專利名稱：嗜熱細(xì)菌用于制造三唑核苷類的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用酶促合成方法生產(chǎn)具有與三唑連接的核糖基的藥用化合物，例如三唑核苷類，在一些實(shí)例中與1，2，4-三唑連接，形成1，2，4-三唑核苷類。一種化合物是藥物三氮唑核苷，其化學(xué)名為1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺。
具有與三唑相連的核糖基的藥用化合物，例如三唑核苷類可用不同方法制得。已知最好的化合物是三氮唑核苷，即1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺。在某些情況下，引起涉及許多化學(xué)試劑的復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，包括在反應(yīng)前將組分或反應(yīng)物的活性基團(tuán)加以保護(hù)，將核糖活化，然后將中間體去保護(hù)(通過酰胺化)。這可參閱相應(yīng)于美國專利3798209的加拿大專利997756，文中涉及了三氮唑核苷的制造方法。這些方法的缺點(diǎn)是產(chǎn)物雜質(zhì)多，因?yàn)橛性S多中間體殘留物，和工藝方法帶來的雜質(zhì)，另外，生產(chǎn)成本也高。
制造這類包括三氮唑核苷在內(nèi)的化合物也可用發(fā)酵和酶促合成方法進(jìn)行。見例如美國專利3,976,545和4,458,016。發(fā)酵方法包括細(xì)菌的需氧培養(yǎng)，如短桿菌屬，棒狀桿菌屬，Anthrobacterium，芽孢桿菌屬等細(xì)菌的需氧培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間2-8天，培養(yǎng)基中除營養(yǎng)介質(zhì)外，還含有1，2，4-三唑-3-甲酰胺和核糖給體。然后將細(xì)菌培養(yǎng)液中聚集的最終產(chǎn)物如三氮唑核苷分離出來。
也可參閱例如Furuya，Akira等人在日本特許公開75123882 ICIC12D，C07D，1975年9月29日，美國專利4614719和題為J.P No.29725/1975(/Agric.Biol.M.50/1)，121-6，1986的文章。
然而上面提及的現(xiàn)有技術(shù)的方法的缺點(diǎn)包括發(fā)酵時(shí)間長，會(huì)被其它微生物污染，許多不希望有的酶促反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致必須除去的大量副反應(yīng)產(chǎn)物的雜染。這些雜質(zhì)降低了三氮唑核苷產(chǎn)量和妨礙了純化過程。
在這后一點(diǎn)上，這些方法包括存在來自細(xì)菌的酶源，為底物提供特異性酶(例如磷酸酯酶、嘧啶和嘌呤核苷磷酸化酶)，用來使核糖基和三唑反應(yīng)制成三唑核苷(例如三氮唑核苷)。然而，實(shí)際上這些方法并不能產(chǎn)生商業(yè)上所需量的三氮唑核苷。在某些情況下，由不同的異養(yǎng)性嗜溫微生物產(chǎn)生的酶在不足以產(chǎn)生高產(chǎn)量的溫度下是有活性的。在某些情況下，該過程很長，增加了被其它微生物污染的可能性。這樣，該過程變得復(fù)雜了，致使在底物特異性酶純化時(shí)的方法復(fù)雜了。
因此，本發(fā)明的目的是提供使核糖基與三唑反應(yīng)的改良方法，以得到例如三氮唑核苷這樣的三唑核苷藥用活性化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供產(chǎn)生高收率和雜質(zhì)少的藥用活性化合物的方法，因而是非常有效率的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供這樣的方法使諸成分更容易接觸，于反應(yīng)混合物中彼此更好地相互作用。
本發(fā)明的另一目的是所用的方法可用磷酸酯酶和核苷磷酸化酶來產(chǎn)生高收率的活性物質(zhì)如三氮唑核苷。
本發(fā)明的其它目的對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員由以下的發(fā)明綜述及其實(shí)施方案的詳細(xì)說明中會(huì)是很清楚的。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供了一種制備具有與三唑相連的核糖基的藥用活性化合物的方法，例如制備三唑核苷，如三氮唑核苷，是在嗜熱細(xì)菌(如優(yōu)選為排硫嗜熱菌)的存在下作為催化反應(yīng)的酶源，將三唑(如1，2，4-三唑-3-甲酰胺)與核糖基給體(例如核糖-1-磷酸，嘧啶核苷，如尿苷和胞苷，嘌呤核苷，如鳥苷、肌苷和腺苷，嘧啶核苷酸如5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸如5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)反應(yīng)。
