專利名稱：基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用透明顫菌血紅蛋白基因在皮爾瑞俄類芽孢桿菌中的表達(dá)，因而提高了皮爾瑞俄類芽孢桿菌菌體對氧的利用率，以提高多肽類
抗生素的產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料的使用引起環(huán)境污染、生態(tài)惡化、農(nóng)業(yè)3R問題，對食品安全、人類健康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了巨大的威脅和挑戰(zhàn)。因此，發(fā)展可持續(xù)性農(nóng)業(yè)，就要減少化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料的使用量，尋找有效的替代品。
微生物農(nóng)藥和微生物肥料，具有持效期長、不污染環(huán)境等特點(diǎn)，是化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料的最有效的替代品。合理開始和利用微生物農(nóng)藥和微生物肥料，是我國農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要途徑。農(nóng)用抗生素是微生物代謝過程中產(chǎn)物的次級代謝產(chǎn)物，在低濃度下即可用于防治植物病蟲害或調(diào)節(jié)植物生長和抗病毒的生物制劑。日本是最早開始使用農(nóng)用抗生素和進(jìn)行農(nóng)用抗生素大規(guī)模生產(chǎn)的國家，并率先研制出了用于防治水稻三大病害(稻瘟病、紋枯病和白葉枯病)的抗生素，并實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)，此后日本又將有效霉素、春日霉素、多氧霉素、滅瘟素等幾十種農(nóng)用抗生素應(yīng)用于農(nóng)用生產(chǎn)，并進(jìn)一步失去了全球農(nóng)用抗生素的生產(chǎn)和使用。目前美國投入并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的抗生素達(dá)幾十個品種，印度已研究開發(fā)出了用于防治大麥和水稻等病害的金色制毒素和雜曲霉素；俄羅斯目前已開發(fā)出了灰黃霉素、植菌霉素等多種農(nóng)用抗生素。近十年來，我國研制出的農(nóng)用抗生素?cái)?shù)量不斷增加，如西北農(nóng)林科技大學(xué)報(bào)道的多肽類抗生素、廣東農(nóng)科院植保所報(bào)道的萬隆霉素、上海農(nóng)藥研究所報(bào)道的金核霉素和磷氮霉素、浙江農(nóng)科院微生物所報(bào)道的抑霉菌素、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)道的梅嶺霉素、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所報(bào)道的波拉霉素，其中多肽類抗生素和波拉菌素已獲得國家專利。芽孢桿菌因其分布廣，易分離培養(yǎng)；生長快、營養(yǎng)簡單；對人畜無毒無害，不污染環(huán)境；能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢等特點(diǎn)，已受到人們關(guān)注。皮爾瑞俄類芽孢桿菌Paenibacillus peoriae是在土壤中發(fā)現(xiàn)的具有拮抗作用的細(xì)菌。該屬細(xì)菌分泌植物激素植物生長素和細(xì)胞分裂素，或固氮作用促進(jìn)植物生長。同時產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，水解酶類如幾丁質(zhì)酶，纖維素酶；多肽類抗生素，一種具有抗細(xì)菌活性屬于黏菌素一環(huán)桿菌素家族，包括如含有二氨基丁酸結(jié)構(gòu)的 polypeptim、jolipeptin、gavascrin 和 saravalin 等；另一種具有抗真菌和放線菌活性包括gatavalin和thsaricidim。這些物質(zhì)起到預(yù)防植物病害和抑制植物病原菌作用。皮爾瑞俄類芽孢桿菌是一種高好氧細(xì)菌，在其工業(yè)發(fā)酵中后期，由于菌體密度過大造成供氧不足，影響菌體的生長以及次生代謝產(chǎn)物的合成。此外，在施入土壤后，如果土壤中氧氣含量低，會影響該菌體的生長的定殖能力，進(jìn)而影響其防病效果。
透明顫菌血紅蛋白是由透明顫菌屬產(chǎn)生的一種可溶性血紅蛋白，這種血紅蛋白能在貧氧條件下被大量誘導(dǎo)合成，使透明顫菌在微氧條件下能夠很好地生存。透明顫菌血紅蛋白已經(jīng)成功克隆到多種細(xì)菌中，VHb的表達(dá)提高了宿主的耐低氧能力，提高了菌體的密度和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。1996年Kallio等在含α -淀粉酶的基因工程大腸桿菌中成功表達(dá)vgb基因，結(jié)果表明VHb的表達(dá)使細(xì)胞密度提高，同時酶產(chǎn)量得到了數(shù)倍的提高。2002年于慧敏等構(gòu)建了 VHb整合型ρΗΒ(聚β -輕基丁酸酯Poly-β-hydroxybutyrate)產(chǎn)生菌VGl (Ptul4)，解決了產(chǎn)品生產(chǎn)過程中高耗氧以及高成本的問題。2004年陳文清等將VHb在弗氏鏈霉菌中獲得表達(dá)，并提高了泰樂星抗生素的產(chǎn)量。除此之外VHb還先后在十多種原核生物中如鏈霉菌、根瘤菌、枯草芽孢桿菌、獸疫鏈球菌等獲得了表達(dá)，使抗生素、酶、透明質(zhì)酸等產(chǎn)量得到了提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對氧的利用率高，發(fā)酵產(chǎn)孢數(shù)和多肽類抗生素產(chǎn)量高 的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌及發(fā)酵方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌，其中，所述基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌為皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I的染色體上整合有-P43-Vgb-片段。