專利名稱：里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i的嗜熱突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)涉及包含氨基酸突變的熱穩(wěn)定糖基水解酶家族7的酶，包括得自里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶。具體而言，本公開(kāi)涉及包含里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶的組合物、以及它們的使用方法。
背景技術(shù)：
在將生物質(zhì)的纖維質(zhì)內(nèi)容物轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖以用于生物燃料的生產(chǎn)中，纖維素酶目前受到了相當(dāng)大的關(guān)注。有多種酶(外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶)同樣地將纖維素水解為葡萄糖。由于絲狀真菌里氏木霉能夠顯著地分泌大量的水解纖維素的酶，所以其為工業(yè)上使用的纖維素酶生產(chǎn)者(> 50g/L)。該真菌至少生產(chǎn)出7種用于結(jié)晶纖維素完全降解的細(xì)胞外纖維素酶。這些酶包括:2種外切葡聚糖酶，稱為Cel7A和Cle6A(CBH I和CBH II)，它們分別占總纖維素酶含量的50%和20%;以及5種內(nèi)切葡聚糖酶 Ce 17B、Ce 15A、Ce 112A、Ce 161A 和 Ce 145A (EG 1、EG2、EG3、EG4 和 EG5)，它們分別占總纖維素酶含量的15%、10%、1%、< 1%和< 1%。在高溫下使用纖維素酶進(jìn)行木質(zhì)纖維素的水解具有許多潛在的優(yōu)點(diǎn)，例如由于比濃粘度而具有較高的固體加載量，微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)較低，在高溫預(yù)處理下具有較高的相容性，以及較快的水解速率。但是，里氏木霉纖維素酶和其他真菌的酶在高溫下具有相對(duì)低的活性和穩(wěn)定性(Takashima, S et al.，JBiotechnol65 (2-3):163-71,1998) 生產(chǎn)和分泌足量的纖維素酶的能力對(duì)于由纖維質(zhì)生物質(zhì)經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)生物燃料而言是最重要的，并且由非真菌來(lái)源表達(dá)和生產(chǎn)嗜熱纖維素酶到目前為止是非常有限的(< 100mg/L)。因此，本領(lǐng)域需要能夠在高溫下高效地水解木質(zhì)纖維素的熱穩(wěn)定真菌纖維素酶。發(fā)明概述本公開(kāi)提供了滿足上述需要的多肽、組合物和方法。本公開(kāi)涉及突變體熱穩(wěn)定的酶， 包括具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的糖基水解酶家族7的酶。這些酶可以用于水解木質(zhì)纖維素，具體而言，可以用于降解和水解多糖和寡糖，例如轉(zhuǎn)化為可溶性的糖，從而用于(包括)生物燃料的可發(fā)酵的生產(chǎn)，食品的加工，紡織品的拋光和清潔，拋光結(jié)晶纖維素的生產(chǎn)以及紙漿的漂白。這些酶是熱穩(wěn)定的，它們解決了對(duì)能夠在高溫下高效地水解木質(zhì)纖維素的水解纖維素酶的需求。本公開(kāi)還涉及編碼突變體熱穩(wěn)定酶的分離的核酸、以及包含這些核酸的載體和宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，該酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處包含絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或蛋氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含亮氨酸或絲氨酸。在其他實(shí)施方案中，所述的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含蘇氨酸或甘氨酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了突變體熱穩(wěn)定的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，該酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處包含賴氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含亮氨酸或絲氨酸。在其他實(shí)施方案中，所述的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含蘇氨酸或甘氨酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了突變體熱穩(wěn)定的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I，該酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處包含丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含亮氨酸或絲氨酸。在其他實(shí)施方案中，所述的·酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含蘇氨酸或甘氨酸。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，該酶在與SEQID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處包含亮氨酸。在某些實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含蘇氨酸或甘氨酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了突變體熱穩(wěn)定的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，該酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處包含絲氨酸。在某些實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含蘇氨酸或甘氨酸。在一些實(shí)施方案中，其中突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶分別在與SEQ IDNO:1的113和115比對(duì)的氨基酸處包含亮氨酸、和蘇氨酸或甘氨酸，或者突變體熱穩(wěn)定的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶分別在與SEQ ID NO:1的113和115比對(duì)的氨基酸處包含絲氨酸、和蘇氨酸或甘氨酸，所述的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處包含絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的第三突變體。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，該酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處包含蘇氨酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了突變體熱穩(wěn)定的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶，該酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處包含甘氨酸。在一些實(shí)施方案(該實(shí)施方案可以與任意實(shí)施方案中的之前所述的任意方面結(jié)合)中，與酶原相比，所述的酶在大約50°C下溫育大約I小時(shí)后表現(xiàn)為熱穩(wěn)定性升高。在一些實(shí)施方案中，所述的酶在30、35、40、45、50、55、65或70°C下溫育大約I小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的酶溫育0.5,0.75、1.25、1.5、1.75或2小時(shí)。在某些實(shí)施方案(該實(shí)施方案可以與任意實(shí)施方案中的之前所述的任意方面結(jié)合)中，所述的酶在大約50°C下溫育大約I小時(shí)后具有至少大約0.5mMole GE/μ Mole酶/hr的比活性。在一些實(shí)施方案中,所述的酶在大約50°C下溫育大約I小時(shí)后具有0.5、0.6、0.7,0.8,0.9 或 ImMole GE/μ mo I 酶 / 小時(shí)的比活性。在某些實(shí)施方案(該實(shí)施方案可以與任意實(shí)施方案中的之前所述的任意方面結(jié)合，其中在所述的方面中提供了突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶)中，所述的酶為內(nèi)切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶。在某些實(shí)施方案(該實(shí)施方案可以與任意實(shí)施方案中的之前所述的任意方面結(jié)合，其中在所述的方面中提供了突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶或GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶)中，所述的酶為里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I。在其他實(shí)施方案(該實(shí)施方案可以與任意實(shí)施方案中的之前所述的任意方面結(jié)合，其中在所述的方面中提供了突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶或GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶)中，所述的酶衍生自細(xì)菌或真菌，優(yōu)選選自假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酒用酵母屬、裂殖酵母屬、亞羅酵母屬、枝頂孢屬、傘菌屬、交鏈孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、Botryospaeria、擬臘菌屬、毛_殼屬、金孢屬、麥角菌屬、旋孢腔菌屬、鬼傘屬、乳白蟻屬、棒囊殼屬、隱叢赤殼屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、線黑粉酵母屬、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲(chóng)屬、腐質(zhì)霉、IE菌屬、香燕屬、Leptospaeria、巨座殼屬、Melanocarpus、亞灰樹(shù)花菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新麗鞭毛菌、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉菌屬、平革菌屬、單鞭毛菌屬、Poitrasia、假黑盤(pán)菌屬、纖維素屬、根毛霉屬、裂褶菌屬、節(jié)格孢屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、長(zhǎng)毛盤(pán)菌屬、輪枝孢屬、小包腳燕屬、炭角菌屬或嗜熱側(cè)孢霉(Sporotrichum thermophile)。根據(jù)任意實(shí)施方案中的之前所述的任意方面，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物。根據(jù)任意實(shí)施方案中的之前所述的任意方面，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了編碼突變體熱穩(wěn)定的酶的分離的核酸，其中在所述的方面中提供了突變體糖基水解酶家族7的酶或GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶或里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含之前方面所述的與調(diào)控序列可操作地連接的核酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含之前方面所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自埃希氏菌屬、假單胞菌屬、變形菌屬、勞爾氏菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、乳球菌屬、桿菌屬、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、解脂亞羅酵母(Yarrowia Iipolytica)、漢遜酵母菌屬、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、曲霉屬、Chrysosporium Iucknowense 或里氏木霉。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于生產(chǎn)突變體熱穩(wěn)定的酶的方法，該方法包括將根據(jù)任意實(shí)施方案中的之前所述的方面(提供了宿主細(xì)胞)中的宿主細(xì)胞在適于生產(chǎn)所述的酶的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基的組合物，其中所述的宿主細(xì)胞是根據(jù)任意實(shí)施方案中的之前所述的方面(提供了宿主細(xì)胞)的。本發(fā)明的另一個(gè)方 面提供了在培養(yǎng)基的上清液中包含突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物，其中所述的突變體熱穩(wěn)定的酶是根據(jù)任意實(shí)施方案中的之前所述的方面(提供了突變體糖基水解酶家族7的酶或GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶或里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶)的。