嗜熱細(xì)菌可定義為在較高溫度例如高達(dá)大約90-95℃仍可存活的細(xì)菌，也包括排硫嗜熱菌，它在40-80℃下仍存活。
排硫嗜熱菌天然存在于新墨西哥熱泉(大地構(gòu)成泉)，溫度74℃，pH7.0，HS-濃度1mg/升。該微生物為革蘭氏陰性菌，非運(yùn)動(dòng)性菌，0.5-1.0×3-20μm，可形成長度達(dá)1cm的細(xì)胞鏈。形成的絲狀體無莢膜。硫沉積在細(xì)胞外。該微生物可用自養(yǎng)培養(yǎng)基分離，培養(yǎng)基中HS-為能源，NO3-為終末電子接受體。厭氧條件需要NO2-或NO3-。由NO3-形成NO2-，無氣體逸出。氧也可用作終末電子接受體，但是因?yàn)樵谏L所需的溫度下O2的溶解度降低了，因而該菌生長較差。需氧和厭氧培養(yǎng)所用的交替能源包括有己糖、HS-、SO3＝、和S2O3＝。最佳溫度為70-73℃，生長溫度為62-77℃(“排硫嗜熱菌屬和兼性厭氧兼性礦質(zhì)化能營養(yǎng)性細(xì)菌新種，于中性pH和高溫下生長”，引自Douglas E.Caldwell，Sarah J.Caldwell，和J.Paul Laycoct，Can.J.Microbiol.221509-1517)。
含有排硫嗜熱菌種的樣品初培養(yǎng)后，再對(duì)富集培養(yǎng)液加以純化。
由于嗜熱微生物(如排硫嗜熱菌種)的自然生境是大地構(gòu)成泉(此處不存在不嗜熱的天然存在的其它類型的細(xì)菌)，溫度范圍40-80℃，我們已經(jīng)根據(jù)礦泉水的組成和溫度數(shù)據(jù)，從具有最高溫度的礦泉選擇了塞爾維亞三個(gè)礦泉的熱水作為本發(fā)明用的嗜熱細(xì)菌的來源-Josanicka banja(62-78℃)-Vranjski banja(78-80℃)-Sijarinska banja(41-63℃)生境特征(a)Josanicka banja位于Kopaonik山腳下，有4處藥用礦泉水的大地構(gòu)成泉。水溫62-78℃，水的pH范圍7.5-8.5。(b)Vranjska banja位于Veliki Pester山腳下，在南斯拉夫是最溫?zé)岬牡V水泉，也是歐洲最溫?zé)岬摹Ｋ泻辛蚝蛪A，水是超高溫的，而pH范圍7.8-8.0。取樣之處的水溫范圍78-80℃，但某些地段的水溫范圍63-92℃。(c)Sijarinska banja位于Golak山的最遠(yuǎn)端，距Leskovac 52公里，有16個(gè)礦水泉，含有堿和鐵，溫度范圍41-63℃。取樣粘滑的細(xì)菌沉積物存在于經(jīng)常被溫水沖洗的巖石上。在無菌條件下取樣，用移液管將細(xì)菌沉積物連同水一起取入，轉(zhuǎn)移到錐形瓶?jī)?nèi)，用細(xì)菌環(huán)取出沉積物，接種于試管的營養(yǎng)介質(zhì)(液體培養(yǎng)基)和瓊脂斜面(固體培養(yǎng)基)上。在用細(xì)菌環(huán)移取時(shí)，沉積物可拉成10-15cm長的絲。使用下列培養(yǎng)基肉湯營養(yǎng)液(含蛋白胨1.5％，肉提取物0.3％，NaCl 0.5％，KH2P040.03％)和營養(yǎng)瓊脂(其組成與肉湯營養(yǎng)液組成相同，只是含瓊脂1.6％)。
生物材料取樣放到錐形瓶中，也接種到營養(yǎng)介質(zhì)中，運(yùn)回到實(shí)驗(yàn)室。材料富集和純化取樣的生物材料起初接種在液體營養(yǎng)液中培養(yǎng)，于45和70℃培養(yǎng)過夜。“過夜”的培養(yǎng)液用同樣介質(zhì)稀釋20倍，再于45°和70℃培養(yǎng)。然后再稀釋，于45℃和70℃培養(yǎng)過夜。用這種雙程法使起始的生物材料繁殖。用“塊皿法”分離純細(xì)菌培養(yǎng)物，得到的單個(gè)菌落在形態(tài)學(xué)上如形狀、大小、顏色和稠度是不同的，在培養(yǎng)皿上的生長方式也是不同的。在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)后出現(xiàn)不同類型的菌落。每種菌落劃線接種到營養(yǎng)瓊脂上，于45℃和70℃培養(yǎng)。培養(yǎng)出的菌落再接種在瓊脂斜面上。