專利名稱：經(jīng)修飾的病毒株及用于改善流感病毒的疫苗種子的產(chǎn)生的方法
經(jīng)修飾的病毒株及用于改善流感病毒的疫苗種子的產(chǎn)生的方法本發(fā)明涉及包含經(jīng)修飾的PBl基因的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒，而且涉及實現(xiàn)具有經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒的遺傳背景的重配株(reassortant)病毒以供生成流感病毒的疫苗種子(vaccine seed)的方法。由流感病毒引起的流感是一種遍及全世界觀察到的常見病毒性呼吸系統(tǒng)感染，其在每個冬季藉由溫帶地區(qū)的流行性爆發(fā)而發(fā)展形成。目前，它仍然是肺炎后傳染病死亡率的第二大原因。造成人類病理學(xué)的流感病毒是甲型和乙型流感病毒。鑒于乙型流感病毒以譜系形式傳播，甲型流感病毒依照兩種主要的表面糖蛋白，即血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原特性而分成病毒亞型。流感病毒在其表面上具有300-700個糖蛋白，理論的NA/HA比率是I至10。在人類中傳播并引起季節(jié)性流行病的病毒是甲型(HlNl)和甲型(H3N2)病毒。因為流感病毒的主要貯存宿主(reservoir)是動物貯存宿主(禽和豬)，所以動物病毒可以跨越物種屏障并感染人。病毒如高致病性甲型禽流感(H5N1)病毒和流行性甲型(HlNl)病毒可以產(chǎn)生嚴(yán)重的公共健康問題。目前，疫苗接種是用于保護(hù)群體免于流感病毒的唯一有效手段。所謂的季節(jié)性疫苗提供針對傳播的季節(jié)性甲型(HlNl)和甲型(H3N2)病毒及乙型病毒的免疫性。每年，它由WHO基于前一年的原型株限定。宿主的免疫應(yīng)答主要是體液的，伴有針對HA和NA蛋白的中和性抗體的合成。由于這兩種蛋白質(zhì)的顯著抗原性漂移，尤其對于甲型病毒，必須每年重新評估疫苗的組成。用于生成疫苗的標(biāo)準(zhǔn)方法首先依靠通過與甲型/PR8/34(H1N1)株的遺傳重配在卵(egg)中對由WHO確定的三種原型株之每種獲得疫苗種子。大多數(shù)疫苗生產(chǎn)商通常使用主要源自親本甲型/PR/8/34病毒的這些重配株病毒。因此，每種疫苗種子源自原型株和甲型/PR8/34(HlNl)病毒之間遺傳重配的過程，所述甲型/PR8/34(HlNl)病毒在卵中具有最佳的復(fù)制能力。

病毒顆粒含有由單鏈RNA構(gòu)成的8個獨特的基因，每個基因編碼I至3個特定的病毒蛋白:HA、NA、Ml、M2、NP、NS1、NS2、PB1、PB1F2、PB1N40、PB2 和 PA。因此，一種長期選擇方法使得有可能獲得疫苗重配株，其在PR8病毒的遺傳背景上至少包含編碼原型株的HA和NA的基因的區(qū)段(“6+2”組成)。然后，在卵中擴(kuò)增三種疫苗重配株，其源自三種原型株與親本甲型/PR/8/34株之間的遺傳重配。自尿囊系統(tǒng)的產(chǎn)物純化HA和NA抗原，與佐劑結(jié)合或不結(jié)合，以生成疫苗劑量。這種用于生產(chǎn)疫苗劑量的工業(yè)方法是長期的(4至6個月)。最近幾年中已經(jīng)開發(fā)出用于獲得疫苗劑量的備選策略。實際上，使用細(xì)胞系來擴(kuò)增疫苗重配株使得其中有可能不再依賴于“卵”系統(tǒng)(不足以管理流行病的卵數(shù)量)，以降低使用尿囊生產(chǎn)方法經(jīng)常觀察到的表面抗原變化，并且使得有可能為非變應(yīng)原的。然而，目前，很少有制造商選擇此新的生產(chǎn)方法，因為該工業(yè)方法目前的性能不如卵的性能那樣好。為了使疫苗劑量生產(chǎn)時間降低至最小值，且以就劑量數(shù)目而言具有等同產(chǎn)量(yield)為目的，可以通過使用反求遺傳學(xué)技術(shù)，使得有可能快速獲得具有“6+2”組成的疫苗重配株，如此消除所有選擇步驟來獲得疫苗種子。通過反求遺傳學(xué)生成重組病毒呈現(xiàn)用于有效地響應(yīng)疫苗需求的最實際的備選方案。因此，通過反求遺傳學(xué)生成重組病毒隨后打開生成“經(jīng)優(yōu)化的”PR8病毒的可能性，這使得在它通過與原型株的遺傳重配方法使用時有可能在卵中或在細(xì)胞中生成具有在疫苗劑量生產(chǎn)方面優(yōu)化的病毒特征的疫苗重配株。在出現(xiàn)流行性致病性病毒的本上下文中，流感感染僅在工業(yè)化國家中可導(dǎo)致130至200萬例住院和280，000至650，000例死亡(WHO數(shù)據(jù))。疫苗劑量以固定的HA抗原數(shù)量(每劑每種病毒亞型為15 μ g)限定。NA抗原的陽性檢測對于驗證疫苗批次是必需的。主要的經(jīng)濟(jì)問題之一是能夠降低疫苗劑量的制造成本(每次生產(chǎn)更多劑量和/或生產(chǎn)相同劑量數(shù)量的時間縮短)。Wanitchang等描述了在用S-OIV病毒的PBl基因替換重配株(“5+3”)甲型/PR/8/34病毒的PBl基因時表達(dá)HlNl (S-OIV)病毒的HA/NA糖蛋白的重配株病毒的生長改善和NA活性升高。