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了通過(guò)以下過(guò)程來(lái)降低預(yù)處理生物質(zhì)混合物的粘度的方法:將具有初始年度的預(yù)處理生物質(zhì)混合物與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸；以及在足以降低所述的預(yù)處理生物質(zhì)混合物的初始粘度的條件下溫育經(jīng)接觸的生物質(zhì)混合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的方法，包括將生物質(zhì)與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了水解或降解生物質(zhì)的方法，包括將生物質(zhì)與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了生產(chǎn)可發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括:將生物質(zhì)與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸，從而形成第一產(chǎn)物；以及在足以生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)第一產(chǎn)物與一種或多種可發(fā)酵的微生物。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括:將生物質(zhì)與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸，從而形成第一產(chǎn)物；以及在足以生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的條件下通過(guò)化學(xué)工藝溫育第一產(chǎn)物和化學(xué)溶液。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了發(fā)酵生物質(zhì)的方法，包括將生物質(zhì)與一種或多種可發(fā)酵微生物相接觸，其中所述的生物質(zhì)通過(guò)根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物進(jìn)行了處理。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了生產(chǎn)燃料的方法，包括:將生物質(zhì)與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸，從而產(chǎn)生糖溶液；以及在足以生產(chǎn)燃料的條件下培養(yǎng)糖溶液和發(fā)酵微生物。本發(fā)明的另一個(gè)方面 提供了生產(chǎn)燃料的方法，包括:將生物質(zhì)與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸，從而產(chǎn)生糖溶液；以及在足以生產(chǎn)燃料的條件下通過(guò)化學(xué)工藝溫育糖溶液和化學(xué)溶液。在其中可以與之前所述的任意方面(其提供了多種方法，包括與生物質(zhì)相接觸)結(jié)合的實(shí)施方案中，所述的生物質(zhì)包含結(jié)晶纖維素。在其他的實(shí)施方案中，所述的生物質(zhì)包含木質(zhì)纖維質(zhì)植物材料。在其中所述的生物質(zhì)包含木質(zhì)纖維質(zhì)植物材料的實(shí)施方案中，木質(zhì)纖維質(zhì)植物材料選自:芒屬、能源草、象草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、蘆葦、麥桿、大麥桿、加拿大油菜秸桿、燕麥稿桿、玉米秸桿、大豆秸桿、燕麥皮、高粱、稻殼、甘蔗渣、玉米纖維、含有可溶物的酒精糟(DDGS)、須芒草、玉米穗、松樹(shù)、柳樹(shù)、山楊、楊木和能源甘蔗。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了食品加工的方法，包括將生物質(zhì)與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸，從而產(chǎn)生可消化的植物材料。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了紡織品拋光的方法，包括將紡織品與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸，從而產(chǎn)生拋光的紡織品。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了紡織品清潔的方法，包括將污染的紡織品與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中組合物相接觸，從而產(chǎn)生清潔的紡織品。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了紙漿漂白的方法，包括將紙漿與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸，從而產(chǎn)生漂白的紙漿。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了生產(chǎn)拋光的結(jié)晶纖維素的方法，包括將結(jié)晶纖維素與根據(jù)之前所述的提供了組合物的方面中的組合物相接觸，從而產(chǎn)生拋光的結(jié)晶纖維素。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了洗衣液組合物，該洗衣液組合物包含根據(jù)任意實(shí)施方案中的之前所述的方面中的突變體熱穩(wěn)定的酶、以及洗衣液，其中之前所述的方面提供了突變體糖基水解酶家族7的酶、或GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶、或里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了食品添加劑，該食品添加劑包含根據(jù)任意實(shí)施方案中的之前所述的方面中的突變體熱穩(wěn)定的酶，其中之前所述的方面提供了突變體糖基水解酶家族7的酶、或GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶、或里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶。在其中可以與任意實(shí)施方案中的之前所述的任意方面(其提供了多種方法，包括接觸生物質(zhì)、植物材料、紡織品、污染的紡織品、紙漿或結(jié)晶纖維素)結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述的接觸是在大約50°C至大約55°C的溫度、在大約55°C至大約60°C、或者大約60°C至大約70°C的溫度下實(shí)施的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的接觸是在大約50°C至大約55°C的溫度下實(shí)施的。在其他的實(shí)施方案中，所述的接觸是在大約60°C至大約70°C的溫度下實(shí)施的。在一些實(shí)施方案中，在接觸之前對(duì)生物質(zhì)、植物材料、紡織品、污染的紡織品、紙漿或結(jié)晶纖維素進(jìn)行預(yù)處理。


圖1示出了得自里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶I的晶體結(jié)構(gòu)。(a)示出了具有標(biāo)記為A-G的突變位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。(b)示出了具有標(biāo)記為氨基酸G230、D113和D115的結(jié)構(gòu)的兩個(gè)圖。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)密碼為 IEGl (Kleywegt,GJ et al.，JMolBiol272 (3) =383-397,1997) 圖2示出了野生型里氏木霉EGI的無(wú)細(xì)胞表達(dá)的最佳氧化還原電勢(shì)。圖3示出了在不同 溫度下野生型里氏木霉EGI的活性。(a)示出了通過(guò)DNS方法測(cè)量的在不同的時(shí)間長(zhǎng)度、不同的溫度下溫育后，TrEGI的活性。(b)示出了通過(guò)在CMC平板上形成斑點(diǎn)來(lái)測(cè)量的在不同的時(shí)間長(zhǎng)度、不同的溫度下溫育后，TrEGI的活性。圖4示出了針對(duì)改善的熱穩(wěn)定性來(lái)篩選和選擇突變體里氏木霉EGI的方案。圖5示出了在熱處理之前(左側(cè))和熱處理之后(右側(cè))里氏木霉EGI突變體的CMC平板測(cè)試。圖6示出了不同時(shí)間長(zhǎng)度的熱處理對(duì)通過(guò)篩選工藝鑒別的里氏木霉EGI突變體的活性的影響。根據(jù)突變體在96孔板中的位置在I軸中標(biāo)記該突變體。圖7示出了在50°C下熱處理45分鐘之前(a)和之后(b)測(cè)試的里氏木霉EGI突變體的活性。圖8示出了導(dǎo)致熱穩(wěn)定性增加的在里氏木霉EGI的G230處的取代。圖9示出了在氨基酸230處的不同的突變對(duì)里氏木霉在50°C下的熱穩(wěn)定性的影響。不同的系列表示在50°C下不同的溫育時(shí)間，然后進(jìn)行活性測(cè)量。GE表示“葡萄糖等價(jià)物”。圖10示出了熱處理對(duì)在位點(diǎn)C(氨基酸113和115)具有突變的里氏木霉EGI的活性的影響。GE表示“葡萄糖等價(jià)物”。圖11示出了在氨基酸230、113和115處的突變對(duì)里氏木霉EGI在50°C和53°C下的熱穩(wěn)定性的影響。突變體經(jīng)過(guò)不同時(shí)間長(zhǎng)度的熱處理。GE表示“葡萄糖等價(jià)物”。
圖12示出了里氏木霉EGI突變體對(duì)不同纖維質(zhì)底物的活性。(a)和(C)示出了對(duì)Avicel 的活性，而(b)和(d)示出了對(duì)IL-AviceKD的活性。GE表示“葡萄糖等價(jià)物”。圖13示出了里氏木霉EGI突變體多種底物的活性的比較。(a)示出了對(duì)CMC、Avicel 和IL-Avicel 的活性的比較。(b)示出了對(duì)Avice膽的活性的比較。(c)示出了對(duì)IL-Avicd 的活性的比較。GE表示“葡萄糖等價(jià)物”。圖14示出了在不同溫度下里氏木霉EGI突變體的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)Avicei 的活性。GE表示“葡萄糖等價(jià)物”。圖15示出了在不同溫度下里氏木霉EGI突變體的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)ILw\vicel 的活性。GE表示“葡萄糖等價(jià)物”。圖16示出了在不同溫度下在酵母菌中表達(dá)的具有修整的糖基化的里氏木霉EGI突變體對(duì)AvicxH的活性。GE表示“葡萄糖等價(jià)物”。圖17示出了在酵母菌中表達(dá)的具有修整的糖基化的里氏木霉EGI突變體對(duì)AviC。[K,的 T50。圖18示出了在不同溫度下在酵母菌中表達(dá)的具有修整的糖基化的里氏木霉EGI突變體對(duì)IL-AvicdX..的活性。GE表示“葡萄糖等價(jià)物”。發(fā)明詳述本公開(kāi)涉及突變體熱穩(wěn)定的酶，包括糖基水解酶家族7的酶，例如內(nèi)切葡聚糖酶，這些酶在某些氨基酸殘基上具有突變。本公開(kāi)進(jìn)一步涉及包含突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物和表達(dá)該酶的宿主細(xì)胞，以及它們的使用方法。

1.定義

除非另作說(shuō)明，否者所有的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)均被理解為與這些術(shù)語(yǔ)所屬的技術(shù)領(lǐng)域中常用的含義相同。就本公開(kāi)的目的而言，定義以下術(shù)語(yǔ)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指蛋白質(zhì)的化學(xué)構(gòu)建單元。其包含在蛋白質(zhì)中常發(fā)現(xiàn)的20種標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸以及它們的經(jīng)化學(xué)修飾的版本或類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”是指通過(guò)肽鍵連接的單鏈氨基酸殘基構(gòu)成的化合物。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”與術(shù)語(yǔ)“多肽”是同義的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“酶”是指起到催化功能的多肽。其可以不僅涵蓋多肽的催化部分，而且還涵蓋可能具有或可能不具有與這些催化結(jié)構(gòu)域的功能不同的功能作用的其他結(jié)構(gòu)域或模體。這些其他的結(jié)構(gòu)域或模體可以得自在自然界發(fā)現(xiàn)的多肽或者在商業(yè)上發(fā)現(xiàn)的其他多肽。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“野生型”是指多肽或基因的非突變版本，如同其在物種中自然出現(xiàn)的一樣。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“比對(duì)”是指兩條多肽在結(jié)構(gòu)上或功能上比對(duì)。如果兩種或多種多肽中的氨基酸在不同的多肽中定位于相同的位置，則這些氨基酸被認(rèn)為是比對(duì)的。此外，如果兩種或多種多肽中的氨基酸在不同的多肽中發(fā)揮相同的功能，則這些氨基酸也被認(rèn)為是比對(duì)的。例如，在兩種或多種酶中比對(duì)的氨基酸在(例如)各種酶中或在底物中會(huì)形成相同的接觸；或者在酶功能過(guò)程中發(fā)揮相同的催化作用。比對(duì)可以使用本領(lǐng)域公知的運(yùn)算法來(lái)實(shí)施。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定的”描述了蛋白質(zhì)能夠經(jīng)受有限地暴露于某些溫度(例如高溫)而不會(huì)損失其在其活性是可測(cè)量的或是最佳的溫度下所具有的活性的性質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“活性”定量地描述了給定底物在所定義的反應(yīng)條件下的轉(zhuǎn)化。