專利名稱：：具有葡糖淀粉酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法，和本發(fā)明的葡糖淀粉酶的用途，以及使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶產(chǎn)生液化、糖化和發(fā)酵產(chǎn)物的工藝。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的葡糖淀粉酶的組合物。相關(guān)領(lǐng)域描述葡糖淀粉酶(1，4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.I.3)是催化從淀粉或相關(guān)的寡糖和多糖分子的非還原端釋放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶由幾種絲狀真菌和酵母產(chǎn)生，其中來自曲霉屬(Aspergillus)的那些在商業(yè)上最為重要。葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡糖苷酶，AMG)主要作為糖化酶出售予多種工業(yè)，包括釀造、淀粉和燃料工業(yè)。在淀粉和燃料工業(yè)中，商業(yè)上使用葡糖淀粉酶將已經(jīng)由α-淀粉酶部分水解的淀粉材料轉(zhuǎn)化為葡萄糖。然后可使用發(fā)酵生物將葡萄糖直接或間接地轉(zhuǎn)化為發(fā)酵產(chǎn)物。商業(yè)性發(fā)酵產(chǎn)物的實例包括醇(例如乙醇，甲醇，丁醇，1，3_丙二醇)，有機(jī)酸(例如檸檬酸，乙酸，衣康酸，乳酸，葡糖酸，葡糖酸鹽，乳酸，琥珀酸，2，5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；氣體(例如H2和CO2)，和更復(fù)雜的化合物，包括例如抗生素(例如青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如核黃素，B12,β-胡蘿卜素)；激素，和其他難以合成產(chǎn)生的化合物。發(fā)酵工藝亦常用于可飲用醇類(例如啤酒和葡萄酒)，乳制品(例如在酸奶和乳酪的生產(chǎn)中)，皮革，飲料和煙草工業(yè)。終產(chǎn)物亦可為糖漿。例如，終產(chǎn)物可為葡萄糖，但亦可例如由葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為果糖或由幾乎等量的葡萄糖和果糖構(gòu)成的混合物。該混合物，或進(jìn)一步富集果糖的混合物，是在整個世界都商業(yè)化的最常用的高果糖玉米糖漿(HFCS)。公開了兩種形式的來自草酸青霉(Penicilliumoxalicum)的葡糖淀粉酶的純化和特性(YoshikiYAMASAKI,Agric.Biol.Chem.，41(5)，755762，1977)。這兩種葡糖淀粉酶均在高至55°C穩(wěn)定，但在60°C左右的溫度，葡糖淀粉酶活性顯著下降。這兩種形式的葡糖淀粉酶的序列并未公開于該文獻(xiàn)，甚至較遲的文獻(xiàn)中。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟序列具有優(yōu)選至少61.5%，更優(yōu)選至少63%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少68%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，并且甚至最優(yōu)選至少95%，如甚至至少96%，97%，98%，99%或100%同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選至少低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選至少中等嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選至少中等-高嚴(yán)格條件，最優(yōu)選至少高嚴(yán)格條件，并且甚至最優(yōu)選至少非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少61.5%，更優(yōu)選至少63%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少68%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，并且甚至最優(yōu)選至少95%，如甚至至少96%，97%,98%,99%或100%同一性；(d)SEQIDN0:2的成熟多肽包含一個或多個(例如幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有葡糖淀粉酶活性的片段。本發(fā)明亦涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列。本發(fā)明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞，并涉及產(chǎn)生具有葡糖淀粉酶活性的多肽的方法。本發(fā)明亦涉及用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞。本發(fā)明亦涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。本發(fā)明亦涉及本發(fā)明的多肽用于液化、糖化和/或發(fā)酵工藝，優(yōu)選在淀粉轉(zhuǎn)化中的用途，涉及本發(fā)明的多肽用于生產(chǎn)糖漿、飲料和/或發(fā)酵產(chǎn)物的用途，并且涉及本發(fā)明的多肽用于釀造的用途。本發(fā)明亦涉及用于從含淀粉材料產(chǎn)生液化、糖化和/或發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，其包括下述步驟用本發(fā)明的多肽處理含淀粉材料。圖I顯示純化的本發(fā)明的草酸青霉葡糖淀粉酶樣品的SDS-PAGE電泳。泳道I:標(biāo)志物(97、66、45、30、20.I和14.4kDa);泳道2:本發(fā)明的草酸青霉葡糖淀粉酶在純化前的上清；泳道3:本發(fā)明的草酸青霉葡糖淀粉酶。本發(fā)明的草酸青霉葡糖淀粉酶的多核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:I和2。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸，優(yōu)選地，提供具有高度熱穩(wěn)定性的具有葡糖淀粉酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。定義葡糖淀粉酶活性術(shù)語“葡糖淀粉酶(1，4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶，3.2.I.3)活性”在本文中定義為催化從淀粉或相關(guān)的寡糖和多糖分子的非還原端釋放D-葡萄糖的酶活性。葡糖淀粉酶活性可以以AGU單位測量。參見下文“材料和方法”部分中的“葡糖淀粉酶活性”部分。本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的葡糖淀粉酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少100%。分離的多肽術(shù)語“分離的”和“純化的”意指從與其天然地相結(jié)合的至少一種組分移去的多肽或多核苷酸。舉例而言，多肽如通過SDS-PAGE確定，可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，和至少90%純，而多核苷酸如通過瓊脂糖電泳確定，可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，和至少95%純。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文意指為以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個方面，基于預(yù)測SEQIDNO:2的氨基酸I至21是信號肽的SignalP(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1-6)程序,所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸22至616。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有葡糖淀粉酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個方面，基于預(yù)測SEQIDNO:I的核苷酸I至63編碼信號肽的SignalP(Nielsen等，1997，見上)程序，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:I的核苷酸64至1848。