專利名稱：利用siRNA導(dǎo)入的新型hiPSC制作法的制作方法
利用S i RNA導(dǎo)入的新型h i PSC制作法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型的小RNA (small RNA)、多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑、惡性腫瘤治療藥或多能干細(xì)胞等。
背景技術(shù)：
iPS細(xì)胞的制作技術(shù)，是在近年來的醫(yī)療行業(yè)特別受矚目的領(lǐng)域。作為代表的iPS細(xì)胞的制作技術(shù)，可以列舉:專利文獻(xiàn)I中記載的方法。該文獻(xiàn)中記載了:通過將4個基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)導(dǎo)入細(xì)胞，制作iPS細(xì)胞。從開發(fā)該技術(shù)開始，與iPS細(xì)胞相關(guān)的研究成果的報告數(shù)快速增加。例如，專利文獻(xiàn)2中記載了:通過將3個基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)和I個miRNA (hsa-miR-372等)導(dǎo)入細(xì)胞，制作iPS細(xì)胞。非專利文獻(xiàn)I中記載了:在導(dǎo)入上述4個或3個基因的情況下，如果缺損使iPS化的細(xì)胞的p53基因，則iPS細(xì)胞的制作效率上升。非專利文獻(xiàn)2中記載了:通過導(dǎo)入pre-miRNA的團(tuán)簇(miR_302a miR-302d),由癌細(xì)胞制作iPS細(xì)胞。另一方面，制藥會社近年來特別投入資金的領(lǐng)域是癌領(lǐng)域。癌的機(jī)理復(fù)雜且不明確的方面多，與其他疾病相比，有效的治療藥少。因此，期待開發(fā)該領(lǐng)域的新型的治療藥。本申請發(fā)明人在非專利文獻(xiàn)3中報道了可以采用hTERTmRNA作為癌的生物標(biāo)記。另外，非專利文獻(xiàn)4中報道了:hTERT mRNA的表達(dá)與RGM249mRNA相關(guān)，通過針對RGM249mRNA的shRNA或siRNA，hTERT mRNA的表達(dá)量減少。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I國際公開第2007/069666號 專利文獻(xiàn)2國際公開第2009/075119號 非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I‘Suppression of induced pluripotent stem cell generationby the p53_p21pathway.’ Hong et al., Nature.2009Aug27;460 (7259):1132-5.Epub2009Aug9.非專利文獻(xiàn)2‘Mir_302reprograms human skin cancer cells into a pluripotentES-cell-like state.，Lin et al.，RNA.20080ct;14 (10):2115-24.Epub2008Aug28.非專利文獻(xiàn)3‘A novel biomarker TERT mRNA is applicable for early detectionof hepatoma.’ Miura et al., BMC Gastroenterol.2010Mayl8;10:46.非專利文獻(xiàn) 4‘A noncoding RNA gene on chromosomeIOp 15.3may functionupstream of hTERT.’ Miura et al., BMC Mol Biol.2009Feb2;10:5.
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題然而，上述文獻(xiàn)記載的現(xiàn)有技術(shù)在以下方面具有改善的余地。在上述文獻(xiàn)中，iPS細(xì)胞的制作方法慢慢地不斷明確，但為了更有效地開發(fā)更高品質(zhì)的iPS細(xì)胞，需要明確新的制作方法，并且不斷積累關(guān)于iPS細(xì)胞的信息。關(guān)于各文獻(xiàn)，專利文獻(xiàn)I中，使用作為癌原基因的c-Myc，因此，暗藏iPS細(xì)胞發(fā)生癌化的風(fēng)險。專利文獻(xiàn)2中，沒有使用c-Myc，但將3個基因和I個miRNA導(dǎo)入細(xì)胞的步驟復(fù)雜，不能說是高效的制作方法。非專利文獻(xiàn)I中，沒有使用c-Myc，但缺損作為癌抑制基因的p53基因，因此，擔(dān)負(fù)細(xì)胞的癌化和不穩(wěn)定化等風(fēng)險。非專利文獻(xiàn)2提到:使用miR-302的團(tuán)簇，但miR-302是以腫瘤抑制因子即PTEN (染色體10上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物；phosphatase and tensin homo log deleted on chromosome 10)作為目標(biāo)的 miRNA(Poliseno et al., Sci Signal.2010Aprl3; 3 (117):ra29)。因此,擔(dān)負(fù)細(xì)胞的癌化的風(fēng)險。另一方面，上述文獻(xiàn)中，惡性腫瘤的機(jī)理慢慢明確，但僅僅這樣的程度還不能說充分，為了制定新型的醫(yī)藥品或治療戰(zhàn)略方案，需要明確新的抗惡性腫瘤物質(zhì)，并且不斷積累關(guān)于惡性腫瘤的信息。非專利文獻(xiàn)3以及4中記載了:hTERT mRNA與癌形成有關(guān)；和通過針對RGM249mRNA的shRNA或siRNA，hTERT mRNA減少，但對癌具有治療效果的物質(zhì)還不明確。本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的，其目的在于，提供誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的新型的化合物。或者，其目的在于，提供未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑。另外的目的在于，提供多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)劑。另外，其他目的在于，提供新型的惡性腫瘤治療藥。另外，其他目的在于，提供新型的多能干細(xì)胞。
用于解決課題的方法根據(jù)本發(fā)明，提供一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有包含序列號1、2、3、8或44 47中的I個以上堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸，并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。該多能干細(xì)胞誘 導(dǎo)劑，含有在下述實施例中證實將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的單鏈或雙鏈的多核苷酸。因此，如果使用該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，則能夠?qū)⒓?xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有包含序列號1、2、3、8或44 47中的I個以上堿基序列的小RNA，并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，含有在下述實施例中證實將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的小RNA。因此，如果使用該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，則能夠?qū)⒓?xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有:包含相對于將包含序列號7的堿基序列的RNA鏈用RNA內(nèi)切酶III(Dicer)進(jìn)行處理而得到的RNA鏈互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸，并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，含有在下述實施例中證實將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的單鏈或雙鏈的多核苷酸。因此，如果使用該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，則能夠?qū)⒓?xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑，其含有包含序列號1、2、3或8的堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸，并且調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。該未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑，含有在下述實施例中證實促進(jìn)或抑制細(xì)胞內(nèi)的未分化細(xì)胞標(biāo)記的單鏈或雙鏈的多核苷酸。因此，如果使用該未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑，則能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)量。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種多能干細(xì)胞的p53表達(dá)促進(jìn)劑，其含有包含序列號1、
2、3、8或44 47中的I個以上堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸，并且促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量。該P(yáng)53表達(dá)促進(jìn)劑，含有在下述實施例中證實促進(jìn)多能干細(xì)胞中的p53的表達(dá)量的單鏈或雙鏈的多核苷酸。因此，如果使用該P(yáng)53表達(dá)促進(jìn)劑，則能夠促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種多能干細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其中，包括:將包含序列號
1、2或3的堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞的步驟。該生產(chǎn)方法，在下述實施例中證實能夠利用于制作多能干細(xì)胞。因此，如果使用該生產(chǎn)方法，則能夠生產(chǎn)多能干細(xì)胞。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種惡性腫瘤的治療藥，其含有包含序列號1、2、3、8或44 47中的I個以上堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸。該惡性腫瘤的治療藥，含有在下述實施例中證實抑制惡性腫瘤的單鏈或雙鏈的多核苷酸。因此，如果使用該惡性腫瘤的治療藥，則能夠進(jìn)行惡性腫瘤的治療。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種siRNA，其含有包含序列號1、2或3的堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸。該siRNA含有在下述實施例中證實將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)量、促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量或抑制惡性腫瘤的單鏈或雙鏈的多核苷酸。因此，如果使用該siRNA，則能夠?qū)⒓?xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)量、促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量或進(jìn)行惡性腫瘤的治療。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種載體，其含有包含與序列號I的喊基序列互補(bǔ)的喊基序列的多核苷酸?；蛘咛峁┮环N載體，其含有包含與序列號2的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸?；蛘咛峁┮环N載體，其含有包含與序列號3的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。或者提供一種載體，其含有包含與序列號8的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸?；蛘咛峁┮环N載體，其含有包含與序列號44 47中的I個以上堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。如果利用這些載體，則能夠表達(dá)包含序列號1、2、3、8或44 47中的I個以上堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸。因此，如果使用這些載體，則能夠?qū)⒓?xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)量、促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量或進(jìn)行惡性腫瘤的治療。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的單鏈或雙鏈的多核苷酸，并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，含有在下述實施例中證實將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的單鏈或雙鏈的多核苷酸。因此，如果使用該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，則能夠?qū)⒓?xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種shRNA，其含有包含序列號8的堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸。

該shRNA含有在下述實施例中證實將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)量、促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量或抑制惡性腫瘤的單鏈或雙鏈的多核苷酸。因此，如果使用該shRNA，則能夠?qū)⒓?xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)量、促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量或進(jìn)行惡性腫瘤的治療。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)用、未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)用、多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)用或惡性腫瘤的治療用的試劑盒(KU)，其含有包含序列號1、2、
3、8或44 47中的I個以上堿基序列的多核苷酸。如果利用該試劑盒，則能夠簡便地使用在下述實施例中證實將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)量、促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量或抑制惡性腫瘤的單鏈或雙鏈的多核苷酸。因此，如果使用該試劑盒，則能夠?qū)⒓?xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)量、促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量或進(jìn)行惡性腫瘤的治療。需要說明的是，在上述任意一項的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑、未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)齊U、P53表達(dá)促進(jìn)劑、多能干細(xì)胞的生產(chǎn)方法、惡性腫瘤的治療藥、SiRNA、載體、ShRNA以及試劑盒中，序列號I 3、8或44 47中的I個以上堿基序列中的I 3個堿基可以缺失、被置換或者加成?；蛘撸蛄刑? 6或9的堿基序列中的I 5個堿基可以缺失、被置換或者加成?；蛘?，序列號7的堿基序列中的I 4個堿基可以缺失、被置換或者加成。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種多能干細(xì)胞，其是來自哺乳動物的細(xì)胞的多能干細(xì)胞，與HPS0002:253G1株相比，內(nèi)在性的p53的表達(dá)量增大。該多能干細(xì)胞由于p53的表達(dá)量多，因此,難以產(chǎn)生惡性腫瘤化。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，得到誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的新型的化合物。或者，得到調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)的新型的化合物?；蛘?，得到多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)劑?；蛘?，得到新型的惡性腫瘤治療藥?；蛘撸玫叫滦偷牡亩嗄芨杉?xì)胞。`