術(shù)語(yǔ)“比活性”定量地描述了在所定義的反應(yīng)條件下每一定量的酶的活性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“纖維素酶”是指催化酶反應(yīng)的酶(或其酶活性)，包括具有內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(例如葡聚糖水解酶或纖維二糖水解酶、β -葡萄糖苷酶或β -葡萄糖苷酶葡萄糖水解酶)活性以及這些酶的相應(yīng)酶活性的酶，其中在所述的酶反應(yīng)中，纖維素被水解成葡萄糖、纖維二糖或纖維三糖。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“木質(zhì)纖維素”是指主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成的任何材料。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“糖基水解酶家族7的酶”是指術(shù)語(yǔ)糖基水解酶家族7的酶。術(shù)語(yǔ)“GH7”與糖基水解酶家族7是同義的。術(shù)語(yǔ)“GH7家族內(nèi)切葡聚糖酶”是指在具有內(nèi)切葡聚糖酶功能的糖基水解酶家族7的酶。I1.突變體熱穩(wěn)定的酶本公開(kāi)涉及在某些氨基酸殘基上包含突變的熱穩(wěn)定的酶，包括術(shù)語(yǔ)糖基水解酶家族7的酶。申請(qǐng)人不希望被任何理論所束縛；但是據(jù)信，熱穩(wěn)定性的增加可以通過(guò)撓性位點(diǎn)處的殘基突變而取得，這可以通過(guò)酶結(jié)晶過(guò)程中高的B因子值來(lái)表征。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酶為在與SEQ ID NO:1的氨基酸230、113或115比對(duì)的氨基酸處具有突變的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I (TrEGI)。在其他實(shí)施方案中，所述的酶為在與SEQ ID NO:1的氨基酸230和/或113和/或115比對(duì)的氨基酸位置處具有突變的糖基水解酶家族7 (GH7)的成員。氨基酸序列的比對(duì)與SEQ ID NO:1的氨基酸230、113或115比對(duì)的糖基水解酶家族7的成員的氨基酸為與SEQ ID NO:1的氨基酸230、113或115在結(jié)構(gòu)上比對(duì)的那些。與SEQ ID NO:1的氨基酸230、113或115比對(duì)的糖基水解酶家族7的酶的氨基酸可以定位于與在SEQ ID NO:1中相同的位置；更可能的是，它們未在與SEQ ID NO:1的參照序列的相同位置處發(fā)現(xiàn)它們。例如，糖基水解酶家族7的酶除了在氨基酸位置I處具有額外的蛋氨酸外，可以具有與SEQID NO:1—致的序列。在這種情況下，在所述酶的位置231處的殘基甘氨酸與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)。再例如,得自炭色旋孢腔菌(Cochliobolus carbonum)的纖維二糖水解酶I (CBHI)的氨基酸賴氨酸238 (用于不具有信號(hào)肽的成熟酶的殘基編號(hào))與SEQ IDN0:1的氨基酸230比對(duì)。例如，通過(guò)使用運(yùn)算法鑒別比對(duì)的氨基酸，一些運(yùn)算法將在下文討論。在比較窗或設(shè)計(jì)區(qū)域上，可以比較和比對(duì)兩條或多條多肽序列的最大相關(guān)性，這可以使用以下一種序列比較運(yùn)算法或者通過(guò)人工比對(duì)和視覺(jué)檢查來(lái)測(cè)量。就序列比較而言，通常，一條序列起到用于比較測(cè)試序列的參照序列。但使用序列比較運(yùn)算法時(shí)，將測(cè)試序列和參照序列都輸入計(jì)算機(jī)，如果需要設(shè)計(jì)子序列坐標(biāo)系，并設(shè)計(jì)序列運(yùn)算法程序參數(shù)。可以使用缺省程序參 數(shù)，或者可以設(shè)計(jì)備選的參數(shù)。如本文所用，“比較窗”包含指連續(xù)位置編號(hào)的任意一個(gè)編號(hào)的節(jié)段，包括但不限于從20至600，通常大約50至大約200，更通常為大約100至大約150，其中在兩條序列經(jīng)最佳比對(duì)之后，可以將一條序列與相同的連續(xù)位置編號(hào)的參照序列比較。序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域公知的。其實(shí)例為使用 BLAST 運(yùn)算法，其在 Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res25(17):3389-3402 中有所描述。序列最佳比對(duì)的其他實(shí)例為Smith和Waterman(1981)的本地同源性運(yùn)算法，Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol48 (3):443-453 的同源性比對(duì)運(yùn)算法，Pearsonand Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA85 (8):2444-2448 的相似性方法的檢索，這些運(yùn)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin GeneticsSoftware Package, Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison, WI),以及人工比對(duì)和目視檢驗(yàn)[例如參見(jiàn) Brent et al., (2003) Current Protocols in MolecularBiology, John ffiley&Sons, Inc.(Ringbou Ed)]。更優(yōu)選的是，與參照序列的其他特定氨基酸在結(jié)構(gòu)上比對(duì)的氨基酸可以通過(guò)比較晶體結(jié)構(gòu)以鑒別相似的結(jié)構(gòu)模體和撓性區(qū)域來(lái)鑒別，其中撓性區(qū)域通過(guò)高的B因子值來(lái)表征。氨基酸的突變或取代所述的酶由包含多個(gè)保守的聚合氨基酸殘基的氨基酸序列構(gòu)成。除非另作說(shuō)明，否則特定的氨基酸序列還無(wú)疑涵蓋了其保守的經(jīng)修飾的變體。突變體是指其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)由野生型序列改變的酶。用于改變氨基酸序列的技術(shù)包括但不限于定點(diǎn)突變、盒式誘變、隨機(jī)突變、合成寡核苷酸的構(gòu)建、克隆以及其他基因工程改造技術(shù)(Eijsink V G，et al.，2005.Biomol.Eng.22:21-30)。在本公開(kāi)中改變的結(jié)果是，突變體的酶的熱穩(wěn)定性增加。 在與SEQ ID NO:1的氨基酸230、113或115比對(duì)的氨基酸處包含突變的氨基酸殘基的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在該酶的野生型氨基酸序列中在與SEQ IDN0:1的氨基酸230、113或115比對(duì)的氨基酸處具有突變的酶。例如，如果里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的野生型序列為SEQ ID NO:1，突變體里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I可以具有其中在氨基酸230、113或115處具有突變的或取代的氨基酸的SEQ ID NO:1序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶具有這樣的氨基酸殘基，該氨基酸殘基與SEQ ID NO:1的氨基酸230和/或113和/或115比對(duì)，并在氨基酸中被取代/突變成殘基絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸。在一些實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為內(nèi)切葡聚糖酶。更優(yōu)選的是，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I。所述的突變包含使用天然形成的標(biāo)準(zhǔn)的20種氨基酸殘基、保守修飾的變體氨基酸殘基、非密碼子編碼的天然形成的氨基酸殘基以及非天然形成的氨基酸殘基來(lái)取代氨基酸。突變的結(jié)果是，所述的酶的熱穩(wěn)定性增加。如本文所用，“保守修飾的變體氨基酸”包含單獨(dú)的取代、刪除或加入到氨基酸序列中，這會(huì)導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)相似的氨基酸取代。提供了功能上相似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域公知的。以下8組包含彼此保守取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W) ；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(例如參見(jiàn)Creighton，Proteins(1984))。除了 20種標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸，非標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸以及α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、非基因密碼子編碼的氨基酸以及非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后可以被改性，和/或在它們的側(cè)鏈中具有不同于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸可以是化學(xué)合成的，優(yōu)選的是市售可得的，并且包括哌啶酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、以及3，3-二甲基脯氨酸。糖基水解酶家族7的酶在一些實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的酶屬于糖基水解酶家族7。最優(yōu)選的是，糖基水解酶家族7的酶可以為內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶、內(nèi)切-β -1，3-1，4-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或外切纖維素酶。在一些實(shí)施方案中，GH7酶為內(nèi)切葡聚糖酶。最優(yōu)選的是，內(nèi)切葡聚糖酶為具有SEQ ID NO:1的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，內(nèi)切葡聚糖酶包含碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM)。在其他實(shí)施方案中，內(nèi)切葡聚糖酶缺乏CBM。在一些實(shí)施方案中，所述的酶得自細(xì)菌。細(xì)菌物種可以為革蘭氏陽(yáng)性的，例如桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、土芽孢桿菌屬或大洋芽孢桿菌屬；或革蘭氏陰性菌，例如大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬、彎曲桿菌屬、纏繞桿菌屬、產(chǎn)黃菌屬、梭形桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟菌屬或脲原體屬。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酶得自嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽抱桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、Bacillus formus、Bacillus lautus、緩慢牙抱桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱酯肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、或蘇蕓金桿菌(Bacillus thuringiensis)。在其他實(shí)施方案中，所述的酶得自馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)、產(chǎn)胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)、馬鏈球菌馬亞種(Streptococcus,equi subsp.Equi)、馬鏈球菌獸疫亞種(Zooepidemicus)、不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)或變鉛青鏈霉菌(StreptomycesIividans)。在一些實(shí)施方案中，所述的酶得自真菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酶得自:酵母菌物種，包括假絲酵母、克魯維酵母、畢赤酵母、酵母屬、裂殖酵母或亞羅酵母；或者得自絲狀真菌物種，包括枝頂孢、傘菌屬、交鏈孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、Botryospaeria、擬臘菌屬、毛_殼屬、金孢屬、麥角菌屬、旋孢腔菌屬、鬼傘屬、乳白蟻屬、棒囊殼屬、隱叢赤殼屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、線黑粉酵母屬、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲(chóng)屬、腐質(zhì)霉、耙菌屬、香燕屬、Leptospaeria、巨座殼屬、Melanocarpus、亞灰樹(shù)花菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新麗鞭毛菌、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉菌屬、平革菌屬、單鞭毛菌屬、Poitrasia、假黑盤(pán)菌屬、纖維素屬、根毛霉屬、裂褶菌屬、節(jié)格孢屬 、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、長(zhǎng)毛盤(pán)菌屬、輪枝孢屬、小包腳菇屬、炭角菌屬或嗜熱側(cè)孢霉。