用這種方法使采自Josanicka、Vranjska和Sijarinskabanja的生物材料富集和純化。自Josanicka banja分離出4種形態(tài)學(xué)上不同的菌落，稱作J1，J2，J3(排硫嗜熱菌)和J4。自Vranjska banja的水中分離出的兩種菌落稱為V1和V2，自Sijarinska banja只分離出一種細(xì)菌培養(yǎng)物，因此在樣品純化后，總共分離出7種形態(tài)學(xué)不同的嗜熱菌(菌落)，從Vranjska banja得到的菌落實(shí)際上與從Josanickabanja得到的菌落是一樣的(V1＝J2，V2＝J3)。分離出的嗜熱菌的純培養(yǎng)物的分離和保存(a)分離出的細(xì)菌培養(yǎng)物保存在培養(yǎng)皿和瓊脂斜面上，4℃保存，每1個(gè)月轉(zhuǎn)種1次。(b)所有分離出的培養(yǎng)物凍干，于4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的另一方面是提供了生產(chǎn)藥用活性的三唑核苷如三氮唑核苷的方法，該過程是在由嗜熱菌(如排硫嗜熱菌)分泌的核苷磷酸化酶的存在下發(fā)生的。
本發(fā)明的另一方面是用嗜熱菌生產(chǎn)藥用活性的三唑核苷，例如三氮唑核苷，這類菌優(yōu)選排硫嗜熱菌。
因此，本發(fā)明的另一方面是由于嗜熱菌(優(yōu)選排硫嗜熱菌)的存在，意外地提高了制造這類活性化合物方法的價(jià)值。
皆知，無機(jī)磷酸鹽源(優(yōu)選磷酸二氫鉀)作為磷酸鹽源作為催化劑參與了核糖磷酸化的生化途徑。
本發(fā)明的酶促合成的反應(yīng)方案如下 R可以是1)NH2三氮唑核苷2)OH3)烷氧基〔當(dāng)未制成三氮唑核苷時(shí)，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將生成的產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成三氮唑核苷〕 〔〕*本步驟是任選的，這取決于核糖供給體是核苷酸還是核苷，例如步驟(e)步驟(e) 步驟(f)由核糖-1-磷酸開始，步驟如下 (由于核糖-1-磷酸昂貴且不太穩(wěn)定，作為合成例如三氮唑核苷的原料是不經(jīng)濟(jì)的，不如其它物質(zhì)如尿苷合算)。
由于嗜熱細(xì)菌允許提高反應(yīng)溫度，并且用改進(jìn)的酶促反應(yīng)方法進(jìn)行制造，因而合成費(fèi)用降低了，例如增加了反應(yīng)速率，增加了原料的溶解度，反應(yīng)中的細(xì)胞溶解作用使酶和底物更好地接觸，降低了競(jìng)爭(zhēng)性微生物污染的危險(xiǎn)，降低了同時(shí)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)的可能性，并改善了總的反應(yīng)收率。
一個(gè)實(shí)際例子是本發(fā)明的合成方法可用來制造三氮唑核苷。為此，使1，2，4-三唑-3-甲酰胺(TCA)與一種核糖供給體(例如最好是尿苷)，濃度宜略高于TCA摩爾量(例如1.2∶1)，在無機(jī)磷酸鹽源如磷酸二氫鉀作為催化劑存在下酶促合成三氮唑核苷。用于本反應(yīng)混合物的酶源最好是排硫嗜熱菌的非繁殖性細(xì)胞，這些細(xì)胞隨后溶解。非繁殖性細(xì)胞是指不生長和不繁殖的細(xì)胞。細(xì)胞的隨后溶解能夠使酶或酶性物質(zhì)與底物直接接觸以進(jìn)行例如三氮唑核苷的酶促合成反應(yīng)，而不是通過活細(xì)胞的某些其它代謝過程合成，在后者情況下細(xì)胞是活的，三氮唑核苷的合成會(huì)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，即在不同的條件下進(jìn)行。pH最好是5-9的范圍，優(yōu)選溫度是50-80℃。反應(yīng)一般于1-48小時(shí)內(nèi)完成。
核糖的適宜供給體可以是核糖-1-磷酸，嘧啶和嘌呤核苷和嘧啶和嘌呤核苷酸。嘧啶核苷酸包括5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)；嘌呤核苷酸包括5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)，嘧啶核苷包括尿苷(優(yōu)選的)和胞苷；嘌呤核苷包括鳥苷、肌苷和腺苷。
一個(gè)實(shí)例中是將一定濃度的濕細(xì)菌生物量摻入到反應(yīng)混合物中。在反應(yīng)混合物中的濕細(xì)菌生物量為50-60mg/ml。在一個(gè)實(shí)例中的濕細(xì)菌生物量的制備是按本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的常用的方法制成排硫嗜熱菌的濃集物。