上述技術(shù)方案所述的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌，其中，所述-P43-Vgb-片段中的P43為啟動子。一種基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌,其分類命名為Paenibacillus peoriaeBC39,保藏編號為CGMCC NO. 5900?；蛑亟M皮爾瑞俄類芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其中，將來自于透明顫菌血紅蛋白基因vgb，構(gòu)建重組整合載體pIB139-P43-vgb(即pJDlOO);通過基因重組整合載體PIB139-P43-vgb中含有attP整合位點(diǎn)，將-P43-Vgb-片段整合到皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I的染色體上，獲得了基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌即皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39 (Paenibacillus peoriae BC39)。上述技術(shù)方案所述的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其中，包括以下具體步驟(I)、PCR 擴(kuò)增 P43 啟動子以枯草芽孢桿菌基因組為模板，以P43-F/P43-R為引物，擴(kuò)增P43啟動子；其中，P43-F CCCAAGCTTGATAGGTGGTATGTTTCGCTTG ；P43-R GGTTTGCTGGTCTAACATGTGTACATTCCTCTTT ；(2)、PCR擴(kuò)增透明顫菌血紅蛋白基因vgb以質(zhì)粒pRK404_VHb以模板，Vgb_F/Vgb_R為引物，擴(kuò)增透明顫菌血紅蛋白基因vgb ;其中vgb-F TGGTTTGCTGGTCTAACATGCGGCTGGATCCTACCA ；vgb-R CGGAATTAGGTACCAGCCCGACCCGAGCAC ；(3)、重疊延伸拼接P43啟動子和vgb用PCR回收試劑盒回收再次PCR的產(chǎn)物，并并以步驟⑴和⑵的回收產(chǎn)物為模板，以P43-F/Vgb-R為引物，采用重疊延伸拼接的方法擴(kuò)增融合基因；(4)、基因重組整合載體pIB139-P43_vgb的構(gòu)建用PCR回收試劑盒回收步驟(3)的重疊PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pSET152衍生質(zhì)粒PIB139上，連接體系為4 μ IPCR產(chǎn)物，5 μ ISolution I，I μ 1ρΙΒ139載體，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物取5μ I用來轉(zhuǎn)化E. coli DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，加Iml的無抗LB，放入37°C的搖床預(yù)培養(yǎng)lh。取預(yù)培養(yǎng)后的菌液放入新的ep管中，加入300ul無抗LB，涂布于含有紅霉性抗性的LB平板上37°C培養(yǎng)，次日挑選抗性斑劃線。(5)基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌工程菌BC39的構(gòu)建制備皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I感受態(tài)細(xì)胞；用BamH I將基因重組整合載體pIB139-P43-vgb線性化，切膠回收，隨后將IOOng DNA加入200 μ I皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I感受態(tài)細(xì)胞中，孵育20min ;加入LB和紅霉素，培養(yǎng)90min，然后涂布紅霉素抗性平板，37°C倒置培養(yǎng)12-16h ;挑選抗性菌落，劃線到另一個平板；從紅霉素平板上挑取轉(zhuǎn)化子，然后在另一個平板上劃線培養(yǎng)，同時挑取一部分菌株做Southern雜交，以研究vgb表達(dá)框是否真正整合到皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I的染色體上，采用整合質(zhì)粒PSET152上的OC31attp位點(diǎn)約2. 3kb的片段作為探針，與接合子總DNA經(jīng)BamH I酶切的片段雜交分析鑒定接合子是否完成接合轉(zhuǎn)移。上述技術(shù)方案所述的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其中，步驟(I)的PCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ;94°C變性45sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec ；30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;步驟⑵中的PCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 45sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 30sec ；30 個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；;步驟(3)中的PCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ;94°C變性45sec，58°C退火 lmin，72°C延伸 Imin ；30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ； 上述技術(shù)方案中所述的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)多肽類抗生素中的應(yīng)用，包括下述步驟(I)、菌種活化將保藏的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39劃線接種于固體種子培養(yǎng)基斜面上，接種前將裝有培養(yǎng)基的三角瓶在121°C條件下滅菌30min，接種后在30°C條件下培養(yǎng)30 48h，配成孢子液，以5%接種量用于種子罐接種。