然而，生長改善和NA活性升高對于S-0IVHA/NA糖蛋白是特異性的。此夕卜，在包含S-OIV PBl基因的重配株(“7+1”)甲型/PR/8/34病毒中沒有檢出生長改善和NA活性升高。此文件沒有描述用于增加甲型/PR/8/34病毒表面上HA-NA糖蛋白數(shù)量的方法，它也沒有描述經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒，該經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒在病毒表面上的HA-NA糖蛋白數(shù)量增加。本發(fā)明涉及生成更多表面糖蛋白的病毒株(疫苗重配株)及用于改善HA/NA表面糖蛋白的產(chǎn)生的方法。具體而言，本發(fā)明包括修飾通常用于生成流感病毒的疫苗種子的PR8病毒。此修飾存在于對PBl蛋白的某些氨基酸的修飾以獲得具有更大的表面糖蛋白(HA和NA)數(shù)量和有利于NA的不同HA/NA比率的疫苗重配株。這些構(gòu)成抗流感疫苗劑量的抗原。本發(fā)明使得有可能定量和定性優(yōu)化甲和乙型流感病毒的疫苗種子。本發(fā)明的優(yōu)點之一是通過相對于生成的給定數(shù)量的HA過表達(dá)NA來提高疫苗劑量的免疫原性。另一項優(yōu)點是可得到一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)使得有可能通過提高表面糖蛋白的表達(dá)來增加卵中或細(xì)胞中生成的疫苗劑量的數(shù)目。發(fā)明概沭作為一個目的，本發(fā)明具有經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒，其在表面上的HA-NA (血凝素和神經(jīng)氨酸酶)糖蛋白數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒體而言大于550個糖蛋白，所述經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒包含SEQ ID NO:1的突變PBl基因，該突變PBl基因編碼具有至少兩個選自如下的特定氨基酸修飾的PBl蛋白:188(K —E)、205(M — I)、212 (L — V)、216 (S — G)、398 (E — D)、486 (R — K)、563 (I — R)、576 (I — L)、581 (E — D)、584 (R — Q)、586 (K — R)、617 (D — N)、621 (Q — R)、682 (V — I)和 691 (R — K)。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的病毒包含SEQ ID NO:1的突變PBl基因，該突變PBl基因編碼至少具有修飾563(1 — R)和682 (V — I)的PBl蛋白。在另一個實施方案中，依照本發(fā)明的甲型/PR/8/34病毒包含另一甲型流感病毒株的PBl基因，所述另一甲型流感病毒株的HA-NA表面糖蛋白的數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒體而言大于550個糖蛋白。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒包含具有SEQ IDNO: 2序列的H3N2流感病毒的PBl基因。

有利地，依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒是包含另一流感病毒的HA和NA基因的重配株病毒。在另一個有利的實施方案中，依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒包含選自如下的流感病毒的HA和NA基因:具有H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2和H3N1亞型的病毒。本發(fā)明的另一個目的是一種用于生成流感病毒的HA-NA疫苗糖蛋白的方法，其中在卵中或在細(xì)胞中擴(kuò)增依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的流感病毒，該經(jīng)修飾的流感病毒包含編碼所述HA-NA疫苗糖蛋白的HA和NA基因。有利地，所述 HA-NA 疫苗糖蛋白選自具有 H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2和H3N1亞型的病毒的糖蛋白。本發(fā)明還涉及用于增加甲型/PR/8/34流感病毒表面上HA-NA糖蛋白數(shù)量的方法，包括對所述甲型/PR/8/34流感病毒的SEQ ID NO:1的PBl基因的修飾以將選自如下的至少兩個特定的氨基酸修飾引入由所述PBl基因編碼的PBl蛋白中:188(K —E)、205(M— I)、212 (L — V)、216 (S — G)、398 (E — D)、486 (R — K)、563 (I — R)、576 (I — L)、581 (E — D)、584 (R — Q)、586 (K — R)、617 (D — N)、621 (Q — R)、682 (V — I)和 691 (R — K)。