在用于實(shí)例中的排硫嗜熱菌細(xì)胞的發(fā)育和制備時(shí)，培養(yǎng)用的營養(yǎng)介質(zhì)有如下成分蛋白胨I、肉提取物、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫代硫酸鈉五水合物和蒸餾水。主培養(yǎng)物的制備是將種子培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)介質(zhì)中，然后在50℃于空氣存在下在振蕩器上于100rpm連續(xù)攪拌培養(yǎng)18小時(shí)。培養(yǎng)到時(shí)后，于2700rpm離心30與鐘將細(xì)胞與營養(yǎng)介質(zhì)分開，棄去上清液，收集由濕細(xì)胞生物量構(gòu)成的沉降物。
在本制備中進(jìn)行如下操作營養(yǎng)介質(zhì)的組成和制備介質(zhì)組成蛋白胨I 6g肉提取物 1.3gNaCl 2.0gKH2PO40.12gNa2S2O3·5H2O 0.099g蒸餾水加到 440ml稱量上述量的蛋白胨、肉提取物、NaCl和KH2PO4分別加到容量為200ml的玻璃器皿中，用100ml蒸餾水分別溶解各個(gè)成分，慢慢混合，直到溶液完全澄明。合并溶解的成分，置于1000ml玻璃器皿中，加蒸餾水到440ml(介質(zhì)在高壓釜中滅菌時(shí)，水分大約蒸發(fā)10％)。
用2M NaOH水溶液調(diào)節(jié)介質(zhì)pH到7.0-7.2，傾入到置于1000ml錐形瓶?jī)?nèi)的介質(zhì)中。
介質(zhì)滅菌，于120℃、壓力為1.5大氣壓的高壓釜中滅菌15分鐘。
于無菌條件下量取100ml介質(zhì)置于4只1000ml錐形瓶?jī)?nèi)，冷卻到室溫后加入1ml新鮮制備的0.1M硫代硫酸鈉水溶液。Na2S2O3液的制備稱量0.248g Na2S2O3·5H2O，溶解于10ml蒸餾水中，在無菌條件下經(jīng)細(xì)菌過濾器＝0.45μ過濾到避光(鋁箔)的無菌玻璃容器內(nèi)。接種物的制備(種子培養(yǎng)液)從100ml錐形瓶中量取5ml前面制備的介質(zhì)，轉(zhuǎn)移到瓊脂斜面上。用無菌細(xì)菌環(huán)刮取瓊脂斜面上的細(xì)菌重新懸浮并將懸浮液轉(zhuǎn)移到空管(16cm×10mm)內(nèi)，振搖(用旋渦振蕩器)1-2分鐘，得到均勻的懸浮液，顯微鏡下看不到菌絲和細(xì)菌沉降物。
將這樣制得的細(xì)菌懸浮液接種于含有95ml介質(zhì)的錐形瓶?jī)?nèi)。
用無菌塞塞住接種后的介質(zhì)瓶，無菌塞用棉花和紗布制成，于50℃和空氣中振搖培養(yǎng)6小時(shí)，100rpm攪拌并通氣(K1Λ＝0.64mM O2/分鐘)。培養(yǎng)到時(shí)后，檢查得到的接種物(種子)pH應(yīng)為7.4-7.8。如果接種物的pH不對(duì)，則不能用來制備主培養(yǎng)物。主培養(yǎng)物的制備將上面制成的種子培養(yǎng)物各5ml接種到3個(gè)含95ml介質(zhì)的錐形瓶?jī)?nèi)。用無菌夾層塞(雙層紙棉)閉塞，在空氣中于振蕩器上按上述接種物制備條件培養(yǎng)18小時(shí)(溫度50℃，100rpm攪拌，通氣K1Λ＝0.64mM O2/分鐘)。
培養(yǎng)結(jié)束后，將主培養(yǎng)物合并到1000ml錐形瓶?jī)?nèi)，檢測(cè)pH(應(yīng)為8.3-8.6)。如果pH不對(duì)，該主培養(yǎng)物不能用于酶促合成。測(cè)定主培養(yǎng)物中細(xì)菌濕生物量的濃度(C1)以確定主培養(yǎng)物所需的體積(V1)測(cè)定光密度將0.5ml主培養(yǎng)物加入到4.5ml介質(zhì)中，用渦旋振蕩器劇烈振搖使均勻化。用未加細(xì)菌的介質(zhì)作對(duì)照測(cè)定610nm處的光密度。