(2)、種子罐發(fā)酵先將一級種子罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°C，將孢子液接入培養(yǎng)液中，通入無菌氧氣培養(yǎng)，可得一級種子罐發(fā)酵菌液；將二級種子種子罐在121°C下滅菌30min，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°C，將一級種子罐發(fā)酵液按5%接種量接二級種子罐，通入無菌氧氣和攪拌進(jìn)行培養(yǎng)，可得二級種子罐發(fā)酵菌液；(3)、生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)先將發(fā)酵罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，保壓降溫到30°C，按8 %的接種量將二級種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng),通入無菌空氣。所述滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在121°C,壓力O. 3-0. 5kg/cm2條件下滅菌30min。一級種子罐培養(yǎng)條件，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : 0.5，機(jī)械攪拌270印111，301恒溫培養(yǎng)24h;二級種子罐培養(yǎng)條件，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : O. 5，機(jī)械攪拌220rpm，30°C恒溫培養(yǎng)24h ;發(fā)酵罐接種后，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : O. 5，機(jī)械攪拌140rpm，30°C恒溫培養(yǎng)65_70h。種子罐培養(yǎng)液配方以g/L計(jì)，黃豆餅30，工業(yè)葡萄糖20，NaCl 5，MgS04 ·7Η200· 1，K2HPO4 O. 1，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 O. I。發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方以g/L計(jì)，黃豆餅30，地瓜粉5，飴糖25，NaCl 5，MgSO4 · 7H20O. I, K2HPO4O. I, FeSO4 · 7H20 O. I。本發(fā)明之基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌通過以下方法得到將來自于透明顫菌血紅蛋白基因vgb，通過重疊延伸PCR技術(shù)置于強(qiáng)啟動子P43的調(diào)控下，構(gòu)建基因重組整合載體PJDlOO (pIB139-P43-vgb);通過基因重組整合載體pJDlOO中含有attP整合位點(diǎn)，將-P43-Vgb-片段整合到皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I的染色體上，獲得了基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39。所述基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39保藏日期2012年03月15日，保藏單位中國普通微生物菌種保藏中心(簡稱CGMCC);保藏單位地址北京市朝陽區(qū) 北辰西路I號院，中國科學(xué)院微生物研究所囷種保減中心；保減編號CGMCC NO. 5900。以基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌為出發(fā)菌發(fā)酵多肽類抗生素的方法是利用基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39在生產(chǎn)和應(yīng)用過程中，表達(dá)有活性的VHb蛋白，主要工藝流程包括菌種活化、一級種子罐發(fā)酵培養(yǎng)、二級種子罐發(fā)酵培養(yǎng)和生產(chǎn)用發(fā)酵罐培養(yǎng),具體包括以下步驟(I)菌種活化將保藏的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39劃線接種于固體種子培養(yǎng)基斜面上，接種前將裝有培養(yǎng)基的三角瓶在121°C條件下滅菌30min，接種后在30°C條件下培養(yǎng)30 48h，配成孢子液，以5%接種量用于種子罐接種。(2)種子罐發(fā)酵先將一級種子罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°C，將孢子液接入培養(yǎng)液中，通入無菌氧氣培養(yǎng)，可得一級種子罐發(fā)酵菌液；將二級種子種子罐在121°C下滅菌30min，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°C，將一級種子罐發(fā)酵液按5%接種量接二級種子罐，通入無菌氧氣和攪拌進(jìn)行培養(yǎng)，可得二級種子罐發(fā)酵菌液；(3)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)先將發(fā)酵罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，保壓降溫到30°C，按8 %的接種量將二級種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng),通入無菌空氣。