mL的添加量添加研磨后的(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，(TC靜置沉淀4 8h去除雜蛋白，4 12000rpm離心IOmin,棄沉淀,按O. 51g/mL的添加量將研磨后的硫酸銨加入上清液，靜置4 8h ;4°C條件下，12000rpm離心lOmin，棄上清液，沉淀溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中；用截留分子量為3000Da的透析袋透析，然后用截留分子量為3000Da的透析膜進(jìn)行超濾濃縮，除去小分子的蛋白質(zhì)，即得蛹蟲草胞外纖溶酶。所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制方法是將O. 69g磷酸二氫鈉、O. 012g檸檬酸溶于蒸餾水中，定容至lL，pH 8.0。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明將植物擴(kuò)張蛋白和優(yōu)化后的發(fā)酵方法應(yīng)用于蛹蟲草纖溶酶的液體發(fā)酵生產(chǎn)，大幅度提高了蟲草纖溶酶的液體發(fā)酵產(chǎn)量，使產(chǎn)量達(dá)到每升發(fā)酵液93270U，是傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)方法(對(duì)比例I)產(chǎn)量的2. 69倍以上，具有極好的工業(yè)化應(yīng)用前景。2、本發(fā)明采用液體好氧發(fā)酵方法，一般為6 8天，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，產(chǎn)量高，周期短，無需靜置培養(yǎng)及誘導(dǎo)合成產(chǎn)物等過程，生產(chǎn)效率較高，所生產(chǎn)的蛹蟲草的纖溶酶活性成分可直接用于治療心血管疾病、高血壓、腦栓塞、肺栓塞等血栓栓塞性疾病藥物的制備；3、本發(fā)明所述擴(kuò)張蛋白可從大多數(shù)雙子葉和單子葉植物中提取，來源廣泛，成本較低，本發(fā)明的制備方法經(jīng)優(yōu)化后步驟也相對(duì)簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高，可規(guī)模提取生產(chǎn)，對(duì)蛹蟲草纖溶酶類活性物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)具有很好的促進(jìn)和提升效果；4、本發(fā)明所采用的蛹蟲草液體發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，環(huán)保無毒，原材料成本低廉，而且全發(fā)酵過程可控，不受外部環(huán)境條件限制，非常適合工業(yè)規(guī)?；l(fā)酵罐培養(yǎng)生產(chǎn)。本方法也適用于其它普通香菇栽培品種5、本發(fā)明對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基和種子發(fā)酵培養(yǎng)基的配方進(jìn)行了優(yōu)化，能夠大幅度提高蛹蟲草的纖溶酶活性成分的產(chǎn)量。


圖I是不同濃度的擴(kuò)張蛋白溶液對(duì)蛹蟲草的纖溶酶產(chǎn)量的影響曲線；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。原料及培養(yǎng)基實(shí)施例中所述的蛹蟲草(Cordyceps militaris)發(fā)酵菌種，菌種保藏號(hào)為CGMCCNo. 5. 700和CGMCC No. 3. 4655，購自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。實(shí)施例中的凝血酶、纖維蛋白原瓊脂、尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品均購自濟(jì)南盛偉生物科技有限公司；實(shí)施例中所述的擴(kuò)張蛋白溶液的制備步驟如下將蠶豆(Vicia fabaL.;購自濟(jì)南茂豐種苗有限公司)或黃瓜(Cucumis sativus L. CV. JinnianNo. 6 ;購自濟(jì)南偉麗種業(yè)有限公司)種子經(jīng)O. 15wt% HgCl2消毒6min,流水沖洗6h，栽入濕蛭石中，27°C暗培養(yǎng)4d。剪取幼苗上胚軸4 5cm，即生長(zhǎng)區(qū)約100g， 置-20°C冰箱預(yù)冷lh，加預(yù)冷至4°C的勻漿緩沖液，高速勻漿后，用70 μ m尼龍網(wǎng)過濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置2h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4°C下提取24h，過濾，濾液按O. 4g/mL的添加量向?yàn)V液中緩慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4S程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置24h，4°C條件下25000g 離心5min，沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4 °C條件下用截留分子量為3000Da的聚偏氟乙烯 (PVDF)透析袋(購自北京博潤(rùn)萊特科技有限公司)透析，透析液經(jīng)20000g離心5min，取上清液即為制備的擴(kuò)張蛋白溶液，置4°C下保存。其他未描述步驟可參照McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J,Durachko D M,Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 以及https://homes, bio. psu. edu/expansins/ProtocoIs/Extraction. htm 中的描述進(jìn)行。上述勻漿緩沖液組分為25mmol/LHEPES (4_羥乙基哌嗪乙磺酸)，3mmol/ LNa2S2O5, Immol /T, EDTA, O. Iwt% Triton X-100, pH 7. 0 ；上述提取液組分為25mmol/LHEPES, I. OmmoI/L EDTA,3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/ LNaCl，pH 6. 8 ；所述酸性緩沖液每升按如下方法配制將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4. 0，水定容至1L。