在一些實(shí)施方案中，所述的酶得自啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、Saccharomyces douglasi1、克魯維酵母菌(Saccharomyces kluyveri)、Saccharomyces norbensis 或卵形酵母(Saccharomyces oviformis) 0 在其他實(shí)施方案中，所述的酶得自解纖維頂抱霉(Acremonium cellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(aspergillus awamori)、熏煙曲菌(aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉棘抱變種(Aspergillus japonicus)、小巢狀曲菌(aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜毛金色抱(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、熱帶金抱(Chrysosporium tropicum)、類狀金抱(Chrysosporium merdarium)、Chrysosporium inops、 Chrysosporium pannicola、 Chrysosporium queenslandicumΛ紋金抱子菌(Chrysosporium zonatum)、Fusarium bactridioides、煎病德抱(Fusariumcerealis)、克 地德刀菌(Fusarium crookwellense)、黃色德刀菌(Fusarium cuImorum)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮刀菌(Fusarium heterosporum)、Fusarium negund1、尖刀德抱菌(Fusarium oxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮刀菌(Fusarium roseum)、接骨木鐮刀菌(Fusarium sambucinum)、膚色德抱(Fusarium sarcochroum)、擬分枝抱德刀菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色德刀菌(Fusarium sulphureum)、念珠德抱菌(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德刀菌(Fusarium trichothecioides)、顯不德刀菌(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpex Iacteus)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲菌(Myceliophthora thermophila)、粗糖脈抱菌(Neurospora crassa)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum)、紫青霉菌(Penicillium PurPurogenum)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、長(zhǎng)梗木霉(Trichoderma Longibrachiatum)、里氏木霉或綠色木霉(Trichoderma viride) □在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酶得自Thielaviaachromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimet1、小抱梭抱殼(Thielavia microspora)、Thielavia ovispora、Thielaviaperuviana、Thielavia spededonium、毛梭抱殼(Thielavia setosa)、耐熱梭抱殼(Thielavia subthermophila)或太瑞斯梭抱殼霉(Thielavia terrestris)。酶的熱穩(wěn)定性/活性酶的活性可以用作其熱穩(wěn)定性的量度。在不同的反應(yīng)條件下(例如在不同的溫度下)監(jiān)測(cè)酶的活性轉(zhuǎn)變?yōu)樵谶@些條件下監(jiān)測(cè)酶的穩(wěn)定性。如果所述的酶在某些反應(yīng)條件下是有活性的，則其被認(rèn)為在這些條件下是穩(wěn)定的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與非突變的野生型酶原相比，突變體熱穩(wěn)定的酶在大約30、35、40、45、50、55、65或70°C的溫度下溫育大約I小時(shí)后表現(xiàn)為活性/熱穩(wěn)定性增加。在一些實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的酶溫育0.5、0.75.1.25.1.5.1.75或2小時(shí)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的酶在大約50°C下溫育大約I小時(shí)后的比活性為至少大約0.5mMole GE/ μ mol酶/小時(shí)，通常為至少大約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或ImMole GE/μπιοΙ酶/小時(shí)。所述的酶通常具有纖維素酶活性(例如內(nèi)切葡聚糖酶、夕卜切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶)和/或纖維素結(jié)合能力。
可以通過(guò)多種公知的方法來(lái)測(cè)量纖維素酶的活性或纖維素的結(jié)合能力，包括酶譜、還原糖測(cè)試(例如 DNS Micro 或 Macro、Nelson-Somogyi Micro 或 Macro、NelsonSem1-Micro、Ferri cyanide-1、Ferri cyanide-2、PAHBAH Micro 或 Macro、BCA 以及 ModifiedBCA)、使用對(duì)硝基酚標(biāo)記的糖苷的測(cè)試、產(chǎn)物分析、總糖測(cè)試(例如苯酚-H2SO4或蒽酮-H2SO4)、酶法葡萄糖測(cè)試、以及纖維素結(jié)合測(cè)試。用于纖維素酶活性和纖維素結(jié)合能力的底物包括可溶性或不可溶性底物?？扇苄缘孜锢绨ɡw維糊精及其衍生物(包括放射性標(biāo)記的纖維糊精)、短鏈纖維素酶、β-甲基傘形酮-寡糖、P-硝基苯酚-寡糖、長(zhǎng)鏈纖維素衍生物、羧甲基纖維素(CMC)、羥乙基纖維素(HEC)、染色的CMC。不可溶性底物例如包括棉、Whatman N0.1濾紙、漿料(例如SolkaFloe)、結(jié)晶纖維素(例如棉)、微晶纖維素(例如Avicel )、斛果纖維素、細(xì)菌纖維素、不定形纖維素(例如PASC、堿膨脹纖維素)、染色纖維素、熒光纖維素、發(fā)色和發(fā)熒光的衍生物(例如三硝基苯酚-羧甲基纖維素(TNP-CMC)和胺熒-纖維素)、包含纖維素的實(shí)踐底物、α -纖維素、以及預(yù)處理的木質(zhì)纖維質(zhì)生物質(zhì)。在氨基酸230處的突變?cè)谝粋€(gè)方面中，本公開(kāi)涉及在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有突變的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或蛋氨酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有賴氨酸的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I。

在氨基酸113處的突變?cè)诹硪粋€(gè)方面中，本公開(kāi)涉及在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有突變的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有亮氨酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有絲氨酸的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶。在氨基酸115處的突變?cè)诹硪粋€(gè)方面中，本公開(kāi)涉及在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有突變的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有蘇氨酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有甘氨酸的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶。包含突變的組合的酶本公開(kāi)涉及在某些氨基酸處具有突變的突變體熱穩(wěn)定的酶，包括糖基水解酶家族7的酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID N0:1的氨基酸230、113或115比對(duì)的氨基酸處具有突變。在一些實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸230、113或115比對(duì)的氨基酸處具有突變的組合。例如，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有突變，并且在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有突變。如上文所述，本公開(kāi)包括在與氨基酸230、113或115比對(duì)的氨基酸處具有突變的所有可能的組合的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶。A)在氨基酸113和115處的突變?cè)谝粋€(gè)方面中，本公開(kāi)涉及在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有突變以及在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的第二氨基酸處具有另一個(gè)突變的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有·亮氨酸，并且在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的第
二氨基酸處具有另一個(gè)突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有亮氨酸，并且在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的第二氨基酸處具有蘇氨酸或甘氨酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有突變并且在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的第二氨基酸處具有另一個(gè)突變的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有絲氨酸并且在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的第二氨基酸處具有蘇氨酸或甘氨酸的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶。B)在氨基酸113、115和230處的突變?cè)趦?yōu)選的實(shí)施方案中，在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有亮氨酸并且在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的第二氨基酸處具有甘氨酸的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的第二氨基酸處具有另一個(gè)突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有亮氨酸或者在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的第二氨基酸處具有蘇氨酸或甘氨酸的突變體熱穩(wěn)定的糖基家族水解酶家族7的酶在與SEQID NO:1的氨基酸230比對(duì)的第二氨基酸處具有絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有絲氨酸以及在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的第二氨基酸處具有蘇氨酸或甘氨酸的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶的酶，其在與SEQ IDNO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有絲氨酸以及在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的第二氨基酸處具有蘇氨酸或甘氨酸的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶的酶，其在與SEQ IDNO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸。C)在氨基酸230和113處的突變?cè)谝粋€(gè)方面中，在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有突變的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID N0:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有亮氨酸或絲氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQ ID NO:I的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有突變的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其在與SEQ ID NO:I的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQ IDNO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有賴氨酸的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其在與SEQ IDNO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQ ID NO:I的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有賴氨酸的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有亮氨酸或絲氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQ ID NO:I的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有突變的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶，其在與SEQ IDNO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處具有亮氨酸或絲氨酸。D)在氨基酸230和115處的突變?cè)谝粋€(gè)方面中，在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有突變的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID N0:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具 有其他的突變。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有蘇氨酸或甘氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQ ID NO:I的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有突變的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其在與SEQ ID NO:I的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQ IDNO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有賴氨酸的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其在與SEQ IDNO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQ ID NO:I的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有賴氨酸的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有蘇氨酸或甘氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQ ID NO:
I的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有突變的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶，其在與SEQ IDNO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有其他的突變。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為在與SEQID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處具有丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處具有蘇氨酸或甘氨酸。

II1.包含突變體熱穩(wěn)定的酶的多肽在一些實(shí)施方案中，將所提供的酶與包括前導(dǎo)肽、前肽、結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或催化結(jié)構(gòu)域的功能結(jié)構(gòu)域融合。合適的結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括但不限于具有各種特異性的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如CBM)，從而為在突變體熱穩(wěn)定的酶的應(yīng)用過(guò)程中存在的碳水化合物成分提供增加的親和性。合適的酶活性結(jié)構(gòu)域在生產(chǎn)所需的產(chǎn)物中具有支持突變體熱穩(wěn)定的酶的作用的活性。催化結(jié)構(gòu)域的非限定性實(shí)例包括:纖維素酶、半纖維素酶(例如木聚糖酶、內(nèi)切甘露聚糖酶、外切甘露聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、果膠酶)、和/或其他活性(例如蛋白酶、脂肪酶、酸性磷酸酶和/或它們的其他或功能片段)。融合蛋白可任選地通過(guò)連接體序列與所述的多肽連接，其中所述的連接體序列在不會(huì)顯著地影響所提供的突變體熱穩(wěn)定的酶或其片段、以及融合結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)的條件下簡(jiǎn)單地將這二者連接起來(lái)，或者對(duì)于預(yù)期應(yīng)用而言，所述的連接體可任選地具有功能重要性。在一些實(shí)施方案中，蛋白水解酶的切割位點(diǎn)位于融合蛋白伴侶與所關(guān)注的蛋白質(zhì)序列之間，從而可以除去融合蛋白序列。IV.核酸、載體和宿主細(xì)胞此外，還提供了載體、宿主細(xì)胞和用于生產(chǎn)突變體熱穩(wěn)定的酶的方法。在一個(gè)方面中，本公開(kāi)提供了編碼突變體熱穩(wěn)定的酶的分離的核酸。在另一個(gè)方面中，本公開(kāi)提供了包含分離的核酸的表達(dá)載體，其中所述的核酸編碼了突變體熱穩(wěn)定的酶。在另一個(gè)方面中，本公開(kāi)提供了具有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包含編碼突變體熱穩(wěn)定的酶的分離的核酸。在另一個(gè)方面中，本公開(kāi)提供了通過(guò)以下過(guò)程來(lái)生產(chǎn)突變體熱穩(wěn)定的酶的方法:在適于酶生產(chǎn)的條件下，培養(yǎng)包含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體具有編碼突變體熱穩(wěn)定的酶的核酸。在一些實(shí)施方案中，編碼所述的酶的DNA可以由公開(kāi)的序列以化學(xué)方式合成，或者直接由容納有所述的基因(例如通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選或PCR擴(kuò)增)的宿主細(xì)胞獲得。在一些實(shí)施方案中，所述的酶包含在表達(dá)盒中和/或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)克隆到合適的表達(dá)載體中。此類表達(dá)盒或載體包含有助于轉(zhuǎn)錄的起始和終止(例如啟動(dòng)子和終止子)的序列，并且通常包含可選擇的標(biāo)記。表達(dá)載體/宿主細(xì)胞的組合是公知的，并且可以用于所提供的方法中。通常，將表達(dá)盒或載體引入到合適的表達(dá)宿主細(xì)胞中，然后該細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的多肽。特別合適的表達(dá)宿主為細(xì)菌表達(dá)宿主屬，包括:埃希氏菌屬(例如大腸桿菌)、假單胞菌屬(例如螢光假單胞菌(P.fluorescens)或斯氏假單胞菌(P.stutzerei))、變形菌屬(例如奇異變形桿菌(Proteus mirabilis))、勞爾氏菌屬(例如真氧產(chǎn)堿桿菌(Ralstonia eutropha))、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬(例如肉糖葡萄球菌(S.carnosus))、乳球菌屬(例如乳酸乳球菌(Llactis))或桿菌(枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等)。此外，特別合適的為酵母表達(dá)宿主，例如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母菌、解脂亞羅酵母、漢遜酵母菌、乳酸克魯維酵母或巴斯德畢赤酵母菌。特別合適的為真菌表達(dá)宿主，例如黑曲霉、Chrysosporiumlucknowense、曲霉屬(例如米曲霉、黑曲霉、小巢狀曲菌等)或里氏木霉。此外，合適的為哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，例如小鼠(例如NS0)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(CHO)或幼地鼠腎(BHK)細(xì)胞系。諸如昆蟲(chóng)細(xì)胞之類的其他真核宿主或病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如噬菌體，例如M13、T7噬菌體或λ噬菌體；或病毒，例如桿狀病毒)也適用于生產(chǎn)突變體熱穩(wěn)定的酶。在所關(guān)注的特定宿主中與分泌蛋白質(zhì)有關(guān)的啟動(dòng)子和/或信號(hào)序列為在該宿主或在其他宿主中進(jìn)行異源生產(chǎn)和分泌的 候選物。例如，在絲狀真菌系統(tǒng)中，驅(qū)動(dòng)纖維二糖水解酶I (cbhl)、葡糖淀粉酶A(glaA)、TAKA-淀粉酶(amyA)、木聚糖酶(exlA)、gpd-啟動(dòng)子cbhl、cbhl I > 內(nèi)切葡聚糖酶基因 EG1-EGV > Cel61B、Cel74A、egll_egl5、gpd 啟動(dòng)子、Pgkl>pkil、EF-1 a、tefUcDNAl和hexl的基因的啟動(dòng)子是特別合適的，并且可以衍生自大量不同的有機(jī)體(例如黑曲霉、里氏木霉、米曲霉、泡盛曲霉和小巢狀曲菌)。在一些實(shí)施方案中，所述的酶以重組的方式與編碼合適的同源或異源的信號(hào)序列的多核苷酸有關(guān)，其中所述的信號(hào)序列使得突變體熱穩(wěn)定的酶被分泌到胞外(周質(zhì))空間中，由此允許直接檢測(cè)細(xì)胞上清液(或周質(zhì)空間或裂解物)中的酶的活性。用于大腸桿菌、其他革蘭氏陰性細(xì)菌和本領(lǐng)域已知的其他有機(jī)體的特別合適的信號(hào)序列包括驅(qū)動(dòng)HlyA、DSbA、Pbp、Ph0A、PelB、OmpA、OmpT或M13噬菌體Gill基因表達(dá)的那些。對(duì)于枯草芽孢桿菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌以及本領(lǐng)域已知的其他有機(jī)體而言，特別合適的信號(hào)序列進(jìn)一步包括驅(qū)動(dòng)AprE、NprB、Mpr、AmyA、AmyE、Blac、SacB表達(dá)的那些,而對(duì)于釀酒酵母或其他酵母菌而言,包括嗜殺毒素、Barl> Suc2、交配因子a、InulA或Ggplp信號(hào)序列。信號(hào)序列可以通過(guò)多種信號(hào)肽酶切割，因此將它們由表達(dá)蛋白質(zhì)的其余部分中除去。在一些實(shí)施方案中，酶其余部分單獨(dú)表達(dá)或者與其他肽、標(biāo)記或位于N-或C-末端(例如6XHis、HA或FLAG標(biāo)記)的蛋白質(zhì)形成融合物。合適的融合物包含有助于親和純化或檢測(cè)的標(biāo)記、肽或蛋白質(zhì)(例如6XHis、HA、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、硫氧化蛋白或FLAG標(biāo)記)，以及有助于所提供的多肽的表達(dá)、分泌或加工的那些。合適的加工位點(diǎn)包括腸激酶、STE13、Kex2或用于體內(nèi)或體外切割的其他蛋白酶切割位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述的酶通過(guò)大量的轉(zhuǎn)化方法被引入到表達(dá)宿主細(xì)胞中，所述的方法包括但不限于電穿孔，脂質(zhì)輔助的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染(“脂轉(zhuǎn)染”)，化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(例如使用氯化鈣和/或磷酸鈣)，醋酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如宿主細(xì)胞原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化)，生物“基因槍”轉(zhuǎn)化，PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如宿主細(xì)胞的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化)，原生質(zhì)體融合(例如使用原核或真核原生質(zhì)體)，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、腺病毒或其他病毒、或噬菌體的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)。備選地，所述的酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。可任選的，在所述的酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或使用信號(hào)序列(例如上文提及的那些)被分泌到周質(zhì)空間中之后，滲透或裂解步驟可以用于將突變體熱穩(wěn)定的酶釋放到上清液中。膜屏障的破壞受到機(jī)械手段的影響，其中所述的機(jī)械手段例如超聲波、加壓處理(法壓)、空泡或者使用膜消化酶(例如溶菌酶或酶混合物)。