序列同一性參數(shù)“序列同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsinGenetics16:276-277)(優(yōu)選3.0.0版或更高版本)的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開啟罰分(gapopenpenalty)10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最長同一'I"生(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性,并計算如下(同樣的殘基X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見上文)(優(yōu)選3·0.O版或更高版本)的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，見上文)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開啟罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最長同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))—種來自黑曲霉(Aspergillusniger)的具有葡糖淀粉酶活性的多肽(uniprot:P69328)(Svensson,B.Larsen,K.Gunnarsson,A.;"CharacterizationofaglucoamylaseG2fromAspergillusniger.〃；Eur.J.Biochem.154:497-502(1986))與本發(fā)明的SEQIDNO:2的草酸青霉葡糖淀粉酶48.1%相同。一種來自Hormoconisresinae的具有葡糖淀粉酶活性的多肽(UNIPROT:Q03045)(Joutsjoki,V.V.Torkkeli,T.K.;"GlucoamyIasePgeneofHormoconisresinae:molecularcloning,sequencingandintroductionintoTrichodermareesei.〃;FEMSMicrobiol.Lett.78:237-243(1992))與本發(fā)明的SEQIDNO:2的草酸青霉葡糖淀粉酶51.68%相同(無缺口)。同源序列術(shù)語“同源序列”在本文中定義為用SEQIDNO:2的草酸曲霉[大腸桿菌(E.coli)DSM23123]葡糖淀粉酶或其成熟多肽,在tfasty檢索(Pearson,ff.R.,1999,于BioinformaticsMethodsandProtocols.，S.Misener和S.A.Krawetz編，185-219頁)中給出小于0.001的E值(或預(yù)期分?jǐn)?shù))的預(yù)測蛋白質(zhì)。多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(例如幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有葡糖淀粉酶活性。在一個方面，片段含有至少473個氨基酸殘基，例如SEQIDN0:2的氨基酸28至500(本發(fā)明的GH151域)，更優(yōu)選至少575個氨基酸殘基，例如，SEQIDNO:2的氨基酸28至500(本發(fā)明的GH151域)和氨基酸514至615(本發(fā)明的CBM20x域，或其同源序列。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列或其同源序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(例如幾個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段。在一個方面，亞序列含有SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少1419個核苷酸，例如編碼本發(fā)明的GH151域(核苷酸82-1500)的核苷酸，更優(yōu)選至少其1725個核苷酸，例如編碼本發(fā)明的GH151域和CBM20x(核苷酸1540-1845)的核苷酸。等位變體(allelicvariant):術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種(例如幾個)可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純,更優(yōu)選至少20%純,更優(yōu)選至少40%純,更優(yōu)選至少60%純,甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多核苷酸術(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%,更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多O.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%純，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，SP，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當(dāng)用于本文時術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。cDNA:術(shù)語“cDNA”在本文中定義為可通過逆轉(zhuǎn)錄從自真核細(xì)胞獲得的成熟的、剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺乏可存在于相應(yīng)的基因組DNA中的內(nèi)含子序列。該起始的、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其經(jīng)歷一系列步驟，最后作為成熟的、剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱作剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因此，來源于mRNA的cDNA不含任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，其以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段。所述核酸構(gòu)建體亦可為合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence):術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對包含或組成為SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的多肽的任何化學(xué)修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(例如幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(例如幾個)氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當(dāng)用于本文，術(shù)語“人工變體”意指由表達(dá)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的修飾的核苷酸序列，或其同源序列的生物所產(chǎn)生的，具有葡糖淀粉酶活性的多肽。所述修飾的核苷酸序列是通過人為介入修飾SEQIDNO:I中公開的多核苷酸序列或其同源序列獲得的核苷酸序列。具有葡糖淀粉酶活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分離的多肽(在下文中稱為“同源多肽”)，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少61.5%，更優(yōu)選至少63%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少68%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的序列同一性程度。在一個優(yōu)選的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:2的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差九個氨基酸，優(yōu)選相差八個氨基酸，優(yōu)選相差七個氨基酸，優(yōu)選相差六個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，其等位變體。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面,本發(fā)明的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸22至616或其等位變體，或它們具有葡糖淀粉酶活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽的組成為SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體，或它們具有葡糖淀粉酶活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽的組成為SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽的組成為SEQIDN0:2的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽的組成為SEQIDNO:2的氨基酸22至616或其等位變體，或它們具有葡糖淀粉酶活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽的組成為SEQIDN0:2的氨基酸22至616。在另一個方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸22至616。