圖1A是表示RGM249的二級結(jié)構(gòu)的圖。
圖1B是表示RGM249shRNA和RGM249m_lshRNA的二級結(jié)構(gòu)的圖。
圖1C是考察RGM249shRNA皮下注射后的腫瘤體積的變化的結(jié)果。
圖1D是皮下注射RGM249shRNA質(zhì)粒等時的、腫瘤體積的目視的觀察結(jié)果。
圖2A是在從皮下注射RGM249shRNA質(zhì)粒等35日后，考察腫瘤中表達(dá)的基因的表達(dá)抑制效果的結(jié)果。
圖2B是在從靜脈注射RGM249shRNA質(zhì)粒等28日后，考察腫瘤中表達(dá)的基因的表達(dá)抑制效果的結(jié)果。
圖3A是表示與RGM249mRNA、和內(nèi)部的3個miRNA相當(dāng)?shù)牟课坏慕Y(jié)果。
圖3B是表示3個miRNA的二級結(jié)構(gòu)的圖。
圖3C是比較3個miRNA與3個siRNA的反義鏈的序列的結(jié)果。
圖3D是考察將3個siRNA向HMV-1轉(zhuǎn)染后的、癌細(xì)胞增殖的抑制效果的結(jié)果。
圖3E是從將3個siRNA混合物同時轉(zhuǎn)染而成的HMV-1中進(jìn)行RNA提取、考察miR-47、miR-10UmiR-197的表達(dá)水平的結(jié)果。
圖3F是對于與癌、多分化能、干細(xì)胞性相關(guān)的基因、評價由3個siRNA混合物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)染子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的結(jié)果。圖4是考察由3個siRNA混合物+DDS的皮下給藥產(chǎn)生的、HMV-1細(xì)胞的增殖性的抑制的結(jié)果。
圖5A是表示進(jìn)行評價的腫瘤的某個部分的圖。
圖5B是評價由3個siRNA混合物引起的、miR-47、miR-10U miR-197各自的表達(dá)抑制
效果的結(jié)果。
圖5C是通過顯微鏡觀察用siRNA處理后的腫瘤的照片。
圖是考察將3個siRNA混合物給藥的情況下的腫瘤、分化、多能性的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果。
圖6A是將miR-197siRNA轉(zhuǎn)染成293FT細(xì)胞后、通過顯微鏡觀察的照片。
圖6B是表示hsa-mir_520d的二級結(jié)構(gòu)的圖。
圖6C是通過顯微鏡在免疫組織化學(xué)上觀察將miR-197siRNA轉(zhuǎn)染而成的293FT細(xì)胞的照片。
圖6D是通過病毒載體使hsa-mir-520d轉(zhuǎn)染HT1080細(xì)胞，并強(qiáng)制表達(dá)后，在免疫組織科學(xué)的試驗中觀察未分化標(biāo)記的表達(dá)量的結(jié)果。
圖6E是通過病毒載體使hsa-mir-520d轉(zhuǎn)染T98G細(xì)胞，并強(qiáng)制表達(dá)后，在免疫組織科學(xué)的試驗中觀察未分化標(biāo)記的表達(dá)量的結(jié)果。
圖6F是通過病毒載體使hsa-mir-520d轉(zhuǎn)染PK_45p細(xì)胞，并強(qiáng)制表達(dá)后，在免疫組織科學(xué)的試驗中觀察未分化標(biāo)記的表達(dá)量的結(jié)果。
圖7A是考察使用miR-197siRNA和hsa-mir-520制作的iPS細(xì)胞中的各種基因的轉(zhuǎn)錄量的結(jié)果。
圖7B是通過兩步實時RT-qPCR (n=5)評價hiPSC和293FT細(xì)胞中的miRNA_197和hsa-mir-520d的、miRNA表達(dá)水平的相關(guān)性的結(jié)果。
圖8A是顯微鏡評價向293FT細(xì)胞中的has-mir_520d的病毒導(dǎo)入后出現(xiàn)的浮游細(xì)胞群落的結(jié)果。
圖8B是基于免疫細(xì)胞化學(xué)確認(rèn)520d-293FT的干性化轉(zhuǎn)換的結(jié)果。
圖8C是考察520d-293FT的GFP陽性和NANOG陽性狀態(tài)的結(jié)果。
圖9A是用RT-PCR考察細(xì)胞的p53、hTERT等的表達(dá)量的結(jié)果。
圖9B是通過免疫印跡考察細(xì)胞的p53、hTERT等的表達(dá)量的結(jié)果。
圖9C是考察細(xì)胞的miRNA的表達(dá)量的結(jié)果。
圖9D是考察has-mir-520d的過量表達(dá)時的細(xì)胞的miRNA的表達(dá)量的結(jié)果。
圖1OA是293FT、模擬-293FT、520d-293FT的細(xì)胞周期分析的結(jié)果。
圖1OB 是考察 293FT、模擬-293FT、520d-293FT 中的 DNMT1、HDAC, Sin3A、MBD3 的表達(dá)量比的結(jié)果。
圖1lA是考察520d-HLF的形態(tài)學(xué)的變化的結(jié)果。
圖1lB是考察520d-HLF中的各種mRNA的表達(dá)量比的結(jié)果。
圖1lC是考察模擬-HLF、520d-HLF的浸潤的性質(zhì)的結(jié)果。
圖1lD是通過免疫印跡考察HLF、模擬-HLF、520d-HLF中的各種蛋白質(zhì)的表達(dá)量的結(jié)果。
圖12A是模擬-HLF、520d-HLF的細(xì)胞周期分析的結(jié)果。圖12B是考察HLF、hiPSC、520d-HLF中的各種mRNA的表達(dá)量比的結(jié)果。
圖13是考察HLF、模擬-HLF、520d-HLF中的DNMTl、HDAC、Sin3A、MBD3的表達(dá)量比的結(jié)果。
圖14A是表示腫瘤形成的照片。
圖14B是表示白色結(jié)節(jié)的照片。
圖14C是表示向正常肝組織轉(zhuǎn)換的照片。
圖14D是表示腺瘤樣增生的照片。
圖14E是表示生成的畸胎瘤和肝組織的照片。
圖15是考察520d-HLF的分化的結(jié)果。
圖16是將520d-HLF進(jìn)行骨分化誘導(dǎo)的結(jié)果。
圖17是考察轉(zhuǎn)染has-mir-520d病毒的Huh7的形態(tài)學(xué)的變化等的結(jié)果。
圖18是考察轉(zhuǎn)染has-mir-520d病毒的T98G的形態(tài)學(xué)的變化等的結(jié)果。
圖19是考察轉(zhuǎn)染has-mir-520d病毒的PK-9的形態(tài)學(xué)的變化等的結(jié)果。
圖20是考察轉(zhuǎn)染has-mir-520d病毒的HT1080的形態(tài)學(xué)的變化等的結(jié)果。
圖21是在siRNA生成病毒轉(zhuǎn)染后的HMV-1中實施MTT試驗的結(jié)果。
圖22是在siRNA生成病毒轉(zhuǎn)染后的HMV-1的熒光顯微鏡照片和增殖曲線。
圖23是在siRNA生成病毒轉(zhuǎn)染后的HMV-1中實施群落形成試驗的結(jié)果。
具體實施方式以下，對本發(fā)明的實施方式詳細(xì)地進(jìn)行說明。需要說明的是，關(guān)于同樣的內(nèi)容，為了避免重復(fù)的煩雜，省略適當(dāng)說明。( I)包含序列號I的堿基序列的多核苷酸
本發(fā)明的一個實施方式為包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。該單鏈或多鏈的多核苷酸在下述實施例中啟示將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。因此，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。另外,該單鏈或多鏈的多核苷酸在下述實施例中啟示:促進(jìn)或抑制未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)、促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量或?qū)盒阅[瘤的抑制有效。因此，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。或者，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量。或者，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。在此，包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。或者，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量。或者，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的p53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥，其含有包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。在此，包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。或者，這些能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，這些能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘?，這些能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種SiRNA或miRNA，其含有包含序列號I的堿基序列的多核苷酸。在此，包含序列號I的堿基序列的多核苷酸所具有的效果，與上述包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果同樣。因此，該SiRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘撸搒iRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的p53的表達(dá)量?；蛘?該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種載體，其含有包含與序列號I的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。該載體能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)上述包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。因此，該載體能夠用于與上述包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸同樣的用途(多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑、治療藥等)。另外，該載體還可以包含與序列號4的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。該情況下，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)相對于包含序列號I的堿基序列的多核苷酸、能夠形成堿基對的多核苷酸。另外，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)含有包含序列號I的堿基序列的多核苷酸的siRNA、miRNA 或 shRNA。上述包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，還可以包含序列號4的堿基序列。該情況下，可以認(rèn)為上述包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸發(fā)揮的、RNAi或miRNA的作用效率上升?？梢哉J(rèn)為這是由于，通過序列號I的堿基序列與序列號4的堿基序列形成堿基對，容易引入到RISC中。另外，上述的單鏈或多鏈為單鏈的情況下，能夠得到shRNA的結(jié)構(gòu)。另外，包含序列號4的堿基序列的情況下，可以認(rèn)為使上述包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸更加穩(wěn)定。另外，可以認(rèn)為上述包含序列號I的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，即使包含由序列號I的堿基序列構(gòu)成的RNA鏈的互補(bǔ)鏈也得到同樣的效果。需要說明的是，包含序列號1、序列號2以及序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，可以分別含有下述實施例中記載的miR-47siRNA、miR-101siRNA、miR-197siRNA的引導(dǎo)鏈。這3個siRNA是相對于由RGM249mRNA生成的miRNA發(fā)揮RNAi而設(shè)計的，可以啟示在阻礙從RGM249mRNA開始的級聯(lián)的方面功能相通。因此，可以認(rèn)為如果將這3個siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，則發(fā)揮類似的效果。這可以認(rèn)為，關(guān)于包含序列號1、序列號2以及序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸也同樣，如果將這些多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，則發(fā)揮類似的效果。(2)包含序列號2的堿基序列的多核苷酸
其他的實施方式為包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。該單鏈或多鏈的多核苷酸在下述實施例中啟示將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。因此，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。另外,該單鏈或多鏈的多核苷酸在下述實施例中啟示促進(jìn)或抑制未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)、促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量或?qū)盒阅[瘤的抑制有效。因此，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘?，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。在此，包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的p53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥，其含有包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。在此，包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。或者，這些能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，這些能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量。或者，這些能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種siRNA或miRNA，其含有包含序列號2的堿基序列的多核苷酸。在此，包含序列號2的堿基序列的多核苷酸所具有的效果，與上述包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果相同。因此，該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?，該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的p53的表達(dá)量?；蛘?該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種載體，其含有包含與序列號2的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。該載體能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)上述包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。