優(yōu)選地，所述方法包括對所述甲型/PR/8/34流感病毒的SEQ ID NO:1的PBl基因的修飾以將至少兩個特定的氨基酸修飾563(1 — R)和682 (V — I)引入由所述PBl基因編碼的PBl蛋白中。 在另一個實施方案中，依照本發(fā)明的方法包括用另一甲型流感病毒株的PBl基因替換SEQ ID NO:1的PBl基因，所述另一甲型流感病毒株的HA-NA表面糖蛋白數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒體而言大于550個糖蛋白。優(yōu)選地，所述方法包括用具有SEQ ID NO: 2序列的H3N2流感病毒的PBl基因替換SEQ ID NO:1 的 PBl 基因。有利地，所述甲型/PR/8/34病毒是包含另一流感病毒的HA和NA基因的重配株病毒。在另一個有利的實施方案中，所述甲型/PR/8/34病毒是包含選自如下的流感病毒的HA和NA基因的重配株病毒:具有H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2和H3N1亞型的病毒。作為一個目的，本發(fā)明還具有一種通過提高生成的糖蛋白的NA/HA比率來提高包含流感病毒的HA-NA糖蛋白的疫苗劑量的免疫原性的方法，其中在卵中或在細(xì)胞中擴(kuò)增依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的流感病毒來生成糖蛋白。序列表SEQ ID NO:1:甲型/PR8/8/34A(HlNl)流感病毒的PBl的蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO:2:Moscow/10/99A(H3N2)流感病毒的 PBl 的蛋白質(zhì)序列發(fā)明詳沭本發(fā)明根據(jù)出乎意料的觀察結(jié)果，即不同流感病毒株在其表面上不具有相同數(shù)量的HA和NA糖蛋白。具體地，證明了制造商用于通過在經(jīng)受精的雞蛋中注射來擴(kuò)增病毒的具有甲型/PR/8/34親本株的遺傳背景的流感病毒在其表面上比其它流感病毒株表達(dá)更小數(shù)量的HA和NA糖蛋白。此觀察結(jié)果具有很大的意義，因為經(jīng)典地使用具有甲型/PR/8/34遺傳背景并表達(dá)HA和NA疫苗糖蛋白的重配株病毒來生成抗流感疫苗。疫苗劑量以每劑每種病毒亞型15 μ g的固定數(shù)量的HA抗原限定。增加由具有甲型/PR/8/34遺傳背景的流感病毒生成的糖蛋白的數(shù)量就改善疫苗劑量生產(chǎn)產(chǎn)量和降低這些疫苗劑量的制造成本而言是主要問題?？紤]到這些結(jié)果，現(xiàn)已出乎意料地發(fā)現(xiàn)了可以通過對具有甲型/PR/8/34遺傳背景的病毒的PBl基因的遺傳修飾來增加由此病毒生成的HA-NA糖蛋白的數(shù)量。如此，本發(fā)明涉及具有甲型/PR/8/34遺傳背景并生成更大數(shù)量的原型株HA-NA糖蛋白的經(jīng)修飾的病毒、用于增加HA-NA疫苗糖蛋白的生產(chǎn)產(chǎn)量的方法、及用于增加由甲型/PR/8/34病毒生成的糖蛋白數(shù)量的方法。本發(fā)明還涉及具有甲型/PR/8/34遺傳背景且具有有利于NA的不同HA/NA比率的經(jīng)修飾的病毒。具體地，本發(fā)明涉及包含經(jīng)修飾的PBl基因的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒及經(jīng)修飾的重配株甲型/PR/8/34病毒，該經(jīng)修飾的重配株甲型/PR/8/34病毒包含經(jīng)修飾的PBl基因和另一種病毒且具體地用于生產(chǎn)HA/NA疫苗抗原的原型病毒的HA和NA基因。本發(fā)明還涉及用于生成HA-NA糖蛋白的方法，包括在卵中擴(kuò)增依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的病毒或重配株病毒。最后，作為一個目的，本發(fā)明還具有用于顯著增加甲型/PR/8/34病毒或具有甲型/PR/8/34遺傳背景的重配株病毒表面上HA-NA糖蛋白數(shù)量的方法。這些方法使得有可能改善HA-NA糖蛋白生產(chǎn)的產(chǎn)量。表述“甲型/PR/8/34流感病毒”指與甲型/PR/8/34株相關(guān)的病毒。1934年在波多黎各從患者采集，甲型/PR/8/34株產(chǎn)生自對在卵中生成流感病毒的適應(yīng)。甲型/PR/8/34株的多種克隆已經(jīng)得到開發(fā)，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。甲型/PR/8/34株以及自此株衍生的各種克隆已為ATCC保藏物的對象。具體地，它們是ATCC保藏物VR-95和VR-1469。使用此甲型/PR/8/34株作為親本株以制備對于在卵中增殖以供疫苗產(chǎn)生具有高潛力的重配株病毒。