用如下公式計(jì)算主培養(yǎng)物的細(xì)菌濕生物量濃度(C1)C1＝3.89×OD610mm+10.76舉例若OD610mm＝4.8，則C1＝29.6mg/ml(主樣品液中細(xì)菌濕生物量濃度)若OD610mm＝5.5，則C1＝32mg/ml(主樣品液中細(xì)菌濕生物量濃度)。為進(jìn)行酶促反應(yīng)確定主培養(yǎng)物所需的體積(V1)用如下公式確定需被離心定出反應(yīng)混合物體積(V2)的主培養(yǎng)液體積(V1)V1=C2×V2C1]]>式中C1為用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定OD610而確定的主培養(yǎng)物中細(xì)菌濕生物量濃度C2為反應(yīng)混合物中細(xì)菌濕生物量的最佳濃度(58mg/ml)V2為反應(yīng)混合物的體積。舉例若C1＝29.6mg/ml，V2＝50ml，則為了使反應(yīng)混合物中最終的細(xì)菌濕生物量濃度為58mg/ml時(shí)，離心的主培養(yǎng)液所需的體積為100.0ml。
若C1＝32mg/ml，V2＝50ml，則V1＝90.5ml。自主培養(yǎng)液中分離細(xì)胞方法將V1ml主培養(yǎng)物(90.5-100ml)離心(2700rpm)30分鐘，沉降質(zhì)，傾去上清液，將得到的沉降物(約2.9g)重新懸浮于5ml無菌重蒸餾水中，轉(zhuǎn)移到無菌試管內(nèi)，該懸浮液中含有2.0×107-109個(gè)活細(xì)胞/ml，用于進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶促反應(yīng)和分離將嗜熱菌的濕細(xì)胞塊重新懸浮于蒸餾水中，將此細(xì)菌懸浮液引入到溶液中，使諸成分最終濃度為成分 濃度TCA 100mM尿苷 120mMKH2PO450mM嗜熱菌 58mg/ml(于一實(shí)例中細(xì)菌生物量中無營養(yǎng)物)制得酶促反應(yīng)混合物。
將酶促反應(yīng)混合物于60℃保溫24小時(shí)(保溫過程中因沒有營養(yǎng)物和反應(yīng)介質(zhì)的高滲性，使活細(xì)胞溶解)。
酶反應(yīng)完全后，將藥用活性物質(zhì)如三氮唑核苷，與反應(yīng)的副產(chǎn)物和殘留的反應(yīng)試劑分開并純化。這種提取、純化和分離操作例如是通過分步沉淀法，基于反應(yīng)介質(zhì)中產(chǎn)物、副產(chǎn)物和原料的溶解度不同進(jìn)行的，也可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它的提取、純化和分離的方法。
可用柱層析法，例如用適宜的離子交換柱，例如當(dāng)要除去尿苷、尿嘧啶、TCA、尿苷一磷酸和無機(jī)磷酸鹽時(shí)，它們可用強(qiáng)陰離子交換樹脂(例如Dowe，Cl-型)除去。當(dāng)要除去痕量的陽離子型雜質(zhì)(K+、NH4+、重金屬等)時(shí)，也需要強(qiáng)陽離子交換樹脂(如Dowe50W，H+型)。藥用級(jí)別的經(jīng)用水洗脫和從濃縮、冷卻的洗脫液(最好再加入乙醇)結(jié)晶后可被回收，收率為80-90％。
在制造三氮唑核苷時(shí)，核糖供給體對(duì)三氮唑核苷的產(chǎn)量影響如表1所示表1核糖供給體三氮唑核苷收率(％)鳥苷21.0胞苷32.0尿苷80.0肌苷4.0腺苷39.95-UMP 40.0表2列出了用尿苷作核糖供給體和1，2，4-三唑-3-甲酰胺反應(yīng)時(shí)反應(yīng)混合物保溫的溫度對(duì)三氮唑核苷產(chǎn)量的影響
表2反應(yīng)溫度(℃) 三氮唑核苷收率(％)50 56.760 84.665 55.370 29.7尿苷為核糖供給體，作為催化劑的磷酸二氫鉀(KH2PO4)的濃度對(duì)三氮唑核苷產(chǎn)量的影響列于表3。
表3KH2PO4濃度(mM) 三氮唑核苷收率(％)25 80.3650 84.9475 82.17100 73.77(mM為毫摩爾)在排硫嗜熱菌存在下三氮唑核苷的制備按如下反應(yīng)流程進(jìn)行 (排硫嗜熱菌中的酶優(yōu)選用于由尿苷和1，2，4-三唑-3-甲酰胺合成三氮唑核苷。尿苷和無機(jī)磷酸鹽在嘧啶核苷磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)變成核糖-1-磷酸和尿嘧啶。在核苷酶的作用下同時(shí)發(fā)生尿苷的降解生成尿嘧啶和核糖。最后，嘌呤核苷磷酸化酶催化核糖-1-磷酸與1，2，4-三唑-3-甲酰胺反應(yīng)，生成無機(jī)磷酸鹽和三氮唑核苷)。
用嗜熱菌作為酶促反應(yīng)的酶源顯然能使反應(yīng)在提高的溫度下進(jìn)行，從而提高了酶的活性并改善了TCA的溶解度。由于較短的和比較經(jīng)濟(jì)的制備細(xì)菌生物量的方法(用未處理的細(xì)菌細(xì)胞操作)，由于細(xì)胞溶解作用使酶釋放，使這些酶與底物較好地接觸而增加了酶促反應(yīng)的效率，由于縮短了細(xì)胞蛋白的變性和分離過程，由于選擇適宜的層析柱縮短了層極純化過程，使總的制備時(shí)間縮短了。除了在較高溫度下操作外，還由于選擇了適宜的核糖供給體、試劑的摩爾比和催化劑，由于制備并選擇了適宜量的細(xì)菌濕生物量，選擇了反應(yīng)的pH以及確定了分離和純化的條件，該酶促反應(yīng)有較高的收率(轉(zhuǎn)化百分率)，在終產(chǎn)物的分離上也是有較高收率的。在提高的溫度下細(xì)菌生物量制備和酶促合成防止了其它微生物的污染。由于在反應(yīng)過程中發(fā)生溶菌作用，因而在酶促反應(yīng)完全后沒有細(xì)胞的失活問題。