因此，該載 體能夠用于與上述包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸同樣的用途(多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑、治療藥等)。另外，該載體還可以包含與序列號5的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。該情況下，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)相對于包含序列號2的堿基序列的多核苷酸、能夠形成堿基對的多核苷酸。另外，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)含有包含序列號2的堿基序列的多核苷酸的siRNA、miRNA 或 shRNA。上述包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸還可以包含序列號5的堿基序列。該情況下，可以認(rèn)為上述包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所發(fā)揮的、RNAi或miRNA的作用效率上升?？梢哉J(rèn)為這是由于，通過序列號2的堿基序列與序列號5的堿基序列形成堿基對，容易引入到RISC中。另外，上述的單鏈或多鏈為單鏈的情況下，能夠得到shRNA的結(jié)構(gòu)。另外，包含序列號5的堿基序列的情況下，可以認(rèn)為使上述包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸更加穩(wěn)定。另外，可以認(rèn)為上述包含序列號2的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，即使包含由序列號2的堿基序列構(gòu)成的RNA鏈的互補(bǔ)鏈也得到同樣的效果。(3)包含序列號3的堿基序列的多核苷酸其他的實施方式為包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。該單鏈或多鏈的多核苷酸在下述實施例中啟示將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。因此，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。另外,該單鏈或多鏈的多核苷酸在下述實施例中啟示促進(jìn)或抑制未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)、促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量或?qū)盒阅[瘤的抑制有效。因此，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘撸搯捂溁蚨噫湹亩嗪塑账崮軌騼?yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。在此，包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘撸摱嗄芨杉?xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的p53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥，其含有包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。在此，包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?，這些能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。或者，這些能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘?，這些能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種siRNA或miRNA，其含有包含序列號3的堿基序列的多核苷酸。在此，包含序列號3 的堿基序列的多核苷酸所具有的效果，與上述包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果相同。因此，該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘撸搒iRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。或者，該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的p53的表達(dá)量?；蛘?該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種載體，其含有包含與序列號3的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。該載體能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)上述包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。因此，該載體能夠用于與上述包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸同樣的用途(多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑、治療藥等)。另外，該載體還可以包含與序列號6的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。該情況下，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)相對于包含序列號3的堿基序列的多核苷酸能夠形成堿基對的多核苷酸。另外，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)含有包含序列號3的堿基序列的多核苷酸的siRNA、miRNA 或 shRNA。上述包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸還可以包含序列號6的堿基序列。該情況下，可以認(rèn)為上述包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所發(fā)揮的、RNAi或miRNA的作用效率上升?？梢哉J(rèn)為這是由于，通過序列號3的堿基序列與序列號6的堿基序列形成堿基對，容易引入到RISC中。另外，上述單鏈或多鏈為單鏈的情況下，能夠得到shRNA的結(jié)構(gòu)。另外，包含序列號6的堿基序列的情況下，可以認(rèn)為使上述包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸更加穩(wěn)定。另外，可以認(rèn)為上述包含序列號3的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，即使包含由序列號3的堿基序列構(gòu)成的RNA鏈的互補(bǔ)鏈也得到同樣的效果。(4)與序列號7的堿基序列關(guān)聯(lián)的多核苷酸
其他的實施方式為一種單鏈或多鏈的多核苷酸，其包含相對于將包含序列號7的堿基序列的RNA鏈用RNA內(nèi)切酶III進(jìn)行處理而得到的RNA鏈互補(bǔ)的堿基序列(以下，也有時稱為“RNA內(nèi)切酶III處理(Dicer processing)后的互補(bǔ)的堿基序列”)。上述RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列包括下述實施例中記載的miR-47siRNA、miR-101siRNA、miR-197siRNA中的任意一種的引導(dǎo)鏈的堿基序列。弓I導(dǎo)鏈?zhǔn)强梢哉J(rèn)為賦予miR-47siRNA等的功能特征的部位。另外，該miR_47siRNA等在下述實施例中啟示將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)、促進(jìn)或抑制未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)、促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量或?qū)盒阅[瘤的抑制有效。因此，包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，可以認(rèn)為同樣地能夠?qū)⒓?xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)、促進(jìn)或抑制未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)、促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量或進(jìn)行惡性腫瘤的抑制。其他的實施方式為一·種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。在此，包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘撸摱嗄芨杉?xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的p53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥，其含有包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。在此，包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。或者，這些能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，這些能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘撸@些能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種siRNA或miRNA，其含有包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。在此，包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸所具有的效果，與上述包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果同樣。因此，該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘撸搒iRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的p53的表達(dá)量。或者,該siRNA或miRNA能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種載體，其含有包含與RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。該載體能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)上述包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。因此，該載體能夠用于與上述包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸同樣的用途(多能干細(xì)胞誘導(dǎo)齊L1、治療藥等)。另外，該載體還可以包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列。該情況下，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)相對于包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸、能夠形成堿基對的多核苷酸。另外，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)含有包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸的siRNA、miRNA或shRNA。上述包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，還可以包含由RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的RNA鏈的互補(bǔ)鏈。該情況下，可以認(rèn)為上述包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所發(fā)揮的、RNAi或miRNA的作用效率上升。可以認(rèn)為這是由于，通過RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列、與由RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的RNA鏈的互補(bǔ)鏈形成堿基對，容易引入到RISC中 。另外，上述單鏈或多鏈為單鏈的情況下，能夠得到shRNA的結(jié)構(gòu)。另夕卜，可以認(rèn)為在包含由RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的RNA鏈的互補(bǔ)鏈的情況下，使上述包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸更加穩(wěn)定。其他的實施方式為一種單鏈或雙鏈的多核苷酸，其相對于包含選自由序列號11、12以及13組成的組中的一種以上的堿基序列的RNA鏈、具有RNAi作用。包含該一種以上的堿基序列的RNA鏈在下述實施例中證實是將包含序列號7的堿基序列的RNA鏈用RNA內(nèi)切酶III進(jìn)行處理而得到的RNA鏈。因此，具有與上述包含RNA內(nèi)切酶III處理后的互補(bǔ)的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸同樣的作用效果，并且能夠用于同樣的用途。(5)包含序列號8的堿基序列的多核苷酸
其他的實施方式為包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。該單鏈或多鏈的多核苷酸在下述實施例中啟示，通過阻礙從RGM249mRNA開始的級聯(lián)，將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。因此，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。或者，能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量。另外，該單鏈或多鏈的多核苷酸在下述實施例中啟示對惡性腫瘤的抑制有效。因此，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，含有包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。在此，包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘撸摱嗄芨杉?xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量。或者，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的p53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥，其含有包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。在此，包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘撸@些能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘撸@些能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量。或者，這些能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種shRNA,含有包含序列號8的堿基序列的多核苷酸。在此，包含序列號8的堿基序列的多核苷酸所具有的效果，與上述包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果同樣。因此，該shRNA能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，該shRNA能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?該shRNA能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘?，該shRNA能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種載體，其含有包含與序列號8的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。該載體能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)上述包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。因此，該載體能夠用于與上述包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸同樣的用途(多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑、治療藥等)。另外，該載體還可以包含與序列號9的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。該情況下，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)相對于包含序列號8的堿基序列的多核苷酸、能夠形成堿基對的多核苷酸。另外，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)含有包含序列號8的堿基序列的多核苷酸的siRNA、miRNA、shRNA。上述包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，還可以包含序列號9的堿基序列。該情況下，可以認(rèn)為上述包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所發(fā)揮的、RNAi或miRNA的作用效率上升?？梢哉J(rèn)為這是由于，通過序列號8的堿基序列與序列號9的堿基序列形成堿基對，容易引入到RISC中。另外，上述單鏈或多鏈為單鏈的情況下，能夠得到shRNA的結(jié)構(gòu)。另外，可以認(rèn)為包含序列號9的堿基序列的情況下，使上述包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸更加穩(wěn)定。另外，可以認(rèn)為包含上述序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，即使包含由序列號8的堿基序列構(gòu)成的RNA鏈的互補(bǔ)鏈也得到同樣的效果。上述包含序列號8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，可以為包含序列號10的堿基序列的單鏈的多核苷酸。該情況下，能夠作為相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的shRNA優(yōu)選使用。(6)與序列號7的堿基序列關(guān)聯(lián)的多核苷酸