在第二個方面，本發(fā)明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分離的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件，和最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列；(ii)包含SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:I的核苷酸序列，或其亞序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列，或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。可使用甚至更長的探針，例如長度為優(yōu)選至少600個核苷酸，更優(yōu)選至少800個核苷酸，甚至更優(yōu)選至少1000個核苷酸，甚至更優(yōu)選至少1500個核苷酸，或最優(yōu)選至少1800個氨基酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。這些探針涵蓋于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至并且固定于硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料。為了鑒定與SEQIDN0:1，或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用于Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列；包含SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；其全長互補(bǔ)鏈；或它們的亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:I的核苷酸64至1848。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDN0:1。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌DSM23123中的質(zhì)粒AMGI中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌DSM23123中的質(zhì)粒AMGI中包含的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:I的核苷酸82至1500，核苷酸1504至1845。對于長度至少100個核苷酸的長探針，非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200μg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，以及對于非常低和低嚴(yán)格性為25%的甲酰胺，對于中等和中-高嚴(yán)格性為35%的甲酰胺，或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格性為50%的甲酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選在45°C(非常低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選在50°C(低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選在55°C(中等嚴(yán)格性)，更優(yōu)選在60°C(中等-高嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選在65°C(高嚴(yán)格性)，并且最優(yōu)選在70°C(非常高嚴(yán)格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy的計算法(1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)計算的Tni低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP_40,1XDenhardt溶液，ImM焦憐酸鈉(sodiumpyrophosphate),ImM憐酸二氧納(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及由多核苷酸編碼的具有葡糖淀粉酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸包含或組成為如下核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少61.5%，更優(yōu)選至少63%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少68%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性程度，并編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽。參見下文“多核苷酸”部分。在第四個方面，本發(fā)明涉及SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(例如幾個)氨基酸的人工變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為I至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且例如由H.Neuratt^PR.L.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了用20個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，也可用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)取代野生型多肽中的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫腦氨酸、3_和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸?；蛘?，氨基酸變化可為這樣的性質(zhì)，其使得所述多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸變化可改善多肽的熱穩(wěn)定性，改善其底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989，Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即葡糖淀粉酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而確定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來確定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312；Smith等，1992,J.Mol.Biol.224:899-904；fflodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffIing)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；W095/17413;或冊95/22625公開的那些方法來進(jìn)行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991,Biochem.30:10832-10837;美國專利No.5，223，409；W092/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測序。這些方法允許快速確定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入可為最多10個，優(yōu)選最多9個,更優(yōu)選最多8個,更優(yōu)選最多7個,更優(yōu)選最多6個,更優(yōu)選最多5個,更優(yōu)選最多4個,甚至更優(yōu)選最多3個,最優(yōu)選最多2個,并且甚至最優(yōu)選最多I個。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們符合讀框(inframe)，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合蛋白，就切割所述位點，從融合蛋白質(zhì)釋放具有葡糖淀粉酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576;Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等，1995，Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基后通過因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸后通過腸激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989，Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg后通過凝血酶切割(Stevens,2003,DrugDiscoveryWorld4:35-48);Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln后通過TEV蛋白酶切割(Stevens,2003,見上文);和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln后通過基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:I的核苷酸序列或其編碼具有葡糖淀粉酶活性的片段的亞序列。