擴(kuò)張蛋白溶液濃度的測(cè)定方法采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，具體可參照(《精編蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，ISBN:703018086，出版日期1900-1-1)中記載的考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行操作， 以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)檢測(cè)上述擴(kuò)張蛋白溶液中擴(kuò)張蛋白濃度為O. 31g/mL。實(shí)施例中所述的ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下馬鈴薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至lOOOmL。實(shí)施例中所述的種子發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5顆直徑3 6mm的玻璃珠。實(shí)施例中所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、3g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3 g KH2PO4'
O.3g/L K2HPO4。實(shí)施例中所述的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制方法是將O. 69g磷酸二氫鈉、
O.012g朽1檬酸溶于蒸懼水中，定容至1L, pH 8.0。實(shí)施例I :一種利用擴(kuò)張蛋白提高蛹蟲草的纖溶酶成分產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，包括如下步驟
(I)將蛹蟲草(Cordyceps militaris)菌種，菌種編號(hào)為 CGMCC No. 5. 700,接種到ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，在溫度25°C、搖床轉(zhuǎn)速150r/min的條件下暗培養(yǎng) 48h，然后按體積百分?jǐn)?shù)15 %的接種量轉(zhuǎn)接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)條件為 溫度25°C，搖床培養(yǎng)48h，得種子液；(2)將步驟⑴制得種子液按15%體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25°C 的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)24h,然后加入擴(kuò)張蛋白溶液,使擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 5mg/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)144h, 12000r/min條件下離心分離IOmin,去菌絲沉淀得到發(fā)酵上清液；(3)從步驟(2)制得的蛹蟲草發(fā)酵上清液中提取蛹蟲草胞外纖溶酶的方法，步驟如下在0°C條件下，向步驟(2)制得的纖溶酶發(fā)酵上清液中按O. 14g/mL的添加量添加研磨后的(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，(TC靜置沉淀4h去除雜蛋白，4 12000rpm離心IOmin,棄沉淀,按O. 51g/mL的添加量將研磨后的硫酸銨加入上清液，靜置6h ;4°C條件下，12000rpm離心lOmin，棄上清液，沉淀溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中；用截留分子量為3000Da的透析袋透析，然后用截留分子量為3000Da 的透析膜進(jìn)行超濾濃縮，除去小分子的蛋白質(zhì)，即得蛹蟲草胞外纖溶酶。蛹蟲草纖溶酶待測(cè)樣品的制備將通過IL發(fā)酵液制得的纖溶酶用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至10mL，取 100 μ L稀釋至5mL得蛹蟲草纖溶酶待測(cè)樣品。蟲草纖溶酶活性成分的測(cè)定采用本領(lǐng)域常規(guī)的纖維蛋白平板法，測(cè)定方法參見文獻(xiàn)(Astrup S，Mullertz. The fibrin Plate method for estimating of fibrinolytic activity[J]Archives of Biochemistry and Biophysics, 1952,40 :346-351)(I)纖維蛋白平板的制作將凝血酶與37°C的纖維蛋白原瓊脂溶液混合，即生成纖維蛋白，立即倒平板，待凝固后即為纖維蛋白平板。點(diǎn)樣梯度濃度的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品，37°C恒溫孵育18h，測(cè)其溶解圈直徑，log (cm2)與log(U/mL)呈線性相關(guān)。根據(jù)待測(cè)樣品的溶圈面積大小計(jì)算出蛹蟲草纖溶酶待測(cè)樣品相當(dāng)尿激酶的活力單位，來表示蛹蟲草纖溶酶待測(cè)樣品的纖溶活性。(2)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定配制濃度為100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL 的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液。取
以上各濃度的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μ L點(diǎn)樣于纖維蛋白平板，37°C培養(yǎng)6h，游標(biāo)卡尺測(cè)量水解圈的兩垂直直徑。以水解圈垂直直徑的乘積的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，尿激酶濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，做尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)樣品纖溶活性的測(cè)定取100 μ L蛹蟲草纖溶酶待測(cè)樣品點(diǎn)樣于纖維蛋白平板的牛津杯小孔內(nèi)，37°C培養(yǎng)6h，游標(biāo)卡尺測(cè)量水解圈的兩垂直直徑。參照尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程計(jì)算待測(cè)樣品的纖溶活性為114. 98U/mL。每升蛹蟲草發(fā)酵液對(duì)應(yīng)的纖溶酶活力為114. 98U/mLX (5mL/100 μ L) X IOmL = 57490U ;結(jié)果如圖I所示。實(shí)施例2