其他的實施方式為一種單鏈或雙鏈的多核苷酸，其相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用。該單鏈或多鏈的多核苷酸在下述實施例中啟示，通過阻礙從RGM249mRNA開始的級聯(lián)，將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。因此，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘撸搯捂溁蚨噫湹亩嗪塑账崮軌騼?yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量。另外，該單鏈或多鏈的多核苷酸在下述實施例中啟示對惡性腫瘤的抑制有效。因此，該單鏈或多鏈的多核苷酸能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。
其他的實施方式為一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的單鏈或雙鏈的多核苷酸，將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。在此，相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的單鏈或雙鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)?；蛘?，該多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘撸摱嗄芨杉?xì)胞誘導(dǎo)劑能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的p53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥，其含有相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的單鏈或雙鏈的多核苷酸。在此，相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的單鏈或雙鏈的多核苷酸所具有的效果如上所述。因此，該未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。或者，這些能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)?；蛘?，這些能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量。或者，這些能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種shRNA,其含有相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的多核苷酸。在此，相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的多核苷酸所具有的效果，與上述相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的單鏈或雙鏈的多核苷酸所具有的效果同樣。因此，該shRNA能夠優(yōu)選用于將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。或者，該shRNA能夠優(yōu)選用于調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。或者,該shRNA能夠優(yōu)選用于促進(jìn)多能干細(xì)胞的P53的表達(dá)量?；蛘?，該shRNA能夠優(yōu)選用于惡性腫瘤的治療。其他的實施方式為一種載體，其包含與將相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的多核苷酸進(jìn)行編碼的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。該載體能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)上述相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的多核苷酸。因此，該載體能夠用于與上述相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的多核苷酸同樣的用途(多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑、治療藥等)。另外，該載體還可以包含將相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的多核苷酸進(jìn)行編碼的堿基序列。該情況下，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)相對于相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的多核苷酸、能夠形成堿基對的多核苷酸。另外，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)含有相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的多核苷酸的siRNA、miRNA、shRNA。(7)與序列號41等的堿基序列關(guān)聯(lián)的多核苷酸
其他的實施方式為一種單鏈或多鏈的多核苷酸，其包含序列號41或44 47中的I個以上堿基序列。在下述實施例中啟示，該單鏈或多鏈的多核苷酸，能夠與如上所述的包含序列號1、2、3或8的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果發(fā)揮同樣的效果。因此，能夠用于多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑、未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)劑、惡性腫瘤的治療藥、siRNA (或miRNA)或者shRNA (或pre-miRNA)或載體的用途。需要說明的是，包含序列號41的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，還可以包含其互補(bǔ)鏈、或包含序列號42的堿基序列的多核苷酸。另外，包含序列號41的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，可以為包含序列號43的堿基序列的單鏈的多核苷酸。另外，包含序列號44 47的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，還可以包含其互補(bǔ)鏈、或分別包含序列號48 51的堿基序列的多核苷酸。另外，包含序列號44 47的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，可以為分別包含序列號52 55或者分別包含56 59的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。
其他的實施方式為一種載體，其含有包含與序列號41或44 47中的I個以上堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。該載體能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)上述包含序列號41或44 47中的I個以上堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸。因此，該載體能夠用于與包含序列號41或44 47中的I個以上堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸同樣的用途(多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑、治療藥等)。另外，該載體還可以包含與序列號42或48 51中的I個以上堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。該情況下，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)相對于包含序列號41或44 47中的I個以上堿基序列的多核苷酸、能夠形成堿基對的多核苷酸。另外，能夠優(yōu)選用于表達(dá)或生產(chǎn)含有包含序列號41或44 47中的I個以上堿基序列的多核苷酸的siRNA、miRNA、pre-miRNA或 shRNA。(8)導(dǎo)入實施方式相關(guān)的多核苷酸的細(xì)胞
其他的實施方式為導(dǎo)入上述任意一種單鏈或多鏈的多核苷酸或上述任意一種載體的細(xì)胞。該細(xì)胞誘導(dǎo)多能性，因此，能夠作為再生醫(yī)療等的醫(yī)療材料和研究材料優(yōu)選使用。另外，該細(xì)胞由于不具有外來性的c-Myc，而表達(dá)內(nèi)在性的p53，因此，惡性腫瘤化的風(fēng)險低。該P(yáng)53的表達(dá)量，例如，相對于hiPSC的HPS0002:253G1株的p53表達(dá)量為1、1.2,1.4,1.6,1.8,2.0,3.0,4.0,5.0U0U00或1000倍，但不限定于這些。另外，該表達(dá)量可以為在此例示的任意2個值的范圍內(nèi)。另外，p53的表達(dá)量的測定方法，從測定精度以及簡便性的方面出發(fā)，優(yōu)選為實時PCR。關(guān)于詳細(xì)的測定條件，可以使用下述實施例中的實時PCR的測定條件。(9)多能干 細(xì)胞及其生產(chǎn)方法
其他的實施方式為一種多能干細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其中，包括將上述任意一種單鏈或多鏈的多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞的步驟?；蛘?，一種多能干細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其中，包括將上述任意一種載體導(dǎo)入細(xì)胞的步驟。只要適當(dāng)?shù)厥褂迷摲椒?，則能夠生產(chǎn)多能干細(xì)胞。需要說明的是，多核苷酸或載體向細(xì)胞中的導(dǎo)入以及培養(yǎng)方法，可以根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法進(jìn)行。向細(xì)胞中的導(dǎo)入，例如，可以使用磷酸鈣法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、使用病毒(腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、HIV等)的方法或顯微注射等[改訂第4版新基因工程手冊，羊土社(2003):152-179.]。另外，利用耐藥性和細(xì)胞分選儀等，可以僅選擇導(dǎo)入的細(xì)胞。培養(yǎng)基例如可以使用靈長類ES細(xì)胞用培養(yǎng)基(COSMO BIO有限公司制)或通常的人細(xì)胞用的培養(yǎng)基(例如，DMEM或RPMI基質(zhì)的培養(yǎng)基)等。通常，在確立ES細(xì)胞時多數(shù)情況下與飼養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)，本實施方式的多能干細(xì)胞即使不存在飼養(yǎng)細(xì)胞也能夠確立。飼養(yǎng)細(xì)胞例如可以從歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(European Collection of Cell Cultures)獲得。另外，本實施方式的多能干細(xì)胞均能夠在選自由F-12HAM[DMEM (15mM HEPES+ImM丙酮酸鈉+吡哆醇+NaHC03+5mML-谷氨酰胺)]，RPM1-1640+L-谷氨酰胺，DMEM+高葡萄糖+L-谷氨酰胺+0.1mMNEAA以及REPROSTEM (REPROCell公司):bFGF3_10ng/ml組成的組中的一種以上的培養(yǎng)基*、37°C、5%C02、10%FBS的條件下培養(yǎng)。因此，也成功克服所謂的iPS細(xì)胞所具有的培養(yǎng)上的困難性。其他的實施方式為通過上述生產(chǎn)方法得到的多能干細(xì)胞?；蛘呤桥cHPS0002:253G1株相比內(nèi)在性的p53的表達(dá)量增大的多能干細(xì)胞?；蛘呤巧鲜鋈我庖环N單鏈或多鏈的多核苷酸的表達(dá)量增大的多能干細(xì)胞。這些細(xì)胞由于表達(dá)內(nèi)在性的P53，因此，惡性腫瘤化的風(fēng)險低。(10)與實施方式中的多核苷酸關(guān)聯(lián)的序列
在此，上述序列號I 10以及41 59的堿基序列只要為一定程度，則可以接受變異?？梢哉J(rèn)為包含具有這樣的變異的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，與包含野生型的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸具有同樣的效果。包含變異型的堿基序列的多核苷酸可以人工地制作，該情況下，也可以稱為包含改變型的堿基序列的多核苷酸。需要說明的是，在RNAi和miRNA等用途中使用的情況下，序列號4 6、9、42、48 51以及56 59的堿基序列的變異，即使比序列號I 3、8、41、44 47以及52 55的堿基序列的變異大，其功能也難以產(chǎn)生變動。這是由于，序列號I 3、8、41、44 47以及52 55的堿基序列是賦予RNAi和miRNA等的功能特征的重要的序列，另一方面，序列號4 6、9、42、48 51以及56 59的喊基序列為輔助的序列。另外，上述序列號I 10以及41 59的堿基序列也可以為各自的堿基序列的I個或者多個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列?？梢哉J(rèn)為包含這樣的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，與包含野生型的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸具有同樣的效果。在此，上述“ I個或者多個”優(yōu)選為10個以下，更優(yōu)選為5個以下，更優(yōu)選為4個以下，更優(yōu)選為3個以下，更優(yōu)選為2個以下，進(jìn)一步優(yōu)選為I個。這是由于，上述“I個或者多個”越少，具有越接近野生型的特性。需要說明的是，上述“加成”中包括插入的概念。另外，上述序列號I 10以及41 59的堿基序列，可以為相對于各自的堿基序列具有80%以上的相同性的堿基序列?？梢哉J(rèn)為包含這樣的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，與包含野生型的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸具有同樣的效果。在此，上述“80%以上”優(yōu)選為85%以上，更優(yōu)選為90%以上，更優(yōu)選為95%以上，更優(yōu)選為96%以上，更優(yōu)選為97%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上，最優(yōu)選為99%以上。這是由于，上述“80%以上”越大，具有越接近野生型的特性。