現(xiàn)在用如下的酶促合成三氮唑核苷的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以說明。實(shí)施例1將排硫嗜熱菌加入到富含能源Na2S2O7的無菌營養(yǎng)介質(zhì)中，后者的pH7.0，接種過的培養(yǎng)基通氣下50℃溫育18小時(shí)。溫育完畢后，達(dá)到所需的生物量，于2700rpm離心分離出細(xì)菌，沉降下來的細(xì)胞重新懸浮于蒸餾水中，混勻。
將排硫嗜熱菌的未經(jīng)處理的完整細(xì)胞細(xì)菌生物量加入到含有120mM尿苷、100mMTCA和50mM KH2PO4的pH為6.8的反應(yīng)混合物中，使反應(yīng)混合物中濕生物量的最終濃度為58mg/ml。將反應(yīng)混合物不斷地混合，于60℃溫育24小時(shí)。在溫育過程中，活細(xì)胞逐漸在反應(yīng)混合液中溶解(由于沒有營養(yǎng)物供給以及反應(yīng)介質(zhì)的高滲性)。溫育畢，將反應(yīng)混合物離心，除去沉降物。上清液于90℃加熱處理20分鐘使酶失活和變性，蛋白沉淀。得到的上清液真空下濃縮，使尿嘧啶濃度為20-40mg/ml(用HPLC測(cè)定)，此時(shí)大部分殘留量的尿嘧啶、TCA和部分量的尿苷被除去。調(diào)節(jié)溶液pH至9后，分離出大量的無機(jī)磷酸鹽，調(diào)節(jié)得到的上清液至pH11.5，用裝有強(qiáng)陰離子樹脂(Dowex1×8Cl-型)的離子交換柱進(jìn)行純化。三氮唑核苷用水自柱上洗脫出，而殘留量的尿苷、尿嘧啶、TCA、尿苷一磷酸和無機(jī)磷酸鹽仍留在柱上。水洗脫液經(jīng)過Dowe50W H+型離子交換樹脂，而痕量的陽離子形式的雜質(zhì)留在柱上。洗脫液經(jīng)濃縮和冷卻后，結(jié)晶出藥用級(jí)別的三氮唑核苷，收率80-90％。實(shí)施例2
將前述的嗜熱細(xì)菌J1接種到pH7.0的無菌介質(zhì)中，于60℃恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)(“停滯培養(yǎng)”)。得到的初級(jí)菌種再接種到新鮮的營養(yǎng)介質(zhì)中，并于同樣條件下培養(yǎng)24小時(shí)。二級(jí)菌種再接種到新鮮介質(zhì)中，于同樣條件下培養(yǎng)18小時(shí)，制得主培養(yǎng)物。于2700rpm離心使細(xì)菌沉降，得到的沉降物再懸浮于蒸餾水中，混勻。將J1細(xì)菌的濕生物量加入到10ml反應(yīng)混合物中，后者含有32nM TCA、60mM尿苷和50mM KH2PO4，pH7.0，使反應(yīng)混合物中細(xì)菌的最終濃度為76mg/ml。將反應(yīng)混合物均化后，于45℃溫育24小時(shí)，得到的三氮唑核苷產(chǎn)量為14.9mM(16.6％)。實(shí)施例3將由瓊脂斜面得到的排硫嗜熱菌接種于富含30ppm Na2S2O3-3的無菌營養(yǎng)介質(zhì)中，將初級(jí)菌種接種。于50℃和100rpm攪拌下有氧培養(yǎng)24小時(shí)后，將初級(jí)菌種再接種到新鮮營養(yǎng)介質(zhì)中，于同樣條件下將二級(jí)菌種培養(yǎng)24小時(shí)。將二級(jí)菌種再接種于新鮮營養(yǎng)介質(zhì)中，接種主培養(yǎng)物并于同樣條件下溫育18小時(shí)。然后于2700rpm離心，得到的細(xì)菌沉降物再懸浮于蒸餾水中，振蕩使均勻。將上述制備的濕排硫嗜熱菌生物量加入到10ml反應(yīng)混合物中，其中含有100mM TCA、120mM核糖供給體(列于表中)和25mM KH2PO4，pH68。將混合物均化后，60℃溫育24小時(shí)，得到的三氮唑核苷產(chǎn)率列于表1。