另外備選地，編碼所述的酶的多核苷酸通過(guò)使用合適的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，所關(guān)注的多核苷酸通常在啟動(dòng)子的輔助下轉(zhuǎn)錄，但是連接從而形成環(huán)狀表達(dá)載體是可任選的。在其他實(shí)施方案中，在未轉(zhuǎn)錄的情況下加入或生成外源RNA，并在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中翻譯。在一些實(shí)施方案中，所述的酶以重組方式生產(chǎn)，而在其他實(shí)施方案中，所述的多肽以合成方式生產(chǎn)，或者由天然來(lái)源純化得到。在一些實(shí)施方案中，所述的酶以N-和/或C-末端融合蛋白質(zhì)的方式生產(chǎn)，從而幫助(例如)提取、檢測(cè)和/或純化。融合蛋白質(zhì)伴侶的實(shí)例包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6XHis、GAL4 (DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域)、FLAG標(biāo)記、MYC標(biāo)記或本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員公知的其他標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，在融合蛋白質(zhì)伴侶與所關(guān)注的蛋白質(zhì)序列之間提供蛋白水解酶切割位點(diǎn)，從而允許除去融合蛋白質(zhì)序列。優(yōu)選的是，融合蛋白質(zhì)捕獲妨礙所提供的多肽的活性。V.鉬合物在一些方面中， 本公開(kāi)提供了包含突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶的組合物，其中所述的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶在某些氨基酸殘基處具有突變。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了包含宿主細(xì)胞的組合物，其中所述的宿主細(xì)胞包含表達(dá)載體，該表達(dá)載體具有編碼突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶的核酸。在其他實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了在培養(yǎng)基上清液中包含突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶的組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶為里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I。在一些實(shí)施方案中，所述的組合物包含一種或多種所關(guān)注的其他蛋白質(zhì)?？梢栽谒龅慕M合物中找到的所關(guān)注的蛋白質(zhì)的非限定性實(shí)例包括:半纖維素酶、α-半乳糖酶、β -半乳糖酶、乳糖酶、β -葡聚糖酶、內(nèi)切_β -1，4_葡聚糖酶、纖維素酶、木糖酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、內(nèi)切-甘露聚糖酶、外切-甘露聚糖酶、果膠酶、膠質(zhì)裂解酶、果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯糖酶、聚鼠李糖半乳糖醛酸水解酶、漆酶、還原酶、氧化酶、苯酚氧化酶、木質(zhì)酶、蛋白酶、淀粉酶、磷酸酶、脂肪分解酶、角質(zhì)酶和/或其他酶。V1.使用方法
本公開(kāi)所述的酶、載體、宿主細(xì)胞和組合物在多種工業(yè)應(yīng)用中具有用途，包括:生物質(zhì)的降解，例如在生物燃料生產(chǎn)、紡織品方法(包括清潔、棉軟化和牛仔染整)、洗滌劑的生產(chǎn)和使用(例如護(hù)色、清潔和抗沉積)中生物質(zhì)(例如纖維素和木質(zhì)纖維素)被降解為單糖和寡糖；用于基于食品的方法，包括食品加工和搗碎；用于漿料和紙張方法，例如紙漿漂白、紙漿精化、排水改善、拋光結(jié)晶纖維素的生產(chǎn)以及纖維改性。由此，還提供了所提供的酶、核酸和組合物用于此類目的(例如降解或水解含纖維素的組合物從而生產(chǎn)可溶性的糖，然后例如進(jìn)行酶或化學(xué)發(fā)酵)的方法和用途。突變體熱穩(wěn)定的酶在高溫下保留了酶活性。在一些實(shí)施方案中，在50至55°C的溫度下使用突變體熱穩(wěn)定的酶，通常為大約50、51、52、53或54°C;在大約55至60°C的溫度下使用所述的酶，通常為大約55、56、57、58或59°C;或者在大約60至70°C的溫度下使用所述的酶,通常為大約 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69 或 70。。。這種增加的熱穩(wěn)定性使得突變體的酶特別適用于木質(zhì)纖維素的水解，這理想的是在高溫下實(shí)施。由于突變體熱穩(wěn)定的酶的這種性質(zhì)，該酶可以用于下文所述的多種工業(yè)應(yīng)用中。預(yù)處理生物質(zhì)混合物的粘度的降低包含突變體熱穩(wěn)定的酶的所提供的組合物、表達(dá)該突變體熱穩(wěn)定的酶的宿主細(xì)胞或在培養(yǎng)基的上清液中的突變體熱穩(wěn)定的酶在多種工業(yè)應(yīng)用中具有用途，包括例如在生物燃料生產(chǎn)中，降低預(yù)處理生物質(zhì)混合物的粘度，然后將該生物質(zhì)混合物降解成單糖和寡糖。例如在生物燃料的生產(chǎn)中用作原料的生物質(zhì)通常包含高水平的木質(zhì)素，該木質(zhì)素可能阻斷生物質(zhì)的纖維質(zhì)成分的水解。通常，例如采用高溫和/或高壓來(lái)對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，從而增加纖維質(zhì)成分水解的可達(dá)性。但是，預(yù)處理通常得到高粘性的生物質(zhì)混合物。此外，預(yù)處理生物質(zhì)混合物的高粘度還可能干擾預(yù)處理生物質(zhì)的有效的水解。有利的是，本公開(kāi)的多肽和組合物可以用于降低預(yù)處理生物質(zhì)混合物的粘度，然后進(jìn)一步降解生物質(zhì)。因此，本公開(kāi)的某 些實(shí)施方案涉及通過(guò)以下過(guò)程來(lái)降低預(yù)處理生物質(zhì)混合物的粘度的方法:將具有初始粘度的預(yù)處理生物質(zhì)混合物與本公開(kāi)的包含突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物、表達(dá)該突變體熱穩(wěn)定的酶的宿主細(xì)胞或者在培養(yǎng)基的上清液中的突變體熱穩(wěn)定的酶中的一者相接觸；以及在足以降低預(yù)處理生物質(zhì)混合物的初始粘度的條件下溫育經(jīng)接觸的生物質(zhì)混合物。在一些實(shí)施方案中，所公開(kāi)的方法作為預(yù)處理工藝的一部分實(shí)施。預(yù)處理工藝可以包括在高溫下預(yù)處理生物質(zhì)、并在足以降低混合物的粘度的條件下將預(yù)處理生物質(zhì)與本公開(kāi)的包含突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物、表達(dá)該不變體熱穩(wěn)定的酶的宿主細(xì)胞或在培養(yǎng)基的上清液中的突變體熱穩(wěn)定的酶一起溫育的步驟之后，將包含突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物、表達(dá)該突變體熱穩(wěn)定的酶的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基上清液中的突變體熱穩(wěn)定的酶中的一者加入到預(yù)處理生物質(zhì)混合物中的步驟?？梢詫蛔凅w熱穩(wěn)定的酶的組合物、表達(dá)該突變體熱穩(wěn)定的酶宿主細(xì)胞或在培養(yǎng)物的上清液中的突變體熱穩(wěn)定的酶加入到預(yù)處理生物質(zhì)混合物中，同時(shí)混合物的溫度是高的，或者是在混合物的溫度升高后進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述的方法在其中實(shí)施熱處理的同一器皿或容器中進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，所述的方法在其中實(shí)施熱處理的不同器皿或容器中進(jìn)行。生物質(zhì)可以包括但不限于植物材料、城市固體廢物和廢紙。植物材料包括但不限于芒屬、能源草、象草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、蘆葦、麥桿、大麥桿、加拿大油菜秸桿、燕麥稿桿、玉米秸桿、大豆秸桿、燕麥皮、oat spelt、高粱、稻殼、甘蔗渣、玉米纖維、大麥、燕麥、亞麻、小麥、亞麻籽、桔漿、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾膠、黃豆、含有可溶物的酒精糟(DDGS)、須芒草、玉米穗、松樹(shù)、針葉樹(shù)軟木材、桉樹(shù)、樺木、柳樹(shù)、山楊、楊木、雜交楊樹(shù)、能源甘蔗、短期輪作木本農(nóng)作物、作物殘余、庭院垃圾或它們的組合。生物質(zhì)包括但不限于植物材料、城市固體廢物和廢紙，包括木質(zhì)纖維素原料，例如農(nóng)業(yè)殘余物，例如玉米秸、小麥桿、大麥桿、燕麥秸、大米草、加拿大稻草、豆秸、草(例如柳枝稷、芒草，大米草、草蘆)；纖維處理殘余物，例如谷物纖維、甜菜漿、紙漿廠細(xì)粉和廢品、以及蔗糖渣；園林廢物，例如山楊木、其他硬木、軟木和鋸末；以及消費(fèi)后的廢紙產(chǎn)物；棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾豆膠、大豆。用于生產(chǎn)生物質(zhì)的合適的額農(nóng)作物殘余物包括但不限于棕櫚仁粉、棕櫚仁柏、椰子餅粉、椰子肉干餅以及豆皮。生物質(zhì)的降解包含突變體熱穩(wěn)定的酶的所提供的組合物、表達(dá)該突變體熱穩(wěn)定的酶的宿主細(xì)胞或在培養(yǎng)基的上清液中的突變體熱穩(wěn)定的酶可以用于降解多種類型的纖維質(zhì)生物質(zhì)，這些纖維質(zhì)生物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的，包括植物生物質(zhì)、微生物生物質(zhì)、純化的纖維素和木質(zhì)纖維素原料。生物能量原料主要由植物細(xì)胞壁成分的纖維素和半纖維素構(gòu)成。這些多肽水解成它們的單糖涉及一組協(xié)同作用從而切割不同的化學(xué)鍵的酶(Dodd and Cann, GCBBioenergy, 1:2, 2009)。在生物質(zhì)(及其他物質(zhì)，包括半纖維素、木質(zhì)素和果膠)中，纖維素為主要的多糖。纖維素為無(wú)水纖維二糖的均聚物(線性β_(1-4)-D-葡聚糖)，并包括在β-1，4-糖苷鍵中連接在一起的葡萄糖單元。半纖維質(zhì)成分在化學(xué)組成上可以改變。半纖維素在具有廣譜取代基的絡(luò)合支化結(jié)構(gòu)中包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。但是，在植物組織中發(fā)現(xiàn)的主要為平行葡聚糖鏈的不溶性結(jié)晶基質(zhì)形式。纖維質(zhì)生物質(zhì)包括木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，其包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。純化的纖維素包括:綜纖維素酶(例如Solka Flok)、微晶纖維素(例如Avicdi和Sigmaec丨I )、以及高度可溶性纖維素醚、羧甲基纖維素(CMC)。含纖維素的底物包括:可溶性底物，例如纖維糊精及其衍生物、短鏈纖維素酶、β -甲基傘形酮-寡糖、P-硝基苯酚-寡糖、長(zhǎng)鏈纖維素衍生物、羧甲基纖維素(CMC)、羥乙基纖維素(HEC);和不溶性底物，包括棉、WhatmanN0.1濾紙、漿料(例如Solka Floc)、 結(jié)晶纖維素(例如棉)、微晶纖維素(例如AviccN)、斛果纖維素、細(xì)菌纖維素、不定形纖維素(例如PASC、堿膨脹纖維素)、染色纖維素、熒光纖維素、發(fā)色和發(fā)熒光的衍生物(例如三硝基苯酚-羧甲基纖維素(TNP-CMC)和胺熒-纖維素)、包含纖維素的實(shí)踐纖維素、α -纖維素、以及預(yù)處理的木質(zhì)纖維質(zhì)生物質(zhì)。在一些方面中，包含突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物、表達(dá)該突變體熱穩(wěn)定的酶的宿主細(xì)胞或者在培養(yǎng)基的上清液中的突變體熱穩(wěn)定的酶可以用于接觸結(jié)晶纖維素，從而產(chǎn)生拋光的結(jié)晶纖維素，該結(jié)晶纖維素可以用于測(cè)試?yán)w維素酶、棒曲霉素以及纖維素結(jié)合蛋白質(zhì)。在其他方面中，包含突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物、表達(dá)該突變體熱穩(wěn)定的酶的宿主細(xì)胞或者在培養(yǎng)基的上清液中的突變體熱穩(wěn)定的酶可以用于接觸生物質(zhì)，從而水解/降解該生物質(zhì)或者將該生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖。在一些實(shí)施方案中，包含突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物、表達(dá)該突變體熱穩(wěn)定的酶的宿主細(xì)胞或者在培養(yǎng)基的上清液中的突變體熱穩(wěn)定的酶可以用于接觸生物質(zhì)，并且將所得的產(chǎn)物在足以生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的條件下與發(fā)酵微生物一起培養(yǎng)，或者與化學(xué)溶液一起溫育。在其他實(shí)施方案中，通過(guò)包含突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物、表達(dá)該突變體熱穩(wěn)定的酶的宿主細(xì)胞或者在培養(yǎng)基的上清液中的突變體熱穩(wěn)定的酶處理生物質(zhì)，并將該生物質(zhì)與一種或多種發(fā)酵微生物相接觸，從而發(fā)酵生物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物質(zhì)經(jīng)預(yù)處理。