另外，上述序列號I 10以及41 59的堿基序列，可以是相對于由與各自的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸、在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行雜化的多核苷酸?？梢哉J(rèn)為包含這樣的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸，與包含野生型的堿基序列的單鏈或多鏈的多核苷酸具有同樣的效果。本說明書中，“相同性”是根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法計算2個或者多個之間的堿基序列的同一堿基數(shù)的比例而得到的。在計算比例前，排列進(jìn)行比較的堿基序列組的堿基序列，在需要使同一比例最大的情況下在堿基序列的一部分中引入間隙。另外，是指在最佳排列的狀態(tài)下同一堿基數(shù)相對于包括進(jìn)行重疊的堿基的全部堿基的比例。用于排列的方法、比例的計算方法以及與這些相關(guān)的計算機(jī)程序，在本技術(shù)領(lǐng)域中一直以來被熟知，可以使用一般的序列分析程序(例如，GENETYX、GeneChip序列分析等)進(jìn)行測定。本說明書中，“嚴(yán)格的條件”可以為如下條件，例如包括:(1)用于清洗的低離子強(qiáng)度和高溫度，例如在50°C下，使用0.015M的氯化鈉/0.0015M的檸檬酸鈉/0.1%的十二烷基硫酸鈉；(2)在雜化中使用甲酰胺等改性劑、例如在42°C下，使用50% (vol/vol)甲酰胺和0.1%牛血清白蛋白/0.1%聚蔗糖/0.1%聚乙烯基吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)以及750mM的氯化鈉、75mM檸檬酸鈉；或(3)在42°C下50%甲酰胺、5XSSC (0.75M的NaCl、0.075M的檸檬酸鈉)、50mM的磷酸鈉(pH6.8),0.1%的焦磷酸鈉、5 XDenhardt' s溶液、超聲波處理鮭魚精DNA (50 u g/ml)、0.1%SDS、以及10%的葡聚糖硫酸、和在42°C下在0.2 XSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)中的清洗，以及用55°C的甲酰胺、接著用55°C下的包含EDTA的0.1XSSC嚴(yán)格的清洗。另外，中等程度的嚴(yán)格的條件的例子為如下條件:在包含20%甲酰胺、5\53(3、501111磷酸鈉(pH7.6)>5 XDenhardt; s溶液、10%葡聚糖硫酸以及20mg/ml的變性剪切鮭魚精DNA的溶液中，在37°C下潛伏一夜，接著在I X SSC中37 50°C下進(jìn)行過濾器的清洗。需要說明的是，雜化反應(yīng)的嚴(yán)格性，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言能夠容易地確定，通常，依賴于探針長、清洗溫度以及鹽濃度。通常，長的探針為了進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐嘶鹦枰邷兀痰奶结樞枰蜏?。另外，通常，?yán)格性與鹽濃度成反比。通常已知，在基因工程和生命工程的領(lǐng)域，多核苷酸中的堿基即使發(fā)生一定程度的變異或缺失等，也保有與野生型同樣的功能。另外已知，關(guān)于2個多核苷酸之間的堿基的錯配，也允許一定程度。下述實施例中，實際上存在多核苷酸中的堿基的缺失和錯配。例如，即使在RGM249shRNA中缺失I個堿基，也觀察到惡性腫瘤抑制效果(圖1B、圖1D)。由此啟示:即使發(fā)生一定程度的缺失等，也保有與野生型同樣的功能。觀察miR-47siRNA的序列時，在引導(dǎo)鏈與過客鏈之間存在3個錯配(圖3B)。觀察miR-lOlsiRNA的序列時，在引導(dǎo)鏈與過客鏈之間存在I個錯配(圖3B)。在miR-47與miR_47siRNA的引導(dǎo)鏈之間存在3個錯配(圖3C)。由這些啟示:即使雙鏈具有一定程度錯配，也產(chǎn)生RNAi或miRNA的功能。(11)與實施方式中的多核苷酸關(guān)聯(lián)的其他特征
本說明書中，“多能干細(xì)胞”具有多能性，是能夠向各種細(xì)胞中分化的細(xì)胞。例如，在國際公開第 2007/069666 號、文獻(xiàn)[Hong et al., Nature.2009Aug27; 460 (7259): 1132-5.Epub2009Aug9.]中記載了生產(chǎn)方法和特性的例子。另外，多能干細(xì)胞只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員就能夠認(rèn)識，包括例如與作為人的人工多能干細(xì)胞的hiPSC (HPS0002253G1)相比將任意一種未分化標(biāo)記同程度或其以上進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞。本說明書中，“未分化細(xì)胞標(biāo)記”是由未分化的細(xì)胞特異性地表達(dá)的DNA鏈、RNA鏈或蛋白質(zhì)等化合物的總稱。例如，可以列舉:Klf4、c-Myc、0ct4、Sox2、PR0Ml、Nanog、SSEA_l、ALP、eRas、Esgl、Eca tl、Fgf4、Gdf3、REX-1等。也有時稱為多能干細(xì)胞標(biāo)記。本說明書中,“RNAi”是通過siRNA(短干擾 RNA ;short interfering RNA)或 shRNA(短發(fā)夾RNA ；short hairpin RNA)、短鏈或長鏈的單鏈或多鏈RNA等，抑制目標(biāo)基因和mRNA等的功能的現(xiàn)象。通常，該抑制是序列特異性的，在各種生物物種中存在。使用siRNA時的、典型的哺乳類中的RNAi的機(jī)理如下。首先，將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時，引起siRNA的單鏈化，之后，形成RISCXRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體；RNA-1nduced Silencing Complex)。RISC以引入的單鏈RNA作為引導(dǎo)分子，識別具有與該單鏈RNA互補(bǔ)性高的序列的目標(biāo)RNA鏈。目標(biāo)RNA鏈通過RISC內(nèi)的AG02，在siRNA的中心部分被切斷。之后，分解被切斷的目標(biāo)RNA鏈。以上為典型的機(jī)理，此外，以生物體內(nèi)的miRNA作為目標(biāo)進(jìn)行抑制的例子，在文獻(xiàn)[Kriitzfeldtet al.,Nucleic Acids Res.2007; 35 (9): 2885-92.Epub2007Aprl6.]中記載。需要說明的是，本說明書中，“具有RNAi作用的分子”為能夠引起RNAi作用的分子，例如，包括siRNA、shRNA 等。本說明書中，“siRNA”是引起RNAi的雙鏈的多核苷酸。通常，siRNA的雙鏈可以分為引導(dǎo)鏈和過客鏈(Passenger strand)，引導(dǎo)鏈引入到RISC中。引入到RISC中的引導(dǎo)鏈用于識別目標(biāo)RNA。在RNAi研究中主要使用人工制作的RNAi，也已知在生物體內(nèi)內(nèi)在地存在的RNAi。本說明書中，“miRNA (microRNA)”是具有與siRNA類似的功能的多核苷酸，已知進(jìn)行目標(biāo)RNA鏈的翻譯抑制或分解。pre-miRNA是miRNA的前體。miRNA與siRNA的差別，通常在于生成途徑和詳細(xì)的機(jī)理。在生物體內(nèi)的miRNA的典型的生成途徑如下。首先，從miRNA基因作為長的pr1-RNA (primary miRNA)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。該pri_miRNA中，包括之后成為miRNA的序列，該部分采用發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Drosha切斷該發(fā)夾結(jié)構(gòu)的根本。切割出的發(fā)夾被稱為pre-miRNA。該pre-miRNA通過Exportin_5搬運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。接著,在細(xì)胞質(zhì)中，通過RNA內(nèi)切酶III切斷pre-miRNA，實現(xiàn)雙鏈的miRNA，其進(jìn)一步單鏈化，形成RISC。該單鏈RNA作為引導(dǎo)分子起作用，識別目標(biāo)RNA鏈，進(jìn)行切斷或翻譯抑制。以上為典型的miRNA的生成途徑。需要說明的是，本說明書中，“具有miRNA作用的分子”是能夠引起miRNA作用的分子，例如，包括 miRNA、pre-miRNA> pr1-miRNA 等。本說明書中，“shRNA”是能夠形成折疊成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)(發(fā)夾狀結(jié)構(gòu))的單鏈的多核苷酸，具有誘導(dǎo)RNAi的功能。形成與pre-miRNA類似的結(jié)構(gòu)，通常在細(xì)胞內(nèi)通過RNA內(nèi)切酶III被切斷，切掉siRNA。已知通過該siRNA發(fā)生目標(biāo)RNA的切斷。本說明書中，“小RNA”是指比較小的RNA，例如，可以列舉:siRNA、miRNA、shRNA、pre-miRNA、單鏈或多鏈的低分子RNA等，但不 限定于這些。堿基數(shù)例如為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90或100個堿基，但不限定于這些。另外，該堿基數(shù)可以是在此例示的任意2個值的范圍內(nèi)。本說明書中，“RNA內(nèi)切酶III(Dicer)”包括具有切斷siRNA和miRNA等的前體、并且切掉siRNA和miRNA等的功能的酶。例如，能夠?qū)sRNA向siRNA引導(dǎo)，將pre-miRNA向miRNA引導(dǎo)，將shRNA向siRNA引導(dǎo)。另外已知，RNA內(nèi)切酶III具有上述以外的幾個功能。上述單鏈或多鏈可以為單鏈或雙鏈。該情況下，能夠利用siRNA、miRNA、shRNA或反義RNA的機(jī)理。上述單鏈或多鏈的多核苷酸可以分別使用任意一種，也可以并用二種以上。這樣的情況下，能夠作為多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑、未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑、多能干細(xì)胞的P53表達(dá)促進(jìn)劑或惡性腫瘤的治療藥優(yōu)選使用。需要說明的是，并用二種以上時的并用比例沒有特別限定。上述單鏈或多鏈的多核苷酸可以具有RNAi作用。該情況下，通過RNAi作用能夠分解作為目標(biāo)的RNA鏈。上述單鏈或多鏈的多核苷酸可以為小RNA。該情況下，產(chǎn)生干擾素應(yīng)答等不利的現(xiàn)象的風(fēng)險低。干擾素應(yīng)答，通常作為細(xì)胞通過感知雙鏈RNA (dsRNA)而達(dá)到抗病毒狀態(tài)的現(xiàn)象已知。報道有:在將長鏈的dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞中的情況下，dsRNA應(yīng)答性蛋白激酶(PKR)發(fā)生活性化，誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)(Gil et al.,Apoptosis.2000Apr; 5 (2):107-14.)。其結(jié)果，誘導(dǎo)非特異的基因表達(dá)的抑制和凋亡。上述單鏈或多鏈的多核苷酸，例如為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100,200或500個核苷酸，但不限定于這些。該數(shù)可以是在此例示的任
意2個值的范圍內(nèi)。該數(shù)如果為15以上，則相對于目標(biāo)的多核苷酸能夠精度更高地鍵合的可能性提高。另外，該數(shù)如果為100以下，則產(chǎn)生干擾素應(yīng)答等不利的現(xiàn)象的風(fēng)險降低?？梢哉J(rèn)為核苷酸數(shù)越少，該現(xiàn)象越難以發(fā)生。
上述單鏈或多鏈的多核苷酸為單鏈的情況下，可以為shRNA，雙鏈的情況下，可以為siRNA。該情況下，通過RNAi作用能夠分解目標(biāo)RNA鏈。另外，由于形成堿基對，因此，容易引入到 RISC 中，有效地產(chǎn)生 RNAi(Martinez et al., Cell.2002 Sep 6; 110(5):563-74.)D另外，雙鏈的情況下，也可以為miRNA。該情況下，通過miRNA作用能夠抑制目標(biāo)RNA鏈。另外，也可以為單鏈中不具有shRNA這樣的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的情況。文獻(xiàn)[Hohjoh et al.，F(xiàn)EBSLett.2002 Jun 19; 521 (1_3): 195-9.]中記載了，通過這樣的結(jié)構(gòu)也發(fā)揮目標(biāo)RNA鏈的表達(dá)抑制。另外，上述shRNA可以由35個以上的核苷酸構(gòu)成。如果為35以上，則在shRNA中能夠精度良好地形成特有的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的可能性提高。另外，上述shRNA可以由100以下的核苷酸構(gòu)成。如果為100以下，則產(chǎn)生干擾素應(yīng)答等不利的現(xiàn)象的風(fēng)險降低。但是，通常，結(jié)構(gòu)以及功能與shRNA類似的pre-miRNA中的大多數(shù)具有約100個核苷酸或其以上的長度，可以認(rèn)為shRNA的長度不一定為100個核苷酸以下，也能夠作為shRNA發(fā)揮作用。另外，文獻(xiàn)[Lin et al., RNA.20080ct; 14 (10):2115-24.Epub 2008 Aug 28.]中啟示:人工地鍵合4個pre-miRNA的大分子也能夠發(fā)揮作用。因此，該數(shù)只要能夠作為shRNA發(fā)揮作用，則沒有限定，例如為 35、36、37、38、39、40、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200 或500個核苷酸。另外，該數(shù)可以是在此例示的任意2個值的范圍內(nèi)。另外，由于同樣的理由，pre-miRNA也可以具有與shRNA同程度的數(shù)的核苷酸。另外，上述siRNA或miRNA的引導(dǎo)鏈可以由15以上的核苷酸構(gòu)成。如果為15以上，則能夠相對于 目標(biāo)的多核苷酸精度良好地鍵合的可能性提高。另外，這些引導(dǎo)鏈可以由40以下的核苷酸構(gòu)成。如果為40以下，則產(chǎn)生干擾素應(yīng)答等不利的現(xiàn)象的風(fēng)險降低。該數(shù)例如為 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35 或 40 個核苷酸，但不限定于這些。另外，該數(shù)可以是在此例示的任意2個值的范圍內(nèi)。上述單鏈或多鏈的多核苷酸、shRNA、siRNA、miRNA以及pre-miRNA，可以包含由I 5核苷酸構(gòu)成的突出端(overhang)。該情況下,可以認(rèn)為RNAi的效率上升。該數(shù)例如為5、4、3、2或I核苷酸，但不限定于這些。另外，該數(shù)可以是在此例示的任意2個值的范圍內(nèi)。作為上述載體，可以使用來自大腸菌的質(zhì)粒(例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)，來自枯草桿菌的質(zhì)粒(例如PUB110、pTP5、pC194)，來自酵母的質(zhì)粒(例如pSH19、pSH15)，A噬菌體等噬菌體，來自HIV、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒、桿狀病毒等病毒的載體，pAl-11、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo、pSUPER (OligoEngine 公司)、BLOCK-1tInducible Hl RNAi Entry Vector (Invitrogen 公司)、pRNATin-Hl.4/Lenti (GenScript公司，美國新澤西州)等。上述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，可以具有將體細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的功能。該情況下，能夠由體細(xì)胞制作多能干細(xì)胞。本說明書中“體細(xì)胞”為不包括生殖細(xì)胞的其他細(xì)胞，包括來自皮膚的細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。