所述滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在121°C,壓力O. 3-0. 5kg/cm2條件下滅菌30min。一級種子罐培養(yǎng)條件，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : 0.5，機(jī)械攪拌270印111，301恒溫培養(yǎng)24h;二級種子罐培養(yǎng)條件，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : O. 5，機(jī)械攪拌220rpm，30°C恒溫培養(yǎng)24h;發(fā)酵罐接種后，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : O. 5，機(jī)械攪拌140rpm，30°C恒溫培養(yǎng)65_70h。種子罐培養(yǎng)液配方以g/L計(jì)，黃豆餅30，工業(yè)葡萄糖20，NaCl 5，MgS04 ·7Η200· 1，K2HPO4O. 1，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 O. I。 發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方以g/L計(jì)，黃豆餅30，地瓜粉5，飴糖25，NaCl 5，MgSO4 · 7H20O. I, K2HPO4O. I, FeSO4 · 7H20 O. I。透明顫菌血紅蛋白功能驗(yàn)證
I. PCR檢測透明顫菌血紅蛋白基因的表達(dá)通過CO結(jié)合差光譜檢測vgb基因是否能成功表達(dá)具有生物活性的VHb蛋白。2.基因重組菌株對氧的利用特性在溶解氧濃度高于30%和溶解氧濃度低于10%的條件下測定菌株的攝氧率。3.工程菌生長情況檢測通過血球計(jì)數(shù)板和稀釋涂平板法來測定發(fā)酵后的產(chǎn)孢數(shù)。4.多肽類抗生素產(chǎn)量測定在溶解氧濃度高于30%和溶解氧濃度低于10%的條件下發(fā)酵，通過平板抑菌試 驗(yàn)來測定多肽類抗生素產(chǎn)量。
本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明利用透明顫菌血紅蛋白基因在皮爾瑞俄類芽孢桿菌中的表達(dá)，提高了皮爾瑞俄類芽孢桿菌對氧氣的利用率。在低溶氧條件下，在發(fā)酵前期，溶氧濃度對原始菌株和工程菌株的影響相對較小，進(jìn)入發(fā)酵中后期，皮爾瑞俄類芽孢桿菌受溶氧濃度的影響較大，工程菌株由于VHb蛋白表達(dá)提高了氧在呼吸鏈上的流動性，降低了細(xì)胞內(nèi)氧的濃度，提高了 菌體自身的攝氧能力，所以工程菌株的多肽類抗生素的產(chǎn)量比原始菌株提高45 %。本發(fā)明基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌即皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39，分類命名為Paenibacillus peoriae,已經(jīng)在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC NO. 5900，保藏日期為2012年03月15日。


I、圖I為P43啟動子和vgb的重疊延伸拼接的構(gòu)建流程圖；2、圖2為P43啟動子和vgb的重疊延伸拼接PCR圖譜；3、圖3重組質(zhì)粒pJDlOO的構(gòu)建流程圖；4、圖4為基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子的Southern雜交檢測鑒定圖譜；5、圖5為本發(fā)明基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌的CO差光譜圖；6、圖6為本發(fā)明基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程圖；7、圖7為皮爾瑞俄類芽孢桿菌和工程菌在低溶氧條件下菌體的濃度；8、圖8為皮爾瑞俄類芽孢桿菌和工程菌在高溶氧條件下菌株的攝氧率；9、圖9為皮爾瑞俄類芽孢桿菌和工程菌在低溶氧條件下菌株的攝氧率。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明實(shí)施例利用皮爾瑞俄類芽孢桿菌(Paenibacillus peoriae)的LXH-B-I作為受體菌，將透明顫菌血紅蛋白基因vgb，通過構(gòu)建基因重組表達(dá)載體pJDlOO (pIB139-P43-vgb)，將vgb整合到皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，構(gòu)建出產(chǎn)孢數(shù)和產(chǎn)量更高的產(chǎn)多肽類抗生素的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌即皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39，下述實(shí)施例和試驗(yàn)例中所用的試劑和載體為市場購買，所采用的方法為本領(lǐng)域的常用方法。