制造商使用甲型/PR/8/34株的多種克隆，但是這些克隆在遺傳上仍然非常相似，并且以在卵中生長以供疫苗產(chǎn)生的高能力為特征。甲型/PR/8/34病毒的8個基因段的序列以如下編號可自 GenBank 獲得(HA:FJ888348.1、NA:CY038905.1、PB2:CY040177.1、PA:CY038908.1、NS:CY040174.UPBl:CY040176.1、NP:CY040173.1和 M:CY040171.1)。表述“經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒”指與其PB I基因經(jīng)過修飾的甲型/PR/8/34株相關(guān)的病毒。甲型流感病毒包含8個基因，最特別是PBl、HA和NA基因。表述“具有經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒的遺傳背景的重配株病毒”指具有經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒的6個基因(包括經(jīng)修飾的PBl基因)和編碼另一流感病毒株的HA和NA糖蛋白的基因的重配株病毒。編碼HA和NA糖蛋白的基因通常來自野生型流感病毒(或原型病毒)，其已經(jīng)基于徹底的抗原性和遺傳研究(由WHO聯(lián)合實驗室進(jìn)行)選擇為代表大的流感病毒組。自臨床樣品直接培養(yǎng)這些野生型流感病毒(原型病毒)。因此，每年，WHO推薦從某些野生型流感病毒制備抗流感疫苗。具有經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒的遺傳背景的相應(yīng)重配株病毒在卵中生長非常良好(甲型/PR/8/34株的特征)，并且表達(dá)HA和NA糖蛋白以供疫苗的產(chǎn)生。術(shù)語“重配株病毒”和“遺傳重配 ”指以不同組合找到兩種或幾種流感病毒的基因，以生成具有每種親本病毒基因的雜合病毒的方法。此遺傳重配可以天然存在或可以在實驗室中獲得。
依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒包含經(jīng)修飾的PBl (聚合酶堿性蛋白I)基因。甲型流感病毒的PBl基因是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，甲型/PR/8/34PB1基因的序列以編號 CY040176.UCY038909.UCY038901.UEF190980.1 和 EF190972.1 可自GenBank 獲得。甲型/PR/8/34流感病毒的多種克隆的PBl基因可具有少量序列趨異，即使PBl基因的遺傳漂變(genetic drift)較小。在一個具體的實施方案中，甲型/PR/8/34流感病毒的PBl基因編碼SEQ ID N0:1的PBl蛋白。在另一個具體的實施方案中，甲型/PR/8/34流感病毒的PBl蛋白編碼SEQ ID NO:1的PBl蛋白或此蛋白質(zhì)的與SEQ ID NO:1具有至少98%、99%或99.5%同一性的變體。表述“經(jīng)修飾的PBl基因”指包含導(dǎo)致由此區(qū)段編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列差異的對其序列的修飾的PBl基因。PBl基因編碼三種蛋白質(zhì)(PB1、PB1F2和PB1N40)，并且PBl蛋白是公知的，而且在病毒的復(fù)制/轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮中心作用(無此蛋白質(zhì)，則不發(fā)生復(fù)制)。其它蛋白質(zhì)稱作輔助的，并且了解不多。PB1F2蛋白似乎在體內(nèi)發(fā)揮作用，而僅一項研究描述了 PB1N40蛋白在轉(zhuǎn)錄中推定的作用。此外，傳播病毒的所有PBl基因段不編碼PB1F2蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解PBl基因的修飾因而可導(dǎo)致PB1、PB1F2和/或PB1N40蛋白的修飾。通過誘變甲型/PR/8/34PB1基因，且特別地通過將突變引入PBl基因序列中或者通過用另一流感病毒株的PBl基因替換甲型/PR/8/34PB1基因來獲得包含經(jīng)修飾的PBl基因的甲型/PR/8/34病毒。術(shù)語“HA-NA糖蛋白”指血凝素(HA)糖蛋白和神經(jīng)氨酸酶(NA)糖蛋白。這些是甲型流感病毒表面上的特異性抗原性蛋白，其能夠誘導(dǎo)中和性抗體的生成。甲型流感病毒依照其血凝素和神經(jīng)氨酸酶的組合以16種HA亞型和9種NA亞型細(xì)分。依靠對其PBl基因的修飾，相對于不包含經(jīng)修飾的PBl基因的甲型/PR/8/34病毒表面上通常存在的HA-NA糖蛋白數(shù)量，經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒和重配株流感疫苗病毒在其表面上具有增加數(shù)量的HA-NA糖蛋白，所述重配株流感疫苗病毒包含本發(fā)明的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒的遺傳背景。