8
如實(shí)施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為2. Omg/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)144h。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，每毫升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為93. 27U，即每升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為93270U ;結(jié)果如圖I所示。實(shí)施例3 如實(shí)施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為2. 5mg/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)144h。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，每毫升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為81. 32U，即每升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為81320U ;結(jié)果如圖I所示。實(shí)施例4如實(shí)施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為3. Omg/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)144h。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，每毫升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為82. 02U,即每升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為82020U ;結(jié)果如圖I所示。實(shí)施例5 如實(shí)施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為3. 5mg/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)144h。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，每毫升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為77. 75U，即每升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為77750U ;結(jié)果如圖I所示。實(shí)施例6 如實(shí)施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，發(fā)酵所用的蛹蟲草(Cordyc印s militaris)菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 3. 4655，購自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為2. Omg/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)144h。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，每毫升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為89. 84U，即每升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為89840U。對(duì)比例I如實(shí)施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，所述步驟(2)中用不含擴(kuò)張蛋白的酸性緩沖液替代實(shí)施例加入的擴(kuò)張蛋白溶液，溫度25°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)168h。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，每毫升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為34. 66U，即每升蛹蟲草發(fā)酵液的纖溶酶成分活力為34660U ;結(jié)果如圖I所示。
權(quán)利要求
1.一種利用蛹蟲草的液體發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將蛹蟲草菌種接種到ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后按體積百分?jǐn)?shù) 10 15%的接種量轉(zhuǎn)接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)條件為溫度20 250C，搖床培養(yǎng)24 72h，得種子液；(2)將步驟(I)制得種子液按5 15%的體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度 20 25°C的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)20 30h，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為1.O 3. 5mg/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)120 168h，分離去除蛹蟲草菌絲體得纖溶酶發(fā)酵上清液；(3)從步驟(2)制得的纖溶酶發(fā)酵上清液中提取蛹蟲草胞外纖溶酶，即得蛹蟲草纖溶酶。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的活化培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 160r/min，溫度20 25°C，暗培養(yǎng)活化24 72h。