體細(xì)胞通常多能性被限定或消失。本說明書中，“多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑”是具有使細(xì)胞接近多能干細(xì)胞這樣的具有多能性的細(xì)胞的作用的物質(zhì)。本說明書中，“重排”是使細(xì)胞接近多能干細(xì)胞這樣的具有多能性的細(xì)胞的作用。上述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，可以為將惡性腫瘤細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的誘導(dǎo)劑。該情況下，能夠由惡性腫瘤細(xì)胞制作多能干細(xì)胞。本說明書中，“惡性腫瘤”包括通過正常的細(xì)胞突然引起變異、繼續(xù)增殖而引起的疾病。另外包括惡性腫瘤、肉瘤。已知惡性腫瘤從全身所有的臟器和組織產(chǎn)生，并且惡性腫瘤細(xì)胞增殖時，發(fā)生結(jié)塊，侵入周圍的正常的組織并破壞。癌包括例如肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰癌、腎癌、腎上腺癌、膽管癌、乳腺癌、大腸癌、小腸癌、子宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、腎盂癌、陰莖癌、睪丸癌、腦癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癌、末梢神經(jīng)系統(tǒng)的癌、頭頸部癌(口腔癌、咽癌、喉癌、鼻腔/鼻竇癌、唾液腺癌、甲狀腺癌等)、膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、皮膚癌、黑素瘤、甲狀腺癌、唾液腺癌、血液癌或惡性淋巴瘤等。上述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，可以為將選自由肝癌、胰癌、纖維肉瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑素瘤組成的組中的一種以上的惡性腫瘤的細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的誘導(dǎo)劑。該情況下，能夠由這些惡性腫瘤細(xì)胞制作多能干細(xì)胞。至今幾乎還沒有報道將惡性腫瘤細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)，可以期待作為新的革新性的惡性腫瘤的治療方法。上述多能干細(xì)胞可以表達(dá)內(nèi)在性的p53。該情況下，可以認(rèn)為難以發(fā)生惡性腫瘤化。需要說明的是，P53的表達(dá)量，優(yōu)選與對照試樣(例如，p53基因敲除細(xì)胞、正常細(xì)胞或來自這些的試樣等)相比顯著地高表達(dá)。說明書中，“顯著地”，例如使用t檢驗(Student' st test)評價對照組與被檢組之間的統(tǒng)計學(xué)的顯著差別，包括p〈0.05。本說明書中，“對照組”是置于與被檢組不同的條件下的試樣，本技術(shù)領(lǐng)域中，可以用通常使用的范圍內(nèi)的概念表不。p53通常是分類為惡性腫瘤抑制基因的基因，在DNA發(fā)生損傷時被活性化，已知誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的停止和損傷的修復(fù)的功能。另一方面，報道了使P53進(jìn)行基因敲除和基因敲落時，iPS細(xì)胞的制作效率上升(Zhao et al., Cell Stem Cell.2008 Nov 6; 3 (5):475-9.,Hong et al.,Nature.2009Aug27; 460 (7259):1132-5.Epub 2009 Aug 9.)。這些表示:利用P53的惡性腫瘤抑制和iPS細(xì)胞制作的效率化處于折衷的關(guān)系。另外，報道了缺損p53的ES細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定，和相對于分化誘導(dǎo)具有抵抗性(Lin et al., Nat Cell Biol.2005Feb; 7 (2):165-71.Epub 2004 Dec 26.)。這是指，在分化誘導(dǎo)后殘存未分化細(xì)胞的可能性高。因此，可以認(rèn)為在再生醫(yī)療中，在移植缺損p53的細(xì)胞時，惡性腫瘤形成的風(fēng)險提高。因此，由該方面可知，p53對于細(xì)胞而言是重要的分子。本說明書中，“內(nèi)在性”表示被檢物質(zhì)來自于細(xì)胞的內(nèi)部的機(jī)理而存在。例如，在細(xì)胞內(nèi)正常地表達(dá)的蛋白質(zhì)，只限于該表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括在內(nèi)在性中。上述未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑中，未分化細(xì)胞標(biāo)記可以為選自由Klf4、c-Myc、0ct4、Sox2、PR0Ml組成的組中的一種以上的未分化細(xì)胞標(biāo)記。未分化細(xì)胞標(biāo)記和各種蛋白質(zhì)，可以使用 RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，Reverse Transcription Polymerase ChainReaction)等公知的方法檢測。RT-PCR是將RNA鏈在鑄模中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，相對于所生成的cDNA進(jìn)行PCR的方法。需要說明的是，總RNA可以從細(xì)胞中使用硫氰酸胍法、市售的試藥或試劑盒進(jìn)行提取。細(xì)胞可 以從Invitrogen公司、三光純藥株式會社、Takara Bio公司等購入。另外，未分化細(xì)胞標(biāo)記和各種蛋白質(zhì)也可以與實時PCR組合進(jìn)行檢測。這樣的方法被稱為實時RT-PCR。實時PCR是通過PCR實時監(jiān)測增寬的核酸的方法。例如，可以根據(jù)文獻(xiàn)[由原理熟知的實時PCR實驗指導(dǎo)，羊土社，2007/12]中記載的順序進(jìn)行。作為上述監(jiān)測的方法，可以列舉:嵌入法、雜化法、LUX (Light Upon eXtenson)法等。嵌入法的典型的方法為如下方法:SYBR Green I等突光物質(zhì)進(jìn)入雙鏈的核酸,利用通過激發(fā)光的照射進(jìn)行發(fā)光的特性，測定核酸量。由于熒光的強(qiáng)度與核酸的量成比例地增強(qiáng)，因此，通過測定熒光強(qiáng)度，可以得到核酸的增寬的量。另外，在使用實時PCR的定量方法中，大致分為絕對定量法和相對定量法這兩種定量方法，可以適當(dāng)使用這些方法。本說明書中，“表達(dá)調(diào)節(jié)劑”包括能夠使目標(biāo)蛋白質(zhì)或mRNA的表達(dá)量增加或減少的物質(zhì)。在此，增加或減少的量，與對照細(xì)胞相比，優(yōu)選具有顯著差別。上述惡性腫瘤的治療藥，還可以包含DDS (藥物傳遞系統(tǒng)；Drug DeliverySystem)。該情況下，可以將多核苷酸有效地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。作為DDS，包括明膠水凝膠或缺端膠原。本說明書中，“明膠水凝膠”為以明膠作為原料的水凝膠，可以作為DDS使用。明膠水凝膠的生物體適合性、生物體吸收性優(yōu)良。本說明書中，“缺端膠原”是以缺端膠原作為原料的DDS。向細(xì)胞中的導(dǎo)入效率和安全性優(yōu)良。缺端膠原通常是將膠原蛋白中包含的端肽進(jìn)行酶分解而得到的，因此，難以誘發(fā)免疫反應(yīng)。上述惡性腫瘤的治療藥中，惡性腫瘤可以為選自由肝癌、肺癌、胰癌、纖維肉瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑素瘤組成的組中的一種以上的惡性腫瘤。該情況下，能夠治療這些惡性腫瘤。特別是這些惡性腫瘤均沒有革新的治療方法，因此，上述惡性腫瘤的治療藥為有前途的治療藥。本說明書中，“肝 癌”包括通過肝臟的細(xì)胞繼續(xù)增殖而引起的疾病。能夠生成肝癌的肝細(xì)胞包括膽管、門靜脈這樣的血管的細(xì)胞、樹狀細(xì)胞或肝細(xì)胞。另外，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌。已知原發(fā)性肝癌大多數(shù)為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma)。本說明書中，“肺癌”包括在氣管、支氣管、肺胞的上皮細(xì)胞等中產(chǎn)生的惡性腫瘤，在病理學(xué)上，可以分類成腺癌、扁平上皮癌、大細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌。關(guān)于進(jìn)展形式和治療反應(yīng)性等，小細(xì)胞癌與其他癌不同，因此，腺癌、扁平上皮癌以及大細(xì)胞癌總稱為非小細(xì)胞癌。也有良性腫瘤和圓柱種等小細(xì)胞癌以及非小細(xì)胞癌中不包括的少數(shù)的腫瘤。本說明書中，“胰癌”包括從胰臟中產(chǎn)生的惡性腫瘤。胰臟由產(chǎn)生胰液的腺泡、運(yùn)輸胰液的胰管以及作為內(nèi)分泌腺的胰腺胰島等構(gòu)成。癌從任意一種組織中均能夠產(chǎn)生。例如，可以列舉:浸潤性胰管癌、胰內(nèi)分泌腫瘤、胰管內(nèi)乳頭粘液性腫瘤、粘液性囊性腫瘤、腺泡細(xì)胞癌、漿液性囊性腺癌等。本說明書中，“肉瘤”包括在來自骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管等的非上皮性細(xì)胞的結(jié)合組織細(xì)胞中產(chǎn)生的惡性腫瘤。例如，可以列舉:纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、皮膚纖維肉瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、泡狀軟部肉瘤、骨外性軟骨肉瘤、骨外性骨肉瘤、惡性末梢神經(jīng)鞘腫瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、顆粒球肉瘤、尤因肉瘤、骨原發(fā)的纖維肉瘤、惡性骨巨細(xì)胞腫瘤、骨原發(fā)的脂肪肉瘤、骨原發(fā)的血管肉瘤等。本說明書中，“膠質(zhì)瘤”包括從神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上產(chǎn)生的惡性腫瘤。例如，可以列舉:星狀膠質(zhì)細(xì)胞類腫瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤(oligodendroglial tumor)、上皮性腫瘤、脈絡(luò)叢腫瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤等。本說明書中，“黑素瘤”包括來自在皮膚、眼窩內(nèi)組織、口腔粘膜上皮等上產(chǎn)生的黑素細(xì)胞的惡性腫瘤。例如，可以列舉:惡性雀斑樣痣黑素瘤、淺表擴(kuò)散性黑素瘤、結(jié)節(jié)型黑素瘤、末端雀斑樣痣黑素瘤等。說明書中，“多核苷酸”包括由核苷酸或者堿基、或它們的等價物多個鍵合的形態(tài)構(gòu)成的物質(zhì)。核苷酸以及堿基包括DNA堿基或RNA堿基。上述等價物例如包括:DNA堿基或RNA堿基接受甲基化等化學(xué)修飾的物質(zhì)、或核苷酸類似物。核苷酸類似物包括非天然的核苷酸?！癉NA鏈”表示DNA堿基或它們的等價物2個以上連結(jié)的形態(tài)?！癛NA鏈”表示RNA堿基或它們的等價物2個以上連結(jié)的形態(tài)?！皦A基序列”是構(gòu)成多核苷酸的核苷酸或其等價物的序列。通常，堿基序列能夠通過A (腺嘌呤)、G (鳥嘌呤)、C (胞嘧啶)、T (胸腺嘧啶)表示。另外，T與U (尿嘧啶)可以根據(jù)用途，互相交替讀取。例如，在作為代表的數(shù)據(jù)庫的NCBI參考序列(Reference Sequence)中，表示DNA鏈以及RNA鏈的堿基序列時使用A、G、C、T。需要說明的是，多核苷酸可以使用DNA/RNA合成裝置合成。此外，也可以從DNA堿基或RNA堿基合成的受托會社(例如，Invitrogen公司、Takara Bio公司等)購入。另外，siRNA、miRNA、shRNA、pre-miRNA或?qū)⑦@些進(jìn)行編碼的載體的合成也能夠委托各制造商。在這樣的siRNA等的設(shè)計中，可以使用Stealth RNAi designer (Invitrogen公司)和 siDirect2.CKNaito et al., BMC Bioinformatics.2009 Nov 30; 10:392.)等。RNAi作用或miRNA作用的確認(rèn)，可以通過利用實時RT-PCR的RNA鏈表達(dá)量的定量進(jìn)行。或者，可以通過利用印跡雜交的RNA鏈表達(dá)量的分析、和利用蛋白質(zhì)印跡的蛋白量的分析、表達(dá)型的觀察等方法進(jìn)行。利用實時RT-PCR的方法特別有效。本說明書中，“互補(bǔ)鏈”是相對于I個多核苷酸、能夠進(jìn)行雜化的互補(bǔ)性高的其他多核苷酸。本說明書中，“雜化”是指在多個多核苷酸之間，通過堿基間的氫鍵等能夠形成堿基對的性質(zhì)。堿基對能夠以Watson-Crick型堿基對、Hoogsteen型堿基對或任意的其他序列特異的形式產(chǎn)生。2個單鏈雜化的狀態(tài)被稱為雙鏈。另外，“互補(bǔ)的”包括:例如相對于I個多核苷酸、在T與A對應(yīng)、C與G對應(yīng)的形式下其他多核苷酸能夠發(fā)生雜化的形態(tài)。本說明書中，“治療”是指能夠發(fā)揮被檢者的疾病或伴隨疾病的I個以上癥狀的、預(yù)防或癥狀改善效果。本說明書中，“被檢者”包括`人或者其他哺乳動物(例如，小鼠、小鼠、兔子、牛、猴子、猩猩、豬、馬、綿羊、山羊、狗、貓、土撥小鼠、倉小鼠等)。優(yōu)選為小鼠、小鼠、猴子、猩猩或人，特別優(yōu)選為人。這是由于，如果是人，則能夠在人的疾病的治療、人用的治療藥或診斷藥的開發(fā)等中利用上述單鏈或多鏈的多核苷酸。另外，小鼠、小鼠、猴子以及猩猩作為世界上研究用的模型動物廣泛使用，已經(jīng)明確多種特性，因此，對于這些生物，通過考察上述單鏈或多鏈的多核苷酸的藥效藥理，得到用于開發(fā)更優(yōu)良的治療藥等特別有用的信息。另外，在使用上述單鏈或多鏈的多核苷酸作為治療藥的情況下，也可以單獨(dú)給藥，但通常與DDS或藥理學(xué)上可接受的I個或其以上的載體一起混合，優(yōu)選作為通過在制劑學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域中熟知的任意的方法制造的醫(yī)藥制劑提供。另外，也可以不直接使用上述單鏈或多鏈的多核苷酸，將上述單鏈或多鏈的多核苷酸的前體給藥。另外，將上述單鏈或多鏈的多核苷酸向生物體給藥時的給藥途徑，優(yōu)選使用治療時最有效的給藥途徑，可以列舉:口服給藥或口腔內(nèi)、呼吸道內(nèi)、直腸內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、眼內(nèi)或靜脈內(nèi)等非口服給藥，可以全身或局部地給藥。給藥途徑可以優(yōu)選非口服給藥。也可以如下述實施例所示為皮下或靜脈內(nèi)給藥。該情況下，單鏈或多鏈的多核苷酸到達(dá)患部的效率高。作為其他給藥形態(tài)，可以列舉:膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、軟膏、膠帶劑等。作為適于□服給藥的制劑，可以列舉:乳劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等。乳劑以及糖漿劑這樣的液體制備物，可以使用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等糖類、聚乙二醇、丙二醇等二醇類、芝麻油、橄欖油、大豆油等油類、對羥基苯甲酸酯類等防腐劑、草莓香料、薄荷香料等香料類等作為添加劑制造。另外，膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等賦形劑、淀粉、藻酸鈉等崩解劑、硬脂酸鎂、滑石粉等潤滑劑、聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等粘合劑、脂肪酸酯等表面活性劑、甘油等增塑劑等作為添加劑制造。作為適于非口服給藥的制劑，可以列舉:注射劑、栓劑、噴霧劑等。作為注射用的水溶液，例如可以列舉:包含生理鹽水、葡萄糖和其他輔助藥、例如含有D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉等的張液，也可以與適當(dāng)?shù)娜芙庵鷦⒗绱?、具體而言乙醇、多元醇、例如丙二醇、聚乙二醇、非離子性表面活性劑、例如聚山梨醇酯80 (TM)、HC0-50并用。栓劑可以使用可可脂、氫化脂肪或碳酸等載體制備。另外，噴霧劑可以使用如下載體等來制備，所述載體，使含有上述單鏈或多鏈的多核苷酸的任意一種藥劑、或者不刺激接受者的口腔以及呼吸道粘膜、并且含有上述單鏈或多鏈的多核苷酸的任意一種藥劑作為微細(xì)的粒子分散，從而使吸收變?nèi)菀住Ｗ鳛樵撦d體，具體而言可以例示乳糖、甘油等。根據(jù)含有上述單鏈或多鏈的多核苷酸的任意一種藥劑、和所使用的載體的性質(zhì)，能夠?qū)崿F(xiàn)進(jìn)行氣溶膠、干粉等的制劑化。