優(yōu)選地，包含經(jīng)修飾的PBl基因的甲型/PR/8/34病毒的表面上的HA-NA糖蛋白數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒體而言大于550,600,且更優(yōu)選650個糖蛋白。通過測量糖蛋白刺突間的距離測定表面糖蛋白(HA+NA)的數(shù)量，然后，將其與直徑100nm的病毒的表面積聯(lián)系起來。通過冷凍電子顯微術(shù)測量四個糖蛋白刺突間的距離。在優(yōu)選的實施方案中，甲型/PR/8/34株的PBl基因具有導(dǎo)致PBl蛋白中特定氨基酸修飾的修飾。優(yōu)選地，PBl基因的修飾伴隨甲型/PR/3/84毒素PBl蛋白的1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸的特定修飾。更優(yōu)選地，PBl基因的修飾伴隨甲型/PR/3/84株P(guān)Bl蛋白的至少兩個氨基酸的特定修飾。優(yōu)選地，經(jīng)修飾的PBl基因編碼包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或 15 個選自如下的修飾的 PBl 蛋白:188(K —E)、205(M— I)、212 (L — V)、216 (S — G)、398 (E — D)、486(R — K)、563(1 — R) ,576(1 — L)、581(E — D)、584(R — Q) ,586 (K — R)、617 (D — N)、621 (Q — R)、682 (V — I)和 691 (R — K)。在本發(fā)明的一個有利的實施方案中，經(jīng)修飾的PBl基因編碼至少具有修飾188 (K — E) ,205 (Μ — I) ,212(1 -* V)、216(S — G)、398(Ε — D)、486(R — K) ,563(1 — R)、576 (I — L)、581 (Ε — D)、584 (R — Q)、586 (K — R)、617 (D — N)、621 (Q — R)、682 (V — I)和691 (R — K)的 PBl 蛋白。更優(yōu)選地，經(jīng)修飾的PBl基因編碼具有至少兩個選自如下的修飾的PBl蛋白:188 (K — Ε)、205 (Μ — I)、212 (L — V)、216 (S — G)、398 (Ε — D)、486 (R — K)、563 (I — R)、576 (I — L)、581 (Ε — D)、584 (R — Q)、586 (K — R)、617 (D — N)、621 (Q — R)、682 (V — I)和691 (R — K)。有利地，經(jīng)修飾的PBl基因編碼至少具有修飾563 (I — R)和682 (V — I)的蛋白質(zhì)。在其它實施方案中，用另一流感病毒株的PBl基因替換甲型/PR/8/34病毒的PBl基因，所述另一流感病毒株的HA-NA表面糖蛋白數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒體而言大于550、600或650個糖蛋白。在一個有利的實施方案中，用編碼SEQ ID NO:2的PBl蛋白的基因替換甲型/PR/8/34病毒的PBl基因。本發(fā)明還涉及重配株流感病毒，其具有依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒的遺傳背景，而且包含另一流感病毒的HA和NA基因。如此，這些重配株病毒通常攜帶經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒的6個基因(包括經(jīng)修飾的PBl基因)和另一流感病毒株的2個基因，即編碼HA和NA糖蛋白的基因。本發(fā)明的重配株病毒在卵中如甲型/PR/8/34病毒株那樣生長非常良好，同時在其表面上生成更多的HA和NA糖蛋白。如此，在生成的重配株病毒數(shù)量相同的情況下，有可能生成更多的疫苗劑量。優(yōu)選地，編碼HA和NA糖蛋白的基因來自甲型病毒和有利地野生流感病毒(原型病毒)。有利地，編碼HA和NA糖 蛋白的基因來自傳播的人或動物流感病毒,而與病毒亞型無關(guān)。在優(yōu)選的實施方案中，編碼HA和NA糖蛋白的基因來自選自如下的流感病毒:具有Η3Ν2、Η2Ν2、Η1Ν2、Η5Ν2、Η5Ν1、Η7Ν7、Η9Ν2 和 Η3Ν1 亞型的病毒。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及重配株流感病毒，其包含甲型/PR/8/34病毒的5個基因和一個或多個其它流感病毒株的PBl、HA和NA基因。優(yōu)選地，用另一流感病毒株的PBl基因替換甲型/PR/8/34病毒的PBl基因，所述另一流感病毒株的HA-NA表面糖蛋白數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒體而言大于550、600或650個糖蛋白。有利地，用編碼SEQ IDNO:2的PBl蛋白的基因替換甲型/PR/8/34病毒的PBl基因。