生物燃料的生產(chǎn)本公開(kāi)所提供的酶和組合物在降解和水解纖維素酶和包含纖維素的生物質(zhì)和原料中具有用途，例如作為化學(xué)品或發(fā)酵原料由生物質(zhì)生產(chǎn)單糖、二糖和寡糖，從而用于生產(chǎn)生物燃料，例如乙醇、丁醇、其他產(chǎn)物或中間體。針對(duì)所提供的多肽的此類用途，提供了方法和組合物，例如將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為用于發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料的可溶性糖，將預(yù)處理木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖，在高鹽或離子液體存在下將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖，在高溫下將結(jié)晶纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖，其中所述的溫度例如為50、51、52、53、54或55°C，或者高于該范圍，例如在60°C至70°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，所提供的組合物包括在除去或未除去細(xì)胞的條件下或者以半純化或純化的酶的制備物形式處于發(fā)酵液粗品的組合物。備選地，本公開(kāi)所提供的宿主細(xì)胞在使用生物質(zhì)的發(fā)酵工藝中用作多肽的來(lái)源。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的酶在為了幫助降解生物質(zhì)而降解纖維素從而形成生物燃料(例如乙醇)中具有用途。通過(guò)酶降解生物質(zhì)并將釋放的糖類轉(zhuǎn)化為乙醇來(lái)生產(chǎn)乙醇。這種乙醇通常稱為生物乙醇或生物燃料。其作為燃料添加劑或混合劑在共混物中為低于1%至至多100% (燃料取代物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了由生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料，所提供的酶、組合物和方法用于將纖 維素轉(zhuǎn)化為其單體(葡萄糖)或其他可溶性糖，以便通過(guò)發(fā)酵(例如通過(guò)微生物發(fā)酵或化學(xué)發(fā)酵)隨后轉(zhuǎn)化為生物燃料(例如乙醇)。例如，所提供的酶和方法可以通過(guò)酶水解而用于此類轉(zhuǎn)化，可任選地包括酸預(yù)處理，該處理通常在高溫下實(shí)施，然后使用所提供的多肽進(jìn)行水解。在一個(gè)實(shí)施方案中，所提供的酶與其他糖酶(例如甘露聚糖酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，α -半乳糖苷酶和/或纖維素酶)結(jié)合使用，以便更大范圍地地水解植物材料。食品加工此外，包含本公開(kāi)的酶的組合物還在食品或動(dòng)物飼料的加工和制造中具有用途。多種抗?fàn)I養(yǎng)因子限定了特定植物材料在動(dòng)物飼料和人類食品的制備中的用途。包含木質(zhì)纖維質(zhì)材料的植物材料(例如纖維素)可以大幅降低動(dòng)物對(duì)植物材料的消化能力。這種作用通過(guò)使用纖維質(zhì)降解酶(即，突變體熱穩(wěn)定的酶)而降低，其中所述的酶允許更高比例的植物材料被轉(zhuǎn)化為飼料，從而降低了飼料的成本。此外，通過(guò)熱穩(wěn)定的酶的活性，纖維質(zhì)材料被分解成簡(jiǎn)單的糖，這些糖可以更容易地被同化從而提供額外的能量。因此，包含本公開(kāi)的酶的組合物優(yōu)選用于食品或動(dòng)物飼料的加工和/或制造。本公開(kāi)所提供的酶可用作單胃動(dòng)物(例如家禽和豬)的飼料及人類食品的添加齊U。在一些實(shí)施方案中，所述的酶可用于預(yù)處理所述的飼料而非作為飼料添加劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酶被加入或用于預(yù)處理斷奶仔豬、保育豬、豬仔、肥育豬、生長(zhǎng)豬、生長(zhǎng)肥育豬、產(chǎn)卵雞、肉雞和/或火雞的飼料。在一些實(shí)施方案中，所述的酶被加入或用于預(yù)處理得自植物材料的飼料，其中所述的植物材料例如為棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾豆膠、黃豆、大麥、燕麥、亞麻、小麥、玉米、亞麻籽、桔漿、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆和羽扇豆。由于所述的酶的熱穩(wěn)定性，它們?cè)谏a(chǎn)球狀飼料的工藝中具有用途，其中在所述的方法中，在制粒步驟之前對(duì)飼料混合物加熱，如同在大多數(shù)商業(yè)化制粒機(jī)中的情況那樣。在一個(gè)實(shí)例中，在制粒步驟之前將所述的酶加入到其他飼料組分中，或在制粒步驟之后將所述的多肽加入到已經(jīng)成形的飼料球狀物中。在包含用于食品加工或作為食品補(bǔ)充劑的、包含所述的酶的組合物中，該組合物可任選地包含其他取代物，例如著色劑、芳香化合物、穩(wěn)定劑、維生素、礦物質(zhì)、其他飼料或食品增強(qiáng)的酶等。這特別應(yīng)用于所謂的預(yù)混合物。根據(jù)本公開(kāi)的食品添加劑可以與其他食品成分結(jié)合，從而生產(chǎn)經(jīng)加工的食品產(chǎn)物。所得的結(jié)合的食品添加劑以合適的量與其他食品成分(例如谷物或植物蛋白質(zhì))混合，從而形成經(jīng)加工的食品產(chǎn)物。紡織品清潔及洗衣洗滌劑此外，所提供的酶、方法和組合物還在紡織品方法(包括清潔、棉軟化、牛仔染整、在高溫處理下的棉纖的拋光)以及在洗滌劑的生產(chǎn)和使用(例如護(hù)色、清潔和抗沉積)中具有用途。例如，所述的酶在洗滌劑組合物中具有用途，從而有利于除去包含纖維素的污點(diǎn)和污物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的酶用于洗滌劑組合物中；提供了此類洗滌劑組合物及它們的使用方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的洗滌劑組合物包含與得自淀粉酶、甘露聚糖酶、纖維素酶、脂肪酶、果膠酶、蛋白酶、內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的其他酶相結(jié)合的酶。報(bào)案所述的酶的本公開(kāi)的洗滌劑組合物為任何方便的形式(例如條、片、粉末、顆粒、糊狀物或液體)。液體洗滌劑通常是水性的，通常包含至多70%的水和0-30%有機(jī)溶齊U，或非水性的成分。

所述的洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑(例如包含半極性的非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑)。表面活性劑通常以0.1重量％至60重量％的水平存在。當(dāng)洗滌劑包含陰離子表面活性劑時(shí)，其通常包含大約1%至大約40%的陰離子表面活性劑，例如線性烷基苯磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸、或者肥皂。當(dāng)洗滌劑包含非離子表面活性劑時(shí)，其通常包含大約
0.2%至大約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、乙氧基壬基苯酚、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(葡糖酰胺)。洗滌劑組合物可任選地包含0-65%洗滌劑促凈劑或絡(luò)合劑，例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三醋酸、乙二胺四醋酸、二亞乙基三胺五醋酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}。洗滌劑組合物可任選地包含一種或多種聚合物，例如羧甲基纖維素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸鹽(例如聚丙烯酸鹽)、馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物和月桂基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可任選地包含漂白系統(tǒng)(例如過(guò)氧化氫來(lái)源)，例如過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽，其可以與形成過(guò)酸的漂白活化劑(例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸鹽)結(jié)合。備選地，漂白系統(tǒng)包含酰胺、酰亞胺或砜類的過(guò)氧化物過(guò)氧酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，以相應(yīng)于每升洗液0.0l-1OOmg酶蛋白質(zhì)的量加入所述的酶，優(yōu)選的是每升洗液0.05-5mg酶蛋白質(zhì),特別是每升洗液0.1-1mg酶蛋白質(zhì)。紙漿加工在另一個(gè)實(shí)施方案中，所提供的組合物和酶在紙漿和紙方法中具有用途，例如在紙漿漂白、紙漿精化，排水改善和纖維改性中，例如在用于水解纖維素材料的制漿的高溫應(yīng)用中。提供了所提供的酶用于此類目的方法和組合物。例如，在一些實(shí)施方案中，所述的酶在紙漿的酶輔助的漂白中具有用途，例如化學(xué)紙漿、半化學(xué)紙漿、牛皮漿、機(jī)械紙漿或通過(guò)亞硫酸鹽方法制備的紙漿。在一些實(shí)施方案中，所述的紙漿為使用氧、臭氧、過(guò)氧化物或過(guò)氧酸漂白的無(wú)氯紙漿。在一些實(shí)施方案中，所述的酶用于酶輔助的紙漿漂白中，其中所述的紙漿是通過(guò)經(jīng) 修改的或連續(xù)的制漿方法生產(chǎn)的，其中所述的方法表現(xiàn)出較低的木質(zhì)素含量。在一些實(shí)施方案中，所述的酶單獨(dú)使用；在其他實(shí)施方案中，它們與諸如木聚糖酶和/或內(nèi)切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纖維二糖水解酶之類的其他酶結(jié)合使用。提供以 下實(shí)施例來(lái)說(shuō)明所提供的實(shí)施方案，并且無(wú)意于限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1-里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的突變形成由于里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(TrEGI)的晶體結(jié)構(gòu)是可得的，并且其是里氏木霉所生產(chǎn)的最豐富的內(nèi)切葡聚糖酶，所以初始選擇該酶以用于工程改造增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。用于改善TrEGI的人穩(wěn)定性的原始方法依賴于使用B因子向?qū)У姆椒?B-FIT方法)(Reetz，MT et al., Angew Chem IntEd Engl45(46):7745-51,2006) 由晶體結(jié)構(gòu)得到的 B 因子為多肽中殘基流動(dòng)性的量度。在該方法中，選擇具有最高平均B因子(相當(dāng)于最具有撓性的位點(diǎn))的殘基用于突變形成，從而得到改善的熱穩(wěn)定性。該方法基于這樣的假設(shè):可以通過(guò)增加噬溫性酶結(jié)構(gòu)中最具有撓性的位點(diǎn)處的剛性來(lái)增強(qiáng)該酶的熱穩(wěn)定性。使用TrEGI酶的晶體結(jié)構(gòu)，鑒別出具有最高B因子值的20種殘基(表I)。選擇7個(gè)位點(diǎn)(由一個(gè)或多個(gè)氨基酸構(gòu)成){位點(diǎn) A(aa284-287)、位點(diǎn) B(aa301_302)、位點(diǎn) C(aall3，115)、位點(diǎn) D(aa238)、位點(diǎn)E(aa230)、位點(diǎn)F(aa323)、位點(diǎn)G(aa291)}用于突變形成(圖1 ;表I)。表I示出了在里氏木霉EGI中具有最高的B因子值的殘基。
權(quán)利要求
1.一種突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處包含絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或蛋氨酸。
2.一種突變體熱穩(wěn)定的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處包含賴氨酸。
3.一種突變體熱穩(wěn)定的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處包含丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸。
4.一種突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處包含亮氨酸。
5.一種突變體 熱穩(wěn)定的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處包含絲氨酸。
6.一種突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處包含蘇氨酸。
7.一種突變體熱穩(wěn)定的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I，其在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處包含甘氨酸。
8.權(quán)利要求4所述的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，其中所述的酶在與SEQID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含蘇氨酸或甘氨酸。
9.權(quán)利要求5所述的突變體熱穩(wěn)定的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其中所述的酶在與SEQID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含蘇氨酸或甘氨酸。