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的多肽由質(zhì)粒AMGI中包含的多核苷酸編碼，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌DSM23123。在一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:I的核苷酸64至1848。具有葡糖淀粉酶活性的多肽的來源本發(fā)明的具有葡糖淀粉酶活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明的具有葡糖淀粉酶活性的多肽可為真菌多肽。舉例而言，所述多肽可為酵母多肽，如具有葡糖淀粉酶活性的酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，畢赤酵母屬(Pichia)，酵母屬(Saccharomyces)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽；或更優(yōu)選具有葡糖淀粉酶活性的絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼屬(Cyphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮抱屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、把齒菌屬(Irpex)、蘑燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂抱屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳燕屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有葡糖淀粉酶活性的AcremoniumceIIuloIytiCUsλ棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金孢子菌(Cgrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChryssosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰色腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(IrpexIacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、托姆青霉(Penicilliumthomii)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、Thielaviaaustraleinsis、Thielaviafimeti、Thielaviamicrospora、Thielaviaovispora、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium)、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱殼(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多妝。在更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有葡糖淀粉酶活性的草酸青霉多肽。在最優(yōu)選的方面，所述多肽是具有葡糖淀粉酶活性的草酸青霉多肽，例如，包含SEQIDN0:2的成熟多肽的多肽?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的身份(identity)。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)0此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，就能夠通過使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有葡糖淀粉酶活性的多肽的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:I。在另一個更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含或組成為大腸桿菌DSM23123中包含的質(zhì)粒AMGI中所含的多核苷酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含或組成為SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，成熟多肽編碼序列為SEQIDNO:I的核苷酸64至1848。在另一個更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含大腸桿菌DSM23123中包含的質(zhì)粒AMGI中包含的成熟多肽編碼序列或由所述成熟多肽編碼序列組成。本發(fā)明還涵蓋編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，所述核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性與SEQIDNO:I或其成熟多肽編碼序列有差異。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:I的亞序列，其編碼SEQIDNO:2的具有葡糖淀粉酶活性的片段。本發(fā)明亦涉及突變體多核苷酸，其包含或組成為有至少一個突變的SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，其中所述突變體核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。所述至少一個突變可為一個或多個(例如一個或幾個)突變。優(yōu)選地，所述至少一個突變是最多10個,優(yōu)選最多9個,更優(yōu)選最多8個,更優(yōu)選最多7個,更優(yōu)選最多6個，更優(yōu)選最多5個，更優(yōu)選最多4個，甚至更優(yōu)選最多3個，最優(yōu)選最多2個，并且甚至最優(yōu)選最多I個突變。優(yōu)選所述突變?yōu)楹塑账崛〈⑷笔Ш?或插入。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見,例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴(kuò)增方法,如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。可以從青霉屬菌株，或其它或相關(guān)生物體克隆多核苷酸，并且因此例如可為所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含或組成為如下核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少61.5%，更優(yōu)選至少63%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少68%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性程度，并編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:I的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991,ProteinExpressionandPurification2:95-107。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進(jìn)行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells,1989，見上文)來鑒定對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進(jìn)行取代的氨基酸殘基。在后一技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，并且測試所得突變分子的葡糖淀粉酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測定，通過如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記這樣的技術(shù)來測定(參見，例如，deVos等,1992,見上文；Smith等,1992,見上文；fflodaver等,1992,見上文)。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，其在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件，和最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；或其等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文中所定義。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明還涉及通過下述方法獲得的分離的多核苷酸(a)將DNA群體在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件，并且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(例如幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯幼有蛄?