本發(fā)明還涉及實現(xiàn)經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒和具有經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒的遺傳背景的重配株病毒以供生成HA-NA糖蛋白的方法。依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒和用經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒獲得的重配株病毒特別適合于通過在經(jīng)受精的雞蛋中或在細(xì)胞中擴(kuò)增來生產(chǎn)疫苗種子。具有甲型/PR/8/34病毒的遺傳背景出個甲型/PR/8/34基因，包括經(jīng)修飾的PBl基因)和野生型病毒(或原型病毒)的HA和NA基因的重配株病毒特別適合于生產(chǎn)HA-NA疫苗糖蛋白。依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在經(jīng)受精的雞蛋中或在細(xì)胞中擴(kuò)增重配株病毒。在有利的實施方案中，本發(fā)明涉及用于生成流感病毒的HA-NA疫苗糖蛋白的方法，其中在卵中或在細(xì)胞中擴(kuò)增重配株病毒，其具有依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒的遺傳背景，并且包含編碼所述HA-NA疫苗糖蛋白的HA和NA基因。
優(yōu)選地，HA-NA疫苗糖蛋白選自甲型流感病毒的HA-NA糖蛋白，且更特別地選自傳播的人或動物流感(病毒)的HA-NA糖蛋白(而與病毒亞型無關(guān))。在優(yōu)選的實施方案中，HA 和 NA 疫苗糖蛋白選自 H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2 和 H3N1 亞型。本發(fā)明還涉及通過這些方法獲得的HA-NA糖蛋白。本發(fā)明還涉及用于在包含此病毒的PBl基因的修飾的甲型/PR/8/34流感病毒或重配株甲型/PR/8/34病毒的表面上增加HA-NA糖蛋白數(shù)量的方法。PBl基因的這些修飾在上文描述。相對于不包含經(jīng)修飾的PBl基因的甲型/PR/8/34病毒或重配株甲型/PR/8/34病毒的表面上存在的糖蛋白數(shù)量，測量HA-NA糖蛋白數(shù)量的增加。在有利的實施方案中，此增加使得有可能獲得如下的甲型/PR/8/34病毒或重配株甲型/PR/8/34病毒，其HA-NA表面糖蛋白的數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒粒而言大于550、600或650個糖蛋白。優(yōu)選地，此修飾包括所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PBl基因的修飾以將至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個特定氨基酸修飾引入由所述PBl基因編碼的PBl蛋白中。更優(yōu)選地，此修飾包括所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PBl基因的修飾以將至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個選自如下的特定氨基酸修飾引入由所述PBl基因編碼的PBl蛋白中:188(K —E)、205(M — I)、212 (L — V)、216 (S — G)、398 (E — D)、486 (R — K)、563 (I — R)、576 (I — L)、581 (E — D)、584 (R — Q)、586 (K — R)、617 (D — N)、621 (Q — R)、682 (V — I)和 691 (R — K)。有利地，此修飾 包括所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PBl基因的修飾以至少將特定氨基酸修飾188 (K — Ε)、205 (M — I)、212 (L — V)、216 (S — G)、398(E — D)、486(R — K) ,563(1 — R) ,576(1 — L)、581(E — D)、584(R— Q)、586(K —R)、617(D —N)、621(Q —R)、682(V— I)和 691(R —K)引入由所述 PBl 基因編碼的PBl蛋白中。有利地，此修飾包括所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PBl基因的修飾以將至少兩個選自下組的特定氨基酸修飾引入由所述PBl基因編碼的 PBl 蛋白中:188 (K — E)、205(M — I)、212(L — V)、216(S — G)、398(E — D)、486(R — K)、563(I — R) ,576(1 — L)、581(E — D)、584(R — Q)、586(K — R)、617(D — N)、621 (Q — R)、682 (V — I)和 691 (R — K)。