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的種子發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g 葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0.03g CaCl2、0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5顆直徑3 6mm的玻璃珠。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、3g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0.03g CaCl2,0. 3 g KH2P04、0. 3 gK2HP04。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴(kuò)張蛋白的濃度為I.5 3.5mg/mL ;進(jìn)一步優(yōu)選的,擴(kuò)張蛋白的濃度為I. 5 3. Omg/mL ;最優(yōu)選的,所述步驟⑵中， 擴(kuò)張蛋白的濃度為2. Omg/mL。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的擴(kuò)張蛋白溶液按照如下方法制備將蠶豆或黃瓜種子經(jīng)O. 05 O. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水沖洗5 7h，栽入濕蛭石，25 28°C暗培養(yǎng)4 6天；剪取幼苗上胚軸或根系4 5cm，置_20°C預(yù)冷I 2h，加預(yù)冷至O 4°C的勻漿緩沖液勻漿后，用孔徑60 80 μ m的尼龍網(wǎng)過濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置I 3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液， O 4°C下提取24 30h,過濾，按O. 3 O. 5g/mL的添加量向?yàn)V液中緩慢添加(NH4)2SO4, 添加(NH4)2SO4S程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置24 30h，4°C條件下 25000g離心5 IOmin,沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液經(jīng)20000g離心5 lOmin，取上清液即為制備的擴(kuò)張蛋白溶液。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液組分為25mmol/L4-羥乙基哌嗪乙橫酸，3mmol/LNa2S205, lmmol/LEDTA, O. lwt% Triton X-100, pH 7. 0 ;所述提取液組分為25mmol/L 4-輕乙基哌嗪乙磺酸，I. 0mmol/L乙二胺四乙酸,3mmol/L Na2S2O5, 0. 5mol/L NaCl，pH 6. 8 ;所述酸性緩沖液配制是將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié) pH至4. 0，水定容至1L。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟⑵中所述的分離是在4°C12000r/min 條件下離心分離10 15min。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中提取蛹蟲草胞外纖溶酶的方法，步驟如下在0°c條件下，向步驟(2)制得的纖溶酶發(fā)酵上清液中按O. 14g/mL的添加量添加研磨后的(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，(TC靜置沉淀 4 8h去除雜蛋白，4 12000rpm離心IOmin,棄沉淀,按O. 51g/mL的添加量將研磨后的硫酸銨加入上清液，靜置4 8h ;4°C條件下，12000rpm離心lOmin，棄上清液，沉淀溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中；用截留分子量為3000Da的透析袋透析，然后用截留分子量為 3000Da的透析膜進(jìn)行超濾濃縮，除去小分子的蛋白質(zhì)，即得蛹蟲草胞外纖溶酶。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制方法是將O. 69g磷酸二氫鈉、O. 012g檸檬酸溶于蒸餾水中，定容至lL，pH 8.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用蛹蟲草的液體發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶的方法，(1)將蛹蟲草菌種接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行種子培養(yǎng)，得種子液；(2)將種子液按5～15％的體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，液體發(fā)酵培養(yǎng)20～30h，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液，繼續(xù)培養(yǎng)120～168h，分離去除蛹蟲草菌絲體得纖溶酶發(fā)酵上清液；(3)從纖溶酶發(fā)酵上清液中提取蛹蟲草胞外纖溶酶，即得蛹蟲草纖溶酶。本發(fā)明將植物擴(kuò)張蛋白和優(yōu)化后的發(fā)酵方法應(yīng)用于蛹蟲草纖溶酶的液體發(fā)酵生產(chǎn)，大幅度提高了蟲草纖溶酶的液體發(fā)酵產(chǎn)量，使產(chǎn)量達(dá)到每升發(fā)酵液93270U，是傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)方法產(chǎn)量的2.69倍以上，具有極好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N9/68GK102604919SQ201210111230
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者萬魯長(zhǎng), 任海霞, 任鵬飛, 單洪濤, 姚強(qiáng), 孫濤, 宮志遠(yuǎn), 李瑾, 王 琦, 韓建東, 高能 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所