，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Asperillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W)00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(一種修飾的啟動子，其包含在曲霉屬(Aspergilli)中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在曲霉屬中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實例包括修飾的啟動子，其包含在黑曲霉中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在構(gòu)巢曲霉或米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992，Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，即由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時，是對于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以將在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細(xì)胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相連的信號肽，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列外源的信號肽編碼序列。外源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的?；蛘撸庠葱盘栯木幋a序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。在一個優(yōu)選的方面，所述信號肽包含或組成為SEQIDN0:2的氨基酸I至21。在另一個優(yōu)選的方面，所述信號肽編碼序列包含或組成為SEQIDNO:I的I至63。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基端的前肽。所得多肽稱作酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當(dāng)信號肽和前肽序列二者均存在于在多肽的氨基端時，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基端端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的氨基端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選進(jìn)一步包含啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個或多個(例如幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸序列。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外,可以使用單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個(例如幾個)選擇性標(biāo)記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記為ADE2，HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1，和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’-磷酸脫羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺昔酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氛基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或允許載體在細(xì)為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度序列同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator),其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβI的復(fù)制起點。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點，ARS1，ARS4，ARSI和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175；W000/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成。可以將多于一個拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，且由此含有所述多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。將包含本發(fā)明多核苷酸的構(gòu)建體或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使構(gòu)建體或載體如前所述作為染色體整合體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括親本細(xì)胞的任何后代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬(Nacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)和海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)和脲原體屬(Ureaplasma)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen,1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young和Spizizen,1961,JournalofBacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971，JournalofMolecularBiology56:209-221),電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne,1987，JournalofBacteriology169:5771-5278)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127-6145)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol.(Praha)49:399-405),接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585),或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Tmmun.32:1295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，電穿孑L(參見，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而,可以使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的任何方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。“真菌”用在本文包括以下門子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby，sDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂抱子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上文)。在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。“酵母”用在本文包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport，R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個甚至更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉屬細(xì)胞(Yarrowia)。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卵形酵母細(xì)胞(Saccharomycesoviformis)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(KluyveromycesIactis)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)細(xì)胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在一個甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、德抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、踩節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)或木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)或壤片德抱(Fusariumvenenatum)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑剌煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、干擬錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、剌序側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱殼(Thielaviaterrestris)、長域毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑曲霉(Aspergillusniger)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是米曲霉(Aspergillusoryzae)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Chrysosporiumlucknowense細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是里氏木霉細(xì)胞?？梢詫⒄婢?xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.編,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983，JournalofBacteriology153:163;和Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920。產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是青霉屬(Penicillium)的細(xì)胞。在一個更優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。在一個最優(yōu)選的方面,所述細(xì)胞是草酸青霉,其包含大腸桿菌DSM23123中含有的質(zhì)粒AMGI中的葡糖淀粉酶基因。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNOil的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，該多肽包含或組成為SEQIDN0:2的成熟多肽，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于多肽是特異性的方法來檢測所述多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J._C.Janson和LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有助于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述植物或植物細(xì)胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。植物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其經(jīng)多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有葡糖淀粉酶活性的多肽，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收?；蛘?，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營養(yǎng)價值、適口性(palatabiIity)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties),或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草(grasses),如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium);寒地型牧草(temperategrass),如Agrostis(翦股穎屬)；和谷類,例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是煙草(tobacco),豆類(legumes),如羽扇豆(lupins),馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae)),如花椰菜(cauliflower),油菜桿(rapeseed)和緊密相關(guān)的模式生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber),以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments),如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)外體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無論什么組織來源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代。表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡而言之，通過如下構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞將編碼本發(fā)明多肽的一個或多個(例如幾個)表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。表達(dá)構(gòu)建體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該核苷酸序列所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對于鑒定整合了該表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記，和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達(dá)多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以祀向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對于組成型表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素I和稻肌動蛋白I啟動子(Franck等，1980，Cell21:285-294，Christensen等，1992，PlantMo.Biol.18:675-689；Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889),來自豆球蛋白(Iegumin)Β4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiologyl52:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941),來自歐洲油菜(Brassicanapus)的忙藏蛋白napA啟動子,或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在W091/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番爺?shù)膔bcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991-1000),小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins,1994，PlantMolecularBiology26:85-93),或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，Molecularandgeneralgenetics248:668-674),或傷口誘導(dǎo)的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導(dǎo),例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid),和重金屬。啟動子增強(qiáng)子元件也可以用于實現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動子增強(qiáng)子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動蛋白I基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology8:535；Shimamoto等,1989,Nature338:274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer),是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMolecularBiology19:15-38),而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對于這些植物常常使用其他的轉(zhuǎn)化方法。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992，PlantJournal2:275-281；Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415_428所描述的。其它依照本公開使用的轉(zhuǎn)化方法包括描述于美國專利號6，395，966和7，151，204中的那些(兩者均通過全文提述并入本文)。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇具有并入的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩個獨立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有葡糖淀粉酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。除了用根據(jù)本發(fā)明制備的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化具體植物基因型之外，還可通過將具有本發(fā)明的構(gòu)建體的植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物雜交來制備轉(zhuǎn)基因植物。舉例而言，可將編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽或其部分的構(gòu)建體通過雜交而引入特定植物品種，而根本無需直接轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因此，本發(fā)明不僅涵蓋從依照本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，還包括此類植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本發(fā)明制備的親本植物任何世代的后裔(offspring)。此種后代可包含依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體，或依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體的一部分。雜交導(dǎo)致本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因通過將起始種系與包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的供體植物種系交叉授粉而引入植物種系。此類步驟的非限制性實例進(jìn)一步闡述于美國專利7，151，204號?？紤]包含本發(fā)明的具有葡糖淀粉酶活性的多肽的植物包括通過回交轉(zhuǎn)化的過程生成的植物。舉例而言，本發(fā)明的植物包括稱作回交轉(zhuǎn)化的基因型、種系、近交體(inbred)或雜交體(hybrid)的植物。可使用遺傳標(biāo)記以協(xié)助本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一個遺傳背景基因滲入(introgression)至另一個。標(biāo)記協(xié)助的選擇提供了相對于常規(guī)育種的優(yōu)勢，在于其可用于避免由表型變異導(dǎo)致的錯誤。進(jìn)一步，遺傳標(biāo)記可在特定雜交的個體后代中提供有關(guān)良種種質(zhì)相對程度的數(shù)據(jù)。舉例而言，當(dāng)具有期望性狀但除此之外(otherwise)具有非農(nóng)藝學(xué)期望的遺傳背景的植物與良種親本雜交時，可使用遺傳標(biāo)記來選擇不僅具有該目標(biāo)性狀，還具有相對較大比例期望種質(zhì)的后代。以此方式，使一種或多種性狀基因滲入特定遺傳背景所需的世代數(shù)得到最小化。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽，并優(yōu)選包含載體和/或賦形劑的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語“富含”表示所述組合物的葡糖淀粉酶活性，例如，以至少I.I的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增加。優(yōu)選地，所述組合物配制為提供期望的特征如低色澤，低氣味，和可接受的儲藏穩(wěn)定性。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物?；蛘?，所述組合物可包含多種酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β_半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠水解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。其他的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈次木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知方法將包括于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下文給出了本發(fā)明的多肽或多肽組合物的優(yōu)選用途的實例。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定。葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的組合根據(jù)本發(fā)明的該方面，本發(fā)明的葡糖淀粉酶可與α-淀粉酶組合。優(yōu)選地，酸性α-淀粉酶對葡糖淀粉酶的比例是O.05至5.0AFAU/AGU。更優(yōu)選地，酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性之間的比例為至少O.10，至少O.15，至少O.20，至少O.25，至少O.30，至少O.35，至少O.40，至少O.45，至少O.50，至少O.55，至少O.60，至少O.65，至少O.70，至少O.75，至少O.80,至少O.85，至少O.90,至少O.95，至少I.00,至少I.05,至少I.10,至少I.20，至少I.30，至少I.40，至少I.50，至少I.60，至少I.70，至少I.80，至少I.85，或甚至至少I.90AFAU/A(iU。然而酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性之間的比例應(yīng)優(yōu)選小于4.50，小于4.00，小于3.50，小于3.00，小于2.50，或甚至小于2.25AFAU/A⑶。上述組合物適用于液化、糖化和/或發(fā)酵工藝，優(yōu)選用于淀粉轉(zhuǎn)化，特別是用于產(chǎn)生糖漿和發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。下文給出了本發(fā)明的多肽組合物的優(yōu)選用途的實例。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定。用途本發(fā)明亦涉及本發(fā)明的多肽在液化、糖化和/或發(fā)酵工藝中的用途。所述多肽可用于單個工藝，例如，用于液化工藝、糖化工藝或發(fā)酵工藝。所述多肽亦可用于工藝的組合，例如用于液化和糖化工藝，用于液化和發(fā)酵工藝，或用于糖化和發(fā)酵工藝，優(yōu)選涉及淀粉轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，所述液化、糖化和/或發(fā)酵工藝包括順序或同時進(jìn)行的液化和糖化工藝。在常規(guī)酶液化工藝中，添加熱穩(wěn)定性α-淀粉酶，而長鏈淀粉降解為支化和線性的較短單元(麥芽糊精)，但不添加葡糖淀粉酶。本發(fā)明的葡糖淀粉酶高度熱穩(wěn)定，因此將該葡糖淀粉酶添加于液化工藝是有利的。本發(fā)明的葡糖淀粉酶當(dāng)與α-淀粉酶在液化工藝中組合時具有協(xié)同作用。在常規(guī)糖化過程中，在液化工藝過程中生成的糊精進(jìn)一步受水解以產(chǎn)生低分子糖DP1-3，其可由發(fā)酵生物代謝。所述水解通常使用葡糖淀粉酶進(jìn)行，或者除了葡糖淀粉酶之外，可使用α-葡糖苷酶和酸性α-淀粉酶。當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明的葡糖淀粉酶，潛在地，與α-淀粉酶組合用于液化和/或糖化工藝中，特別是用于同時液化和糖化工藝中時，所述工藝可以以較高溫度進(jìn)行。通過將所述液化和/或糖化工藝在較高溫度進(jìn)行，所述工藝可在較短期限內(nèi)進(jìn)行，或者所述工藝可使用較低的酶劑量進(jìn)行。此外，當(dāng)將液化和/或糖化工藝以較高溫度進(jìn)行時，微生物污染的風(fēng)險減少。含淀粉材料的轉(zhuǎn)化本發(fā)明提供了本發(fā)明的葡糖淀粉酶用于從淀粉產(chǎn)生葡萄糖等的用途。一般而言，所述方法包括單獨使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶或在α-淀粉酶存在下使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶來部分水解前體淀粉的步驟。本發(fā)明的葡糖淀粉酶亦可與僅水解包含至少四個糖基殘基的分子中的α-(1，6)-葡糖苷鍵的酶組合使用。優(yōu)選地，本發(fā)明的葡糖淀粉酶與普魯蘭酶或異淀粉酶組合使用。異淀粉酶和普魯蘭酶在淀粉脫支中的用途，這些酶的分子性質(zhì)，和這些酶與葡糖淀粉酶一起的潛在用途描述于G.Μ.A.vanBeynum等，StarchConversionTechnology,MarcelDekkerjNewYork,1985，101-142。在一個進(jìn)一