10.權(quán)利要求8或9所述的突變體熱穩(wěn)定的酶，其中所述的酶在與SEQIDNO:1的氨基酸230比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸。
11.權(quán)利要求1所述的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，其中所述的酶在與SEQID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含亮氨酸或絲氨酸。
12.權(quán)利要求2所述的突變體熱穩(wěn)定的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其中所述的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含亮氨酸或絲氨酸。
13.權(quán)利要求3所述的突變體熱穩(wěn)定的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I，其中所述的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸113比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含亮氨酸或絲氨酸。
14.權(quán)利要求1所述的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，其中所述的酶在與SEQID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含蘇氨酸或甘氨酸。
15.權(quán)利要求2所述的突變體熱穩(wěn)定的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其中所述的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含蘇氨酸或甘氨酸。
16.權(quán)利要求3所述的突變體熱穩(wěn)定的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I，其中所述的酶在與SEQ ID NO:1的氨基酸115比對(duì)的氨基酸處進(jìn)一步包含蘇氨酸或甘氨酸。
17.上述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的突變體熱穩(wěn)定的酶，其中所述的酶在大約50°C下溫育大約I小時(shí)后表現(xiàn)為比野生型酶增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。
18.上述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的突變體熱穩(wěn)定的酶，其中所述的酶在大約50°C下溫育大約I小時(shí)后具有至少大約0.5mMole GE/μ Mole酶/hr的比活性。
19.權(quán)利要求1、4、6、8、10、11或14的任意一項(xiàng)所述的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，其中所述的酶為內(nèi)切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶。
20.權(quán)利要求1、4、6、8、10、11或14的任意一項(xiàng)所述的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，或者權(quán)利要求2、5、9、10、12或15的任意一項(xiàng)所述的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其中所述的酶為里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I。
21.權(quán)利要求1、4、6、8、10、11或14的任意一項(xiàng)所述的突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，或者權(quán)利要求2、5、9、10、12或15的任意一項(xiàng)所述的GH7家族的內(nèi)切葡聚糖酶，其中所述的酶衍生自真菌或細(xì)菌。
22.權(quán)利要求21所述的突變體熱穩(wěn)定的酶，其中所述的酶衍生自選自以下的真菌:假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、Saccharomyces、裂殖酵母屬、亞羅酵母屬、枝頂孢屬、傘菌屬、交鏈孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、Botryospaeria、擬臘菌屬、毛_殼屬、金孢屬、麥角菌屬、旋孢腔菌屬、鬼傘屬、乳白蟻屬、棒囊殼屬、隱叢赤殼屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、線黑粉酵母屬、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲(chóng)屬、腐質(zhì)霉，IE菌屬、香燕屬、Leptospaeria、巨座殼屬、Melanocarpus、亞灰樹(shù)花菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新麗鞭毛菌,脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉菌屬、平革 菌屬、單鞭毛菌屬、Poitrasia、假黑盤(pán)菌屬、纖維素屬、根毛霉屬、裂褶菌屬、節(jié)格孢屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、長(zhǎng)毛盤(pán)菌屬、輪枝孢屬、小包腳菇屬、炭角菌屬或嗜熱側(cè)孢霉。
23.—種包含權(quán)利要求1至22的任意一項(xiàng)所述的突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物。
24.一種編碼權(quán)利要求1至22的任意一項(xiàng)所述的突變體熱穩(wěn)定的酶的分離的核酸。
25.一種表達(dá)載體，其包含與調(diào)控序列可操作的連接的權(quán)利要求24所述的核酸。
26.—種包含權(quán)利要求25所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
27.權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞選自:埃希氏菌屬、假單胞菌屬、變形菌屬、勞爾氏菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、乳球菌屬、桿菌屬、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母菌、解脂亞羅酵母、漢遜酵母菌屬、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母菌、曲霉屬、Chrysosporium Iucknowense 或里氏木霉。
28.一種用于生產(chǎn)突變體熱穩(wěn)定的酶的方法，其包括:在培養(yǎng)基中，在適于生產(chǎn)所述的酶的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求26或27所述的宿主細(xì)胞。
29.—種包含權(quán)利要求26或27所述的宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基的組合物。
30.一種在所述的培養(yǎng)基的上清液中包含權(quán)利要求1至22的任意一項(xiàng)所述的突變體熱穩(wěn)定的酶的組合物。
31.一種降低預(yù)處理生物質(zhì)混合物的粘度的方法，包括: 將具有初始粘度的預(yù)處理生物質(zhì)混合物與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸；以及 在足以降低所述的預(yù)處理生物質(zhì)混合物的初始粘度的條件下溫育所述的經(jīng)接觸的生物質(zhì)混合物。
32.—種將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的方法，其包括將所述的生物質(zhì)與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸。
33.一種水解和降解生物質(zhì)的方法，其包括將所述的生物質(zhì)與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸。
34.一種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括: 將生物質(zhì)與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸，從而形成第一產(chǎn)物；以及 在足以生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)所述的第一產(chǎn)物和一種或多種發(fā)酵微生物。
35.一種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括: 將生物質(zhì)與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸，從而形成第一產(chǎn)物；以及 在足以通過(guò)化學(xué)工藝來(lái)生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的條件下溫育所述的第一產(chǎn)物和化學(xué)溶液。
36.一種發(fā)酵生物質(zhì)的方法，包括: 將所述的生物質(zhì)與一種或多種發(fā)酵微生物相接觸，其中所述的生物質(zhì)經(jīng)過(guò)權(quán)利要求23,29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物的處理。
37.一種生產(chǎn)燃料的方法,包括: 將生物質(zhì)與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸，從而產(chǎn)生糖溶液；以及 在足以生產(chǎn)燃料的條件下培養(yǎng)所述的糖溶液和發(fā)酵微生物。
38.一種生產(chǎn)燃料的方法,包括: 將生物質(zhì)與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸，從而產(chǎn)生糖溶液；以及 在足以通過(guò)化學(xué)工藝來(lái)生產(chǎn)燃料的條件下溫育所述的糖溶液和化學(xué)溶液。
39.權(quán)利要求31至38的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的生物質(zhì)包含結(jié)晶纖維素。
40.權(quán)利要求31至38的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的生物質(zhì)包含木質(zhì)纖維質(zhì)植物材料。
41.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的植物材料選自:芒屬、能源草、象草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、蘆葦、麥桿、大麥桿、加拿大油菜秸桿、燕麥稿桿、玉米秸桿、大豆秸桿、燕麥皮、高粱、稻殼、甘蔗渣、玉米纖維、含有可溶物的酒精糟(DDGS)、須芒草、玉米穗、松樹(shù)、柳樹(shù)、山楊、楊木和能源甘蔗。
42.一種食品加工方法，包括: 將植物材料與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸，從而產(chǎn)生可消化的植物材料。
43.一種紡織品拋光方法，包括: 將紡織品與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸，從而產(chǎn)生拋光的紡織品。
44.一種紡織品清潔方法，包括: 將污染的紡織品與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸，從而產(chǎn)生清潔的紡織品。
45.一種紙漿漂白方法，包括: 將紙漿與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸，從而產(chǎn)生漂白的紙漿。
46.—種生產(chǎn)拋光的結(jié)晶纖維素的方法,包括: 將結(jié)晶纖維素與權(quán)利要求23、29和30的任意一項(xiàng)所述的組合物相接觸，從而產(chǎn)生拋光的結(jié)晶纖維素。
47.一種包含權(quán)利要求1至22的任意一項(xiàng)所述的酶和洗滌劑的洗衣洗滌劑組合物。
48.一種包含權(quán)利要求1至22的任意一項(xiàng)所述的酶的食品添加劑。
49.權(quán)利要求31至46的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的接觸是在大約50°C至大約55°C、大約55°C至大約60°C、或者大約60°C至大約70°C的溫度下實(shí)施的。
50.權(quán)利要求31至46的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的接觸是在大約50°C至大約55 °C的溫度下實(shí)施的。
51.權(quán)利要求31至46的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的接觸是在大約60°C至大約70°C的溫度下實(shí)施的。
52.權(quán)利要求31至46以及49至51的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的生物質(zhì)、植物材料、紡織品、污染的紡織品、紙漿或結(jié)`晶纖維素在接觸前經(jīng)預(yù)處理。
全文摘要
本公開(kāi)涉及突變體熱穩(wěn)定的糖基水解酶家族7的酶，包括突變體里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I。具體而言，本公開(kāi)涉及突變體熱穩(wěn)定的酶、包含該酶的組合物以及它們的用法。
文檔編號(hào)C12N9/42GK103119159SQ201180043816
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者H·A·喬卡瓦拉, T-W·金, H·W·布蘭切, D·S·克拉克 申請(qǐng)人:加州大學(xué)評(píng)議會(huì)