另外，這些非口服劑中，也可以添加在口服劑中作為添加劑例示的成分。另外，上述治療藥或預(yù)防藥，可以與緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖液)、無痛化劑(例如，氯化芐烷銨、鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(例如，芐基醇、苯酚等)、抗氧化劑等配合。制備的注射液通常填充到適當(dāng)?shù)陌碴持小＿@樣得到的制劑安全且低毒性，因此，例如，可以向人和哺乳動物(例如，小鼠、小鼠、兔子、羊、豬、牛、貓、狗、猴子等)給藥。另外，給藥方法可以根據(jù)被檢者的年齡、癥狀、對象臟器等適當(dāng)選擇。作為包含含有上述單鏈或多鏈的多核苷酸的任意一種藥劑的醫(yī)藥組合物的給藥量，例如，可以體重每Ikg每次在0.000Img至IOOOmg的范圍內(nèi)選擇?；蛘撸?，可以每個被檢者在0.001 100000mg/body的范圍內(nèi)選擇給藥量,但并不一定限于這些數(shù)值。體重每Ikg的給藥量例如為0.0001,0.01、1、50、100、250、500或IOOOmgo該給藥量可以是在此例示的任意2個值的范圍內(nèi)。給藥量根據(jù)目標(biāo)治 療效果、給藥方法、治療期間、年齡、體重等而不同。給藥量、給藥方法根據(jù)被檢者的體重和年齡、癥狀等發(fā)生變動，但只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，則能夠適當(dāng)選擇。另外，也可以通過與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)療法藥并用進(jìn)行給藥。上述單鏈或多鏈的多核苷酸，通過抑制惡性細(xì)胞等效果，在畜產(chǎn)中也能夠在用于輔助動物的生長的添加劑等中使用。另外，本發(fā)明的其他的實施方式為一種試藥或試劑盒，其含有上述單鏈或多鏈的多核苷酸。該試藥或試劑盒，通過上述單鏈或多鏈的多核苷酸所具有的效果，可以作為研究用的試藥或者試劑盒或醫(yī)療用的試劑盒使用。例如，可以作為iPS細(xì)胞制作用、人工臟器制作用、惡性腫瘤細(xì)胞抑制用、未分化標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)用或P53表達(dá)細(xì)胞制作用的添加物、輔助物質(zhì)使用。另外，在試劑盒中可以包含:記載使用上述單鏈或多鏈的多核苷酸時的使用方法或者使用例的指南、記載該指南的所在的文字或各種緩沖液。以上，闡述了本發(fā)明的實施方式，但這些為本發(fā)明的例示，也可以采用上述以外的各種構(gòu)成。另外，也可以組合采用上述實施方式中記載的構(gòu)成。實施例以下，通過實施例對本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行說明，但本發(fā)明不限定于這些。<實施例1:RGM249shRNA向小鼠的給藥、和抗癌作用的評價>
(1-1) RGM249shRNA 的制作
根據(jù) Stealth RNAi designer (Invitrogen,美國加州)，設(shè)計 RGM249shRNA 的序列，使用 BLOCK-1t Inducible HlRNAi Entry Vector (Invitrogen,美國加州)，制作生成RGM249shRNA的載體(RGM249shRNA質(zhì)粒)。該RGM249shRNA是以在生物體內(nèi)誘導(dǎo)針對RGM249mRNA的RNAi的方式進(jìn)行設(shè)計的小RNA。在此，RGM249mRNA的堿基序列為
5’ -GGAAAACUAAAAUGAGAGAAUGGGUGUCCAAGAGGACAAGUUCAUGCUCACCCGGUGAUGAGAGUUUGAUUGCAGAAUAAGGCUAGACAAAGGGAAGCUGAACAUGACCAAAGCCAU⑶GACAUCGUAUGAUCCUCGAAUCUCACAGUAUCUAUGUAUCUAUAAUCAGAUACAUCCCUAGACUUUCCAGGAAUUCUGGUACUUCACGAGGAU⑶GAGAAGACUCUGAACAAAAUAAUACACUGCUCGUG-3’(序列號 7)。在 RGM249shRNA 質(zhì)粒內(nèi)的上鏈中，將RGM249shRNA 進(jìn)行編碼的序列為 5’ -CACCGCAGAATAAGGCTAGACAAAGCGAACTTTGTCTAGCCTTATTCTGC-3’(序列號11)。在下鏈中，與上述上鏈形成雙鏈的序列為5’-AAAAGCAGAATAAGGCTAGACAAAGITCGCITTGTCTAGCCTTAITCTGC-3’(序列號 12)。圖1A 中示出了 RGM249mRNA 的二級結(jié)構(gòu)、和RGM249shRNA的靶部位。RGM249shRNA的堿基序列為
5， -GCAGAAUAAGGCUAGACAAAGUUCGCUUUGUCUAGCCUUAUUCUGCGGUG-3’ (序列號10)?？梢哉J(rèn)為從質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)(圖1B)。圖中的下劃線部為能夠形成氫鍵的部分。在RGM249shRNA的堿基序列中，與RGM249mRNA的一部分互補(bǔ)的序列為5，-CUUUGUCUAGCCUUAUUCUGC-3，(序列號8 )?？梢哉J(rèn)為與該序列號8相當(dāng)?shù)牟糠?，與RGM249shRNA的堿基序列中的5’ -GCAGAAUAAGGCUAGACAAAG-3’(序列號9)形成氫鍵，形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)?？梢哉J(rèn)為在通過RGM249shRNA誘導(dǎo)RNAi時，與該序列號8相當(dāng)?shù)牟糠窒鄬τ赗GM249mRNA發(fā)生雜化。UUCG與環(huán)部分相當(dāng)?？梢哉J(rèn)為GGUG成為突出端。另外，制作表達(dá)RGM249shRNA的胸腺嘧啶中的I個缺損的RGM249m_lshRNA的載體(RGM249m-lshRNA 質(zhì)粒)。在 RGM249m_lshRNA 質(zhì)粒內(nèi)的上鏈中，對 RGM249m_lshRNA 進(jìn)行編碼的序列為
5’ -CACCGCAGAATAAGGCTAGACAAAGCGAACITTGTCAGCCTTAITCTGC-3’(序列號 13)。下鏈中，與上述上鏈形成雙鏈的序列為 5 ’ -AAAAGCAGAATAAGGCTGACAAAGTTCGCTTTGTCTAGCCTTATTCTGC-3，(序列號14)。對照中使用LacZ shRNA。RGM249m-1 shRNA 的堿基序列為 5 ’ -GCAGAAUAAGGCUGACAAAGUUCGCUUUGUCUAGCCUUAUUCUGCGGUG-3’(序列號15)。序列號15的堿基序列與序列號10的堿基序列的不同點(diǎn)在于，從序列號10的5末端開始第14個A缺失。與RGM249mRNA —部分互補(bǔ)的序列，與上述RGM249shRNA的情況相同。(1-2) RGM249shRNA 的腫瘤抑制效果
在胸腺缺損小鼠的右側(cè)腹部，通過皮下注射接種HLF細(xì)胞。另外，在該小鼠的右側(cè)腹部，每 5 日皮下注射 RGM249shRNA 質(zhì)粒 +DDS、RGM249m_lshRNA 質(zhì)粒 +DDS 或 LacZ shRNA 質(zhì)粒+DDS。在DDS每1mg中混合數(shù)μg 數(shù)十μg的生理活性物質(zhì)，對小鼠20 30g進(jìn)行該皮下注射?？疾齑藭r的腫瘤體積的變化(圖1C)。其結(jié)果，從給藥開始21日后，與LacZshRNA組比較，觀察到利用RGM249 shRNA組的顯著的腫瘤抑制效果。需要說明的是，作為DDS (藥物傳遞系統(tǒng)；Drug Delivery System),使用陽離子化明膠水凝膠(MedGel公司制)。質(zhì)粒與DDS，根據(jù)制造商的實驗報告以各IOOnM進(jìn)行混合。在圖表中示出標(biāo)準(zhǔn)誤差。數(shù)據(jù)(n=5)通過曼-惠特尼進(jìn)行分析(P〈0.01)。另外，從最初給藥開始4周后，RGM249shRNA組，與RGM249-mlshRNA組和LacZ shRNA組比較，顯著地顯示出了腫瘤抑制效果(P=0.034、P=0.021)。圖1D的3個照片是將上述各種質(zhì)粒進(jìn)行皮下注射時的、腫瘤體積的目視的觀察結(jié)果。從皮下注射開始約28日后，RGM249shRNA組平均示出了 80%的抑制效果。另外，RGM249m-lshRNA組平均將腫瘤體積抑制為小于50%。(1-3)通過RGM249shRNA給藥的mRNA表達(dá)的抑制效果 (1-3-1)皮下給藥
另外，從皮下注射開始35日后，考察在腫瘤中表達(dá)的基因的表達(dá)抑制效果(圖2A)。使用mirVana miRNA分離試劑盒從細(xì)胞中提取miRNA后，使用Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR 試劑盒，考察miRNA的表達(dá)量。其結(jié)果，將RGM249shRNA質(zhì)粒+DDS或RGM249m_lshRNA質(zhì)粒+DDS進(jìn)行給藥的情況下，RGM249mRNA以及hTERT mRNA的表達(dá)水平，與LacZ shRNA比較，顯著降低(RGM249mRNA與hTERTmRNA的P值分別為P=0.036、P=0.025)。這些數(shù)據(jù)通過曼-惠特尼進(jìn)行分析。黑色方塊表示RGM249的表達(dá)，白色方塊表示hTERT mRNA的表達(dá)。(1-3-2)尾靜脈給藥
另一方面，將上述各種質(zhì)粒向尾靜脈進(jìn)行靜脈注射的情況下，在28日后考察腫瘤中表達(dá)的基因的表達(dá)抑制效果(圖2B)。DDS中使用缺端膠原(AteloGene ) (Jo, J., Yamamotoet al., J Nanosci Nanotechnol6, 2853-2859 (2006).> Takeshita et al., MolTherl8, 181-187(2010).)。質(zhì)粒與DDS根據(jù)制造商的實驗報告以各100 y M進(jìn)行混合。其結(jié)果，將RGM249shRNA質(zhì)粒+DDS給藥的情況下，RGM249mRNA以及hTERT mRNA的表達(dá)水平，與LacZ shRNA比較顯著降低。這些數(shù)據(jù)通過曼-惠特尼進(jìn)行分析(P〈0.05)。黑色方塊表示RGM249的表達(dá)，白色方塊表示hTERT mRNA的表達(dá)。如上，RGM249shRNA組中的RGM249mRNA和hTERT mRNA的表達(dá)，與LacZ shRNA組比較，兩者均顯著抑制(各自P=0.049,0.046)。(1-4)通過RGM249shRNA給藥的癌轉(zhuǎn)移抑制效果
另外，從靜脈注射開始28日后，目視觀察肝臟內(nèi)外的結(jié)節(jié)。在僅HLF細(xì)胞的組(未示數(shù)據(jù))和LacZ shRNA組中，目視觀察到癌結(jié)節(jié)。另外，通過顯微鏡觀察時，在所有小鼠的肝臟或肺中，轉(zhuǎn)移性的病灶觀察到I只小鼠向左腎中轉(zhuǎn)移。目視進(jìn)行觀察，結(jié)果確認(rèn)，在RGM249shRNA組中，僅I只小鼠在肝臟中存在結(jié)節(jié)(表I)。另外確認(rèn)，僅I只小鼠在腎臟中具有結(jié)節(jié)。其結(jié)果示出，RGM249shRNA組與其他組比較，抑制腫瘤形成和轉(zhuǎn)移。即，RGM249shRNA組通過靜脈注射給藥時抑制腹腔內(nèi)的發(fā)癌。其意味著，以人特異性的RGM249mRNA作為目標(biāo) ，治療了注入進(jìn)來的來自人的腫瘤。表I
權(quán)利要求
1.一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于，含有選自由如下單鏈或雙鏈的多核苷酸組成的組中的一種以上的單鏈或雙鏈的多核苷酸: a)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號I的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； b)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號2的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；以及 c)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號3的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列， 并且將細(xì)胞誘導(dǎo)向多能干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述單鏈或雙鏈的多核苷酸具有RNAi作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述單鏈或雙鏈的多核苷酸為小RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述單鏈或雙鏈的多核苷酸為單鏈或雙鏈的RNA鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述單鏈或雙鏈的多核苷酸由15以上的核苷酸構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利 要求5所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述單鏈或雙鏈的多核苷酸由100以下的核苷酸構(gòu)成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述單鏈的多核苷酸為shRNA,所述雙鏈的多核苷酸為siRNA或miRNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述shRNA由35 100核苷酸構(gòu)成，所述siRNA或miRNA的引導(dǎo)鏈由15 40核苷酸構(gòu)成。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述shRNA、所述siRNA以及所述miRNA包含由I 5核苷酸構(gòu)成的突出端。
10.如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于: 所述a)的單鏈或雙鏈的多核苷酸還包含:序列號4的堿基序列、或相對于該堿基序列I 5個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列， 所述b)的單鏈或雙鏈的多核苷酸還包含:序列號5的堿基序列、或相對于該堿基序列I 5個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列，以及 所述c)的單鏈或雙鏈的多核苷酸還包含:序列號6的堿基序列、或相對于該堿基序列I 5個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述單鏈或雙鏈的多核苷酸為雙鏈的多核苷酸，并且為siRNA。
12.—種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有: 包含選自由如下堿基序列組成的組中的一種以上的堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸，所述喊基序列為: 相對于將包含序列號7的堿基序列的RNA鏈用RNA內(nèi)切酶III進(jìn)行處理而得到的RNA鏈互補(bǔ)的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述誘導(dǎo)劑將體細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述誘導(dǎo)劑將惡性腫瘤細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述惡性腫瘤為選自由肝癌、胰癌、纖維肉瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑素瘤組成的組中的一種以上的惡性腫瘤。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:所述多能干細(xì)胞表達(dá)內(nèi)在性的P53。
17.一種未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑，其特征在于，含有選自由如下單鏈或雙鏈的多核苷酸組成的組中的一種以上的單鏈或雙鏈的多核苷酸: g)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號I的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； h)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號2的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；以及 i)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號3的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列， 并且調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑，其特征在于: 所述未分化細(xì)胞標(biāo)記為選自由Klf4、c-Myc、0ct4、Sox2、PR0Ml組成的組中的一種以上的未分化細(xì)胞標(biāo)記。