現(xiàn)有技術(shù)方法與本發(fā)明方法制備三氮唑核苷的收率的比較如表4所示I.本申請(qǐng)人的發(fā)明溫度 50-80℃時(shí)間(小時(shí)) 1-48核糖∶TCA比值1.2∶1收率(％) 85II.美國專利3976545酶來源是小牛脾臟0-50℃0.082∶554.1III.美國專利4458016酶來源是肺炎克氏桿菌55-65℃0.17-204.9∶1**24.2***為核糖供給體與TCA的摩爾濃度比**用核糖-1-磷酸，三氮唑核苷收率為24.2％，核糖∶TCA比值為4.9∶1。若按美國專利4458016用尿苷作核糖供給體，則三氮唑核苷收率為11.5％，核糖∶TCA＝4.6∶1。
由于在不背離本發(fā)明范圍的情況下可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多改變，所以本文包含的所有材料都是為了說明本發(fā)明而無限制的意圖。
權(quán)利要求
1.一種在嗜熱細(xì)菌和作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽源的存在下使三唑與核糖供給體反應(yīng)生產(chǎn)具有與三唑相連的核糖基的藥用活性化合物的方法。
2.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)菌是排硫嗜熱菌。
3.權(quán)利要求2的方法，其中藥用活性化合物是三氮唑核苷。
4.權(quán)利要求2的方法，其中核糖供給體選自核糖-1-磷酸，嘧啶核苷，嘌呤核苷，嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸。
5.權(quán)利要求2的方法，其中三唑是1，2，4-三唑-3-甲酰胺。
6.權(quán)利要求2的方法，其中核糖供給體選自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鳥苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
7.權(quán)利要求4的方法，其中核糖供給體選自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鳥苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
8.權(quán)利要求5的方法，其中核糖供給體選自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鳥苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
9.權(quán)利要求5的方法，其中核糖供給體存在的摩爾量大于1，2，4-三唑-3-甲酰胺的摩爾量。
10.權(quán)利要求6，7或8的方法，其中核糖供給體存在的摩爾量大于三唑的摩爾量。
11.權(quán)利要求6，7，8或10的方法，其中核糖供給體是尿苷。
12.權(quán)利要求2，5或9的方法，其中核糖供給體是尿苷，其存在的摩爾量大于三唑的摩爾量。
13.權(quán)利要求5的方法，其中作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽是磷酸二氫鉀。
14.權(quán)利權(quán)利要求6的方法，其中作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽是磷酸二氫鉀。
15.權(quán)利要求7的方法，其中作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽是磷酸二氫鉀。
16.權(quán)利要求8的方法，其中作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽是磷酸二氫鉀。
17.權(quán)利要求9的方法，其中作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽是磷酸二氫鉀。
18.權(quán)利要求10的方法，其中作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽是磷酸二氫鉀。
19.權(quán)利要求11的方法，其中作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽是磷酸二氫鉀。
20.權(quán)利要求12的方法，其中作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽是磷酸二氫鉀。
21.上述任何一項(xiàng)的方法，可得到三氮唑核苷。
22.權(quán)利要求1，2，4，6，7，10，11，14或15的方法，還包括制備三氮唑核苷的步驟。