更有利地，此修飾包括所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PBl基因的修飾以將至少兩個特定的氨基酸修飾563 (I — R)和682 (V — I)引入由所述PBl基因編碼的PBl蛋白中。在其它實施方案中，所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PBl基因的修飾包括用另一流感病毒的PBl基因替換甲型/PR/8/34流感病毒的PBl基因，所述另一流感病毒的HA-NA表面糖蛋白數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒體而言大于550、600或650個糖蛋白。優(yōu)選地，所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PBl基因的修飾包括用SEQ ID NO: 2的PBl基因替換甲型/PR/8/34流感病毒的PBl基因。
本發(fā)明還涉及通過在卵中或在細(xì)胞中擴(kuò)增具有甲型/PR/8/34遺傳背景的重配株疫苗病毒來改善流感病毒的HA-NA疫苗糖蛋白的生成產(chǎn)量的方法，其中通過修飾甲型/PR/8/34PB1基因來增加所述重配株病毒表面上的HA-NA糖蛋白的數(shù)量。本發(fā)明還涉及用于制備重配株疫苗病毒以供生成HA-NA疫苗糖蛋白的方法，其中將依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒的6個基因與編碼原型流感病毒(野生型病毒)的HA和NA疫苗糖蛋白的兩個基因組合。本發(fā)明的優(yōu)點之一是通過相對于生成的固定數(shù)量的HA過表達(dá)NA來提高疫苗劑量的免疫原性。如此，本發(fā)明還涉及通過提高生成的糖蛋白的NA/HA比率來提高包含流感病毒HA-NA糖蛋白的疫苗劑量的免疫原性的方法，其中通過在卵中或在細(xì)胞中擴(kuò)增具有依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34病毒的遺傳背景的重配株病毒來生成糖蛋白。
實施例實施例1:通過反求遺傳學(xué)生成重組病毒我們依照我們實驗室開發(fā)的方案通過反求遺傳學(xué)生成9個重組病毒。重組病毒的基因組組成如下(表1):病毒H3N2 甲型 /Moscow/10/99 (MO)病毒HlNl 甲型 /PR/8/:M (PR8)病毒A 典型的"PR8疫苗重配株，其在PR8病毒的遺傳背景上包含MO的HA和NA基因的區(qū)段病毒B:PR8疫苗重配株，其在PR8病毒的遺傳背景上包含MO的HA、NA和PBl基因的區(qū)段。病毒C:PR8，其包含MO的PBl基因的區(qū)段病毒D 典型的”PR8疫苗重配株，其包含禽流感H5N2A/Finch/England/2051/91 (病毒FI)的HA和NA基因的區(qū)段病毒E:PR8疫苗重配株，其在PR8病毒的遺傳背景上包含F(xiàn)I的HA和NA基因的區(qū)段和MO的PBl基因的區(qū)段病毒F 典型的” PR8疫苗重配株，其包含人H3N2病毒甲型/California/10/04 (病毒CAL)的HA和NA基因的區(qū)段病毒G:PR8疫苗重配株，其在PR8病毒的遺傳背景上包含CAL的HA和NA基因的區(qū)段和MO的PBl基因的區(qū)段重組病毒的體外生成依靠用8個各包含基因區(qū)段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在實驗室中用其自身分子和細(xì)胞工具實施病毒生成。對9個重組病毒獲得的生成產(chǎn)量在細(xì)胞中相似，并且符合重組病毒的正常生成。表1:通過反求遺傳學(xué)生成的重組病毒的基因組組成
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒，其在表面上的HA-NA(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)糖蛋白數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒體而言大于550個糖蛋白，所述經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒包含SEQ ID NO:1的突變PBl基因，該突變PBl基因編碼具有選自如下的至少兩個特定氨基酸修飾的PBl蛋白:188(K —E)、205(M— I)、212 (L — V)、216 (S — G)、398 (E — D)、486(R — K) ,563(1 — R) ,576(1 — L)、581(E — D)、584(R — Q)、586(K — R)、617 (D — N)、621 (Q — R)、682 (V — I)和 691 (R — K)。
2.依照權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒，其特征在于它包含SEQIDNO:1的突變PBl基因，該突變PBl基因編碼至少具有修飾563(1 — R)和682 (V — I)的PBl蛋白。