實(shí)施例一、基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌的構(gòu)建:(I) PCR擴(kuò)增P43啟動子根 據(jù)GenBank中登錄的登錄號為NO. K02174的P43序列，設(shè)計(jì)引物P43-F CCCAAGCTTGATAGGTGGTATGTTTCGCTTG,下劃線為 Hind III 為酶切位點(diǎn)；P43_R GGTTTGCTGGTCTAACATGTGTACATTCCTCTTT，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的基因組DNA(可以為通過采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨)提取獲得)作為基因擴(kuò)增的模板，枯草芽孢桿菌購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(ACCC)，P43-F/P43-R為引物，擴(kuò)增P43啟動子，反應(yīng)體系10X擴(kuò)增緩沖液10ul，4種dNTP (TaKaRa)混合物各200umol/L，引物P43-F工作濃度為50pmol/L，引物P43-R工作濃度為 50pmol/L，模板 DNA lug, Taq DNA 聚合酶(TaKaRa) 2. 5ug, Mg2+濃度為 I. 5mmol/L,力口雙蒸水至lOOul，該反應(yīng)體系是本領(lǐng)域的常用技術(shù)；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ;94°C變性45sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec ；30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;P43啟動子大小為O. 28kb (如圖2中I泳道所示)；(2) PCR擴(kuò)增透明顫菌血紅蛋白基因vgb根據(jù)GenBank中登錄的登錄號為N0.M27061的vgb基因序列，設(shè)計(jì)引物vgb_F TGGTTTGCTGGTCTAACATGCGGCTGGATCCTACCA 和 vgb-R CGGAATTAGGTACCAGCCCGACCCGAGCAC,下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；以質(zhì)粒pRK404-VHb (Addgene)以模板，Vgb-F/Vgb-R為引物，擴(kuò)增透明顫菌血紅蛋白基因vgb ;反應(yīng)體系10X擴(kuò)增緩沖液10ul，4種dNTP(TaKaRa)混合物各200umol/L,引物Vgb-F工作濃度為50pmol/L,引物Vgb-R工作濃度為50pmol/L,模板DNA lug, Taq DNA聚合酶(TaKaRa) 2. 5ug, Mg2+濃度為I. 5mmol/L,加雙蒸水至IOOul,該反應(yīng)體系是本領(lǐng)域的常用技術(shù)；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ;94°C變性45sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec ;30個循環(huán)；72· 延伸IOmin ;透明顫菌血紅蛋白基因vgb大小為O. 46kb (如圖2中2泳道所示)；(3)重疊延伸拼接P43啟動子和vgb用PCR回收試劑盒回收再次PCR的產(chǎn)物，并兩種回收產(chǎn)物為模板，以P43-F/Vgb_R為引物，采用重疊延伸拼接的方法擴(kuò)增O. 74kb的融合基因，反應(yīng)體系10X擴(kuò)增緩沖液IOul，4 種 dNTP (TaKaRa)混合物各 200umol/L，引物 P43-F 工作濃度為 50pmol/L，引物 Vgb-R工作濃度為 50pmol/L,模板 DNA lug, Taq DNA 聚合酶(TaKaRa) 2. 5ug,Mg2+濃度為 I. SmmoI /L，加雙蒸水至lOOul，該反應(yīng)體系是本領(lǐng)域的常用技術(shù)；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ；94°C變性45sec，58°C退火lmin，72°C延伸Imin ；30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;電泳檢測結(jié)果;具體流程如圖I所示，PCR檢測結(jié)果見圖2。(4)基因重組整合載體pJD100(pIB139-P43-vgb)的構(gòu)建用PCR回收試劑盒回收重疊PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pSET152衍生質(zhì)粒PIB139上，連接體系為4 μ IPCR產(chǎn)物，5 μ ISolution Ι，1μ1 ρΙΒ139載體，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物取5μ I用來轉(zhuǎn)化E. coli DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，加Iml的無抗LB，放入37°C的搖床預(yù)培養(yǎng)lh。取預(yù)培養(yǎng)后的菌液放入新的ep管中，加入300ul無抗LB，涂布于含有紅霉性抗性的LB平板上37°C培養(yǎng)，次日挑選抗性斑劃線。其具體流程如圖3所示。(5)基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌工程菌BC39的構(gòu)建制備皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I感受態(tài)細(xì)胞；用BamH I將基因重組整合載體PJDlOO線性化，切膠回收，隨后將IOOng DNA加入200 μ I皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I感受態(tài)細(xì)胞中，孵育20min ;加入LB和抗生素，培養(yǎng)90min，然后涂布紅霉素抗性平板，37°C倒置培養(yǎng)12-16h ;挑選抗性菌落，劃線到另一個平板；從紅霉素平板上挑取轉(zhuǎn)化子，然后在另一個平板上劃線培養(yǎng)，同時挑取一部分菌株做Southern雜交,以研究vgb表達(dá)框是否真正整合到皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I的染色體上，采用整合質(zhì)粒PSET152上的OC31attp位點(diǎn)約2. 3kb的片段作為探針，與接合子總DNA經(jīng)BamH I酶切的片段雜交分析鑒定接合子是否完成接合轉(zhuǎn)移。檢測結(jié)果見圖4。實(shí)施例二、基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌生產(chǎn)多肽類抗生素發(fā)酵工藝:本發(fā)明基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌生產(chǎn)多肽類抗生素發(fā)酵工藝(如圖6所示)，主要工藝流程包括菌種活化、一級種子罐發(fā)酵培養(yǎng)、二級種子罐發(fā)酵培養(yǎng)和生產(chǎn)用發(fā)酵罐培養(yǎng)。(I)菌種活化