23.生產(chǎn)藥用活性三唑核苷的方法，其中在由嗜熱細(xì)菌來源的核苷磷酸化酶制劑和作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽源的存在下發(fā)生反應(yīng)。
24.權(quán)利要求23的制備核苷的方法，其中細(xì)菌是排硫嗜熱菌。
25.權(quán)利要求24的方法，其中反應(yīng)是在核糖供給體和三唑的存在下進(jìn)行的。
26.權(quán)利要求25的方法，其中反應(yīng)是在核糖供給體和三唑的存在下進(jìn)行的。
27.權(quán)利要求25的方法，其中藥用活性化合物是三氮唑核苷。
28.權(quán)利要求25的方法，其中三唑是1，2，4-三唑-3-甲酰胺。
29.權(quán)利要求28的方法，其中核糖供給體選自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鳥苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
30.權(quán)利要求25，26，27或28的方法，其中核糖供給體存在的摩爾量大于三唑的摩爾量。
31.權(quán)利要求25或27的方法，其中核糖供給體存在的摩爾量大于三唑的摩爾量，核糖供給體是尿苷。
32.權(quán)利要求26，27或29的方法，其中核糖供給體存在的摩爾量大于三唑的摩爾量，核糖供給體是尿苷。
33.權(quán)利要求30，31或32的方法，其中核糖供給體存在的摩爾量大于三唑的摩爾量，核糖供給體是尿苷。
34.權(quán)利要求23，24，25，27或31的方法，還包括制備三氮唑核苷的步驟。
35.權(quán)利要求23，24，25，26，27，28，29，30，31，32或33的方法，還包括制備三氮唑核苷的步驟。
36.一種用排硫嗜熱菌酶促合成三氮唑核苷的方法，包括以磷酸二氫鉀為催化劑和在對(duì)熱穩(wěn)定的嘧啶核苷和嘌呤核苷磷酸化酶的存在下，使核糖供給體與1，2，4-三唑-3-甲酰胺反應(yīng)，磷酸化酶來自完整的排硫嗜熱菌，該菌在反應(yīng)混合物中不繁殖，pH范圍為5-9，溫度范圍是50-80℃，時(shí)間為1-48小時(shí)，其中細(xì)菌在反應(yīng)混合液中的濃度為50-60mg/ml。
37.權(quán)利要求36的方法，其中分離和純化三氮唑核苷是用所選類型的離子交換樹脂的柱層析法，根據(jù)反應(yīng)混合物中各組分溶解度的不同使副產(chǎn)物和殘留的反應(yīng)物分開。
38.權(quán)利要求36的方法，其中核糖供給體選自核糖-1-磷酸，嘧啶核苷，嘌呤核苷，嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸，其摩爾量大于1，2，4-三唑-3-甲酰胺的摩爾量。
39.權(quán)利要求36的方法，其中核糖供給體是尿苷，其摩爾量大于1，2，4-三唑-3-甲酰胺的摩爾量。
40.權(quán)利要求36的方法，其中作為催化劑使用的磷酸二氫鉀的濃度，以每100mM的1，2，4-三唑-3-甲酰胺計(jì)，為25-100mM。
41.權(quán)利要求40或42的方法，其中三氮唑核苷的分離和純化是經(jīng)熱處理除去殘留的溶解細(xì)胞和蛋白，將預(yù)先真空濃縮的上清液pH調(diào)節(jié)到11.5，用分步沉淀法除去殘留量的反應(yīng)物和副產(chǎn)物，用含有所選類型的離子交換樹脂的預(yù)先再生的柱經(jīng)層析純化，用水洗脫出全量的三氮唑核苷。
42.權(quán)利要求44的方法，其中層析柱分別裝載Dowex1×8，Cl-型和Dowex50W，H+的強(qiáng)陰離子和強(qiáng)陽離子交換樹脂。 其中R選自NH2(產(chǎn)生三氮唑核苷)，OH或烷氧基 其中R選自NH2(產(chǎn)生三氮唑核苷)，OH或烷氧基
49.在排硫嗜熱菌存在下制備三氮唑核苷的方法，該方法包括下列步驟 此處Pi是無機(jī)磷酸鹽
全文摘要
在嗜熱菌和作為催化劑的無機(jī)磷酸鹽源的存在下使三唑與核糖供給體反應(yīng)生產(chǎn)具有與三唑相連的核糖基的藥用活性化合物的方法。
文檔編號(hào)C12P19/38GK1111061SQ94190019
公開日1995年11月1日 申請(qǐng)日期1994年5月12日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月14日
發(fā)明者奧佩西克·戈德納, 格利吉克·利尤賓卡, 勞德羅維克·澤爾基卡, 齊夫科維克·瓦倫西亞, 馬蒂克·洛拉, 史密斯·羅伯特 申請(qǐng)人:奧佩西克·戈德納, 格利吉克·利尤賓卡, 勞德羅維克·澤爾斯卡, 齊夫科維克·瓦倫西亞, 馬蒂克·洛拉, 史密斯·羅伯特