3.依照權(quán)利要求1-2中任一項的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒，其特征在于它包含另一甲型流感病毒株的PBl基因，所述另一甲型流感病毒株的HA-NA表面糖蛋白數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒體而言大于550個糖蛋白。
4.依照權(quán)利要求1-3中任一項的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒，其特征在于它包含具有SEQ ID NO:2序列的H3N2流感病毒的PBl基因。
5.依照權(quán)利要求1-4中任一項的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒，其特征在于它是包含另一流感病毒的HA和NA基因的重配株。
6.依照權(quán)利要求5的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒，其包含選自如下的流感病毒的HA 和 NA 基因:具有 H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2 和 H3N1 亞型的病毒。
7.一種用于生成流感病毒的HA-NA疫苗糖蛋白的方法，其特征在于在卵中或在細(xì)胞中擴(kuò)增依照權(quán)利要求5-6中任一項的經(jīng)修飾的流感病毒，該經(jīng)修飾的流感病毒包含編碼所述HA-NA疫苗糖蛋白的HA和NA基因。
8.依照權(quán)利要求7的用于生成流感病毒的HA-NA疫苗糖蛋白的方法，其中所述HA-NA疫苗糖蛋白選自具有H3N2、H2N`2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2和H3N1亞型的病毒的糖蛋白。
9.一種用于增加甲型/PR/8/34流感病毒表面上HA-NA糖蛋白數(shù)量的方法，其特征在于它包括對所述甲型/PR/8/34流感病毒的SEQ ID NO:1的PBl基因的修飾以將選自如下的至少兩個特定的氨基酸修飾引入由所述PB I基因編碼的PB I蛋白中:188 (K — E)、205 (M — I)、212 (L — V)、216 (S — G)、398 (E — D)、486 (R — K)、563 (I — R)、576 (I — L)、581 (E — D)、584 (R — Q)、586 (K — R)、617 (D — N)、621 (Q — R)、682 (V — I)和 691 (R — K)。
10.依照權(quán)利要求9的用于增加甲型/PR/8/34流感病毒表面上HA-NA糖蛋白數(shù)量的方法，其特征在于它包括對所述甲型/PR/8/34流感病毒的SEQ IDNO:1的PBl基因的修飾以將至少兩個特定的氨基酸修飾563(1 — R)和682 (V — I)引入由所述PBl基因編碼的PBl蛋白中。
11.依照權(quán)利要求9-10中任一項的用于增加甲型/PR/8/34流感病毒表面上HA-NA糖蛋白數(shù)量的方法，其特征在于它包括用另一甲型流感病毒株的PBl基因替換SEQ ID NO:1的PBl基因，所述另一甲型流感病毒株的HA-NA表面糖蛋白數(shù)量為對于直徑IOOnm的病毒體而言大于550個糖蛋白。
12.依照權(quán)利要求11的用于增加甲型/PR/8/34流感病毒表面上HA-NA糖蛋白數(shù)量的方法，其特征在于它包括用具有SEQ ID NO:2的序列的H3N2流感病毒的PBl基因替換SEQID NO:1 的 PBl 基因。
13.依照權(quán)利要求9-12中任一項的用于增加甲型/PR/8/34流感病毒表面上HA-NA糖蛋白數(shù)量的方法，其特征在于所述甲型/PR/8/34病毒是包含另一流感病毒的HA和NA基因的重配株病毒。
14.依照權(quán)利要求13的用于增加甲型/PR/8/34流感病毒表面上HA-NA糖蛋白數(shù)量的方法，其特征在于所述甲型/PR/8/34病毒是包含選自如下的流感病毒的HA和NA基因的重配株病毒:具有 H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2 和 H3N1 亞型的病毒。
15.一種通過提高生成的糖蛋白的NA/HA比率來增加包含流感病毒的HA-NA糖蛋白的疫苗劑量的免疫原性的方法，其中通過在卵中或在細(xì)胞中擴(kuò)增依照權(quán)利要求5-6中任一項的經(jīng)修飾的流感病毒來生成所述 糖蛋白。
全文摘要
包含經(jīng)修飾的PB1基因的經(jīng)修飾的甲型/PR/8/34流感病毒和重配株甲型/PR/8/34流感病毒及用于改善HA(血凝素)和NA(神經(jīng)氨酸酶)疫苗糖蛋白生成的方法。
文檔編號C12N9/12GK103118704SQ201180044044
公開日2013年5月22日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者V.莫爾斯, M.羅薩-卡拉特拉瓦, O.費拉里斯, M.伊芙 申請人:克勞德伯納德里昂第一大學(xué), 里昂公立收容所, 國家科學(xué)研究中心