·
將保藏的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39劃線接種于LB固體種子培養(yǎng)基斜面上，接種前將裝有培養(yǎng)基的三角瓶在121°C條件下滅菌30min，接種后在30°C條件下培養(yǎng)30-48h，配成孢子液，以5%接種量用于種子罐接種。(2)種子罐發(fā)酵先將一級種子罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°C，將孢子液接入培養(yǎng)液中，通入無菌氧氣培養(yǎng)，可得一級種子罐發(fā)酵菌液；將二級種子種子罐在121°C下滅菌30min，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°C，將一級種子罐發(fā)酵液按5%接種量接二級種子罐，通入無菌氧氣和攪拌進(jìn)行培養(yǎng)，可得二級種子罐發(fā)酵菌液；(3)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)先將發(fā)酵罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，保壓降溫到30°C，按8 %的接種量將二級種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng),通入無菌空氣。所述滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在121°C,壓力O. 3-0. 5kg/cm2條件下滅菌30min。一級種子罐培養(yǎng)條件，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : 0.5，機(jī)械攪拌270印111，301恒溫培養(yǎng)24h;二級種子罐培養(yǎng)條件，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : O. 5，機(jī)械攪拌220rpm，30°C恒溫培養(yǎng)24h ;發(fā)酵罐接種后，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : O. 5，機(jī)械攪拌140rpm，30°C恒溫培養(yǎng)65-70h。種子罐培養(yǎng)液配方以g/L計(jì)，黃豆餅30，工業(yè)葡萄糖20，NaCl 5，MgS04 ·7Η200· 1，K2HPO4O. 1，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 O. I。發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方以g/L計(jì)，黃豆餅30，地瓜粉5，飴糖25，NaCl 5，MgSO4 · 7H20O. I, K2HPO4O. I, FeSO4 · 7H20 O. I。以下通過透明顫菌血紅蛋白功能驗(yàn)證來具體說明本發(fā)明基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌即重組菌BC39所具有的有益效果I. PCR檢測透明顫菌血紅蛋白基因的整合表達(dá)將重組菌BC39和原始菌株分別接種于IOmL LB液體培養(yǎng)基中，200r/min，37°C搖床上過夜培養(yǎng)。然后以I %接種量轉(zhuǎn)接入IOOmL LB發(fā)酵液中，利用低轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)約IOOrpm降低發(fā)酵液內(nèi)的溶氧,實(shí)現(xiàn)透明顫菌血紅蛋白VHb的低氧誘導(dǎo)表達(dá)。低氧誘導(dǎo)24h后將發(fā)酵液10000r/min離心IOmin,棄上清，菌體懸浮于8mlO.lmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中，用超聲破壁，超聲幅度80%，每次破壁15s，間隔3min。收集破壁產(chǎn)物于離心管中，15000r/min離心IOmin,取上清。最后于上清中加入過量Na2S2O4，震蕩IOmin使VHb處于還原態(tài)。將等體積的工程菌和原始菌的上清液通CO 3min。通完CO后于暗室靜置lh，然后在分光光度計(jì)上掃描400 450nm的差光譜。通過CO結(jié)合差光譜檢測該工程菌是否能表達(dá)具有生物活性的VHb (圖5)，工程菌細(xì)胞破碎上清液在419nm處有一個特征吸收峰，而原始菌細(xì)胞破碎上清液的CO光譜中沒有該吸收峰，證明該菌成功表達(dá)具有生物活性的VHb。2.基因重組菌株對氧的利用特性用LiFlus⑶實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模發(fā)酵罐(北京中儀遠(yuǎn)大自動化技術(shù)有限公司)對工程菌和原始菌進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中通過控制攪拌速度和通氣量控制溶氧濃度，在發(fā)酵過程中每4h記錄工程菌和原始菌的攝氧率。在溶解氧濃度高于30%的條件下測定菌株的攝 氧率(圖8)，工程菌株的攝氧率略低于原始菌株，原始菌株的最大攝氧為3. 8mmol/(m3 -s)，工程菌株的最大攝氧率為3. 6mmol/(m3 · s)，且原始菌株比工程菌株提前4h達(dá)到最大攝氧率。在溶解氧濃度低于10%的條件下測定菌株的攝氧率(圖9)，工程菌株的攝氧率高于原始菌株，原始菌株最大攝氧率低于高溶氧條件最大攝氧率約15. 7%，而低溶氧條件下的工程菌株比高溶氧條件下的工程菌株和高溶氧條件下相比攝氧率提高了約27. 8%。3.工程菌生長情況檢測將重組菌BC39和原始菌株分別接種于IOmL LB液體培養(yǎng)基中，200r/min，37°C搖床上過夜培養(yǎng)。然后以I %接種量轉(zhuǎn)接入IOOmL LB發(fā)酵液中，在發(fā)酵過程中通過控制攪拌速度和通氣量將溶氧濃度控制在10%以下，每隔IOh取5ml發(fā)酵液置于離心管中，IOOOOrpm離心20min，棄上清。將工程菌和原始菌的細(xì)胞沉淀重新懸浮于等體積的雙蒸水中，搖勻。取ImL菌懸液，通過血球計(jì)數(shù)板和稀釋涂平板法來測定發(fā)酵后的菌體數(shù)。整個發(fā)酵過程中工程菌的菌體濃度明顯高于原始菌株(圖7)。4.多肽類抗生素產(chǎn)量測定重組菌BC39(工程菌株)和原始菌株分別接種于IOmL LB液體培養(yǎng)基中，200r/min，37°C搖床上過夜培養(yǎng)。然后以I %接種量轉(zhuǎn)接入IOOmL LB發(fā)酵液中，在溶解氧濃度高于30%和溶解氧濃度低于10%的條件下發(fā)酵。在發(fā)酵結(jié)束后，通過DlOl大孔樹脂(40mmX Im)提取，用蒸餾水和50%甲醇洗柱，100%甲醇洗脫，洗脫速度為500ml/min。甲醇提取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40°C蒸干，得到多肽類抗生素粗品。本研究規(guī)定，多肽類抗生素Img能抑制到250mL PDA培養(yǎng)基中的水稻稻瘟病菌，因此，Img多肽類抗生素粗品中含有250單位，即I單位中含有4yg多肽類抗生素。通過平板抑菌試驗(yàn)來測定多肽類抗生素產(chǎn)量，如表I所示；表I皮爾瑞俄類芽孢桿菌和工程菌在高溶氧和低溶氧條件下多肽類抗生素的濃度
SS
多肽類抗生素(u/ml)- , ~;---;--
JB P 囷株 original strain工fe 囷株 engineered strain
High DO2500021340
Low DO2278933044
表I中，在高溶氧發(fā)酵條件下，工程菌株重組菌BC39相比原始菌株發(fā)酵液的相對濃度有所降低，但在低溶氧條件下工程菌多肽類抗生素產(chǎn)量相比原始菌株提高了 45%，比聞溶氧條件下的原始菌株提聞了 32%。
·
以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對以上實(shí)施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌，其特征在于所述基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌為皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I的染色體上整合有-P43-Vgb-片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌，其特征在于所述-P43-Vgb-片段中的P43為啟動子。
3.一種基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌,其分類命 名為Paenibacillus peoriae BC39,保藏編號為CGMCC NO. 5900。
4.基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于將來自于透明顫菌血紅蛋白基因vgb，構(gòu)建重組整合載體pIB139-P43-vgb ;通過基因重組整合載體pIB139-P43-vgb中含有attP整合位點(diǎn)，將-P43-Vgb-片段整合到皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I的染色體上，獲得了基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下具體步驟 (1)PCR擴(kuò)增P43啟動子 以枯草芽孢桿菌基因組為模板，以p43-f/p43-r為引物，擴(kuò)增P43啟動子，其中，P43-F CCCAAGCTTGATAGGTGGTATGTTTCGCTTG ；P43-R GGTTTGCTGGTCTAACATGTGTACATTCCTCTTT ； (2)PCR擴(kuò)增透明顫菌血紅蛋白基因vgb 以質(zhì)粒pRK404-VHb以模板，Vgb-F/Vgb-R為引物，擴(kuò)增透明顫菌血紅蛋白基因vgb ;其中vgb-F TGGTTTGCTGGTCTAACATGCGGCTGGATCCTACCA ；vgb-R CGGAATTAGGTACCAGCCCGACCCGAGCAC ； (3)重疊延伸拼接P43啟動子和vgb 用PCR回收試劑盒回收再次PCR的產(chǎn)物，并以步驟(I)和(2)的回收產(chǎn)物為模板，以P43-F/Vgb-R為引物，采用重疊延伸拼接的方法擴(kuò)增融合基因，； (4)基因重組整合載體pIB139-P43-vgb的構(gòu)建 用PCR回收試劑盒回收步驟(3)的重疊PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pSET152衍生質(zhì)粒PIB139上，連接體系為4 μ IPCR產(chǎn)物，5 μ ISolution Ι，1μ1 ρΙΒ139載體，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物取5μ I用來轉(zhuǎn)化E. coli DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，加Iml的無抗LB，放入37°C的搖床預(yù)培養(yǎng)lh。取預(yù)培養(yǎng)后的菌液放入新的ep管中，加入300ul無抗LB，涂布于含有紅霉性抗性的LB平板上37°C培養(yǎng)，次日挑選抗性斑劃線。
(5)基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌工程菌BC39的構(gòu)建 制備皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I感受態(tài)細(xì)胞；用BamH I將基因重組整合載體pIB139-P43-vgb線性化，切膠回收，隨后將IOOng DNA加入200 μ I感受態(tài)中，孵育20min ;力口入LB和紅霉素，培養(yǎng)90min，然后涂布紅霉素抗性平板，37°C倒置培養(yǎng)12_16h ;挑選抗性菌落，劃線到另一個平板；從紅霉素平板上挑取轉(zhuǎn)化子，然后在另一個平板上劃線培養(yǎng)，同時挑取一部分菌株做Southern雜交，以研究vgb表達(dá)框是否真正整合到皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-I的染色體上，采用整合質(zhì)粒pSET152上的OC31attp位點(diǎn)約2. 3kb的片段作為探針，與接合子總DNA經(jīng)BamH I酶切的片段雜交分析鑒定接合子是否完成接合轉(zhuǎn)移。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(I)的PCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ;94 °C變性45sec，58 °C退火30sec，72°C延伸30sec ;30個循環(huán);72°C延伸IOmin ;步驟(2)中的PCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ;94°C變性45sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec ；30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；;步驟⑶中的PCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ;94°C變性45sec，58°C退火 lmin，72°C延伸 Imin ；30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
7.用權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)多肽類抗生素中的應(yīng)用，包括下述步驟 (1)、菌種活化 將保藏的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39劃線接種于固體種子培養(yǎng)基斜面上，接種前將裝有培養(yǎng)基的三角瓶在121°C條件下滅菌30min，接種后在30°C條件下培養(yǎng)30 48h，配成孢子液，以5%接種量用于種子罐接種。
(2)、種子罐發(fā)酵 先將一級種子罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°C，將孢子液接入培養(yǎng)液中，通入無菌氧氣培養(yǎng)，可得一級種子罐發(fā)酵菌液；將二級種子種子罐在121°C下滅菌30min，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°C，將一級種子罐發(fā)酵液按5%接種量接二級種子罐，通入無菌氧氣和攪拌進(jìn)行培養(yǎng)，可得二級種子罐發(fā)酵菌液； (3)、生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng) 先將發(fā)酵罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，保壓降溫到30°C，按8%的接種量將二級種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通入無菌空氣。
所述滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在121°C,壓力O. 3-0. 5kg/cm2條件下滅菌30min。一級種子罐培養(yǎng)條件，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : 0.5，機(jī)械攪拌270印111，301恒溫培養(yǎng)24h;二級種子罐培養(yǎng)條件，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : 0.5，機(jī)械攪拌220印111，30°C恒溫培養(yǎng)24h;發(fā)酵罐接種后，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持I : 0.5，機(jī)械攪拌140rpm, 30°C恒溫培養(yǎng) 65_70h。
種子罐培養(yǎng)液配方以g/L計(jì)，黃豆餅30，工業(yè)葡萄糖20，NaCl 5，MgSO4 · 7Η200· 1，K2HPO4 O. 1，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 O. I。
發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方:以g/L計(jì)，黃豆餅30，地瓜粉5，飴糖25，NaCl 5，MgS04 ·7Η20 O. 1，K2HPO4 O. 1，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 O. I。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種皮爾瑞俄類芽孢桿菌的基因工程菌、該工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明以皮爾瑞俄類芽孢桿菌LXH-B-1菌株為宿主菌，經(jīng)過構(gòu)建基因重組整合載體，構(gòu)建帶有P43強(qiáng)啟動子調(diào)控下的透明顫菌血紅蛋白基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39。本發(fā)明的基因工程菌可在胞內(nèi)表達(dá)透明顫菌血紅蛋白，提高皮爾瑞俄類芽孢桿菌對氧的利用率、細(xì)胞生物量及催化產(chǎn)物多肽類抗生素的產(chǎn)量，工程菌株的多肽類抗生素產(chǎn)量比原始菌株提高45％，為解決皮爾瑞俄類芽孢桿菌在細(xì)胞培養(yǎng)和催化過程中的供氧不足問題提供一條有效的途徑。
文檔編號C12N1/21GK102776147SQ20121011099
公開日2012年11月14日 申請日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者安德榮, 楊軒, 楊長鎖, 段軍娜 申請人:楊凌綠都生物科技有限公司