19.一種多能干細(xì)胞的p53表達(dá)促進(jìn)劑，其特征在于，含有選自由如下單鏈或雙鏈的多核苷酸組成的組中的一種以上的單鏈或雙鏈的多核苷酸: j)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號I的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； k)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號2的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；以及 I)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號3的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列， 并且促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量。
20.一種多能干細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括將選自由如下單鏈或雙鏈的多核苷酸組成的組中的一種以上的單鏈或雙鏈的多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞的步驟: m)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號I的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； n)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號2的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；以及 0)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號3的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列。
21.一種多能干細(xì)胞，其通過權(quán)利要求20所述的生產(chǎn)方法得到。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的多能干細(xì)胞，其特征在于，與HPS0002:253G1株相比，內(nèi)在性的P53的表達(dá)量增大。
23.—種惡性腫瘤的治療藥，其特征在于:含有選自由如下單鏈或雙鏈的多核苷酸組成的組中的一種以上的單鏈或雙鏈的多核苷酸: P)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號I的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； q)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號2的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；以及 r)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號3的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的惡性腫瘤的治療藥，其特征在于:還包含缺端膠原。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的惡性腫瘤的治療藥，其特征在于:所述惡性腫瘤為選自由肝癌、肺癌、胰癌、纖維肉瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑素瘤組成的組中的一種以上的惡性腫瘤。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的惡性腫瘤的治療藥，其特征在于:所述惡性腫瘤為肉瘤。
27.—種siRNA，其特征在于:含有選自由如下多核苷酸組成的組中的一種以上的多核苷酸: s)多核苷酸，其包含序列號I的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； t)多核苷酸，其包含序列號2的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；以`及 u)多核苷酸，其包含序列號3的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列。
28.—種載體，其為選自由如下載體組成的組中的一種以上， V)載體，其含有包含與序列號I的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的多核苷酸； w)載體，其含有包含與序列號2的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的多核苷酸；以及 X)載體，其含有包含與序列號3的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的多核苷酸。
29.一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于:含有權(quán)利要求28所述的載體，并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。
30.一種惡性腫瘤的治療藥，其含有權(quán)利要求28所述的載體。
31.一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于，含有: 包含序列號8的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸， 并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于: 所述單鏈或雙鏈的多核苷酸為單鏈的多核苷酸， 并且包含序列號10的堿基序列、或相對于該堿基序列I 4個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列。
33.一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于，含有: 相對于包含序列號7的堿基序列的RNA鏈具有RNAi作用的單鏈或雙鏈的多核苷酸， 并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。
34.一種未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑，其特征在于，含有: 包含序列號8的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸， 并且調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。
35.一種多能干細(xì)胞的p53表達(dá)促進(jìn)劑，其特征在于，含有: 包含序列號8的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸， 并且促進(jìn)多能干細(xì)胞中的P53的表達(dá)量。
36.一種惡性腫瘤的治療藥，其特征在于，含有: 包含序列號8的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的單鏈或雙鏈的多核苷酸。
37.一種shR NA，其特征在于，包含序列號8的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列。
38.—種載體，其特征在于，含有: 將與序列號8的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列、或相對于該堿基序列I 4個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列進(jìn)行編碼的多核苷酸。
39.一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)用、未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)用、多能干細(xì)胞的p53表達(dá)促進(jìn)用或惡性腫瘤的治療用的試劑盒，其特征在于，含有選自由如下多核苷酸組成的組中的一種以上的多核苷酸: y)多核苷酸，其包含序列號I的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； Z)多核苷酸，其包含序列號2的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； a’)多核苷酸，其包含序列號3的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； b’)多核苷酸，其包含序列號8的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； c’ )多核苷酸，其包含序列號44的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； d’ )多核苷酸，其包含序列號45的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； e’ )多核苷酸，其包含序列號46的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；以及 f’)多核苷酸，其包含序列號47的堿基序列或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列。
40.一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于，含有選自由如下單鏈或雙鏈的多核苷酸組成的組中的一種以上的單鏈或雙鏈的多核苷酸: g’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號44的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； h’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號45的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； i’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號46的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；以及 j’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號47的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列， 并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。
41.一種未分化細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)調(diào)節(jié)劑，其特征在于，含有選自由如下單鏈或雙鏈的多核苷酸組成的組中的一種以上的單鏈或雙鏈的多核苷酸: k’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號44的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； I’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號45的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； m’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號46的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；以及 n’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號47的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； 并且調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。
42.一種惡性腫瘤的治療藥，其特征在于，含有選自由如下單鏈或雙鏈的多核苷酸組成的組中的一種以上的單鏈或雙鏈的多核苷酸: o’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號44的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； P’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號45的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列； q’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號46的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；以及 r’)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號47的堿基序列、或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列。
43.—種載體,其特征在于,所述載體為選自由如下載體組成的組中的一種以上，s’)載體，其含有包含與序列號44的堿 基序列互補(bǔ)的堿基序列或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的多核苷酸； t’)載體，其含有包含與序列號45的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的多核苷酸； u’ )載體，其含有包含與序列號46的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列或相對于該堿基序列I 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的多核苷酸；以及V’)載體，其含有包含與序列號47的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列或相對于該堿基序列1 3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列的多核苷酸。
44.一種多能干細(xì)胞，是來自哺乳動物的細(xì)胞的多能干細(xì)胞，其特征在于:與HPS0002:253G1株相比，內(nèi)在性的p53的表達(dá)量增大。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的多能干細(xì)胞，其特征在于:所述p53的表達(dá)量與HPS0002:253G1株相比為1.5倍以上。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的多能干細(xì)胞，其特征在于:所述p53的表達(dá)量是通過實時PCR測定的表達(dá)量。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的多能干細(xì)胞，其在沒有存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下能夠進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明明確多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的新型的化合物；明確新型的抗惡性腫瘤物質(zhì)。本發(fā)明提供一種多能干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其含有選自由如下單鏈或雙鏈的多核苷酸組成的組中的一種以上的單鏈或雙鏈的多核苷酸，a)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號1的堿基序列或相對于該堿基序列1～3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；b)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號2的堿基序列或相對于該堿基序列1～3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列；和c)單鏈或雙鏈的多核苷酸，其包含序列號3的堿基序列或相對于該堿基序列1～3個堿基缺失、被置換或者加成后的堿基序列，并且將細(xì)胞向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)。
文檔編號C12N15/113GK103189511SQ20118004381
公開日2013年7月3日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日
發(fā)明者三浦典正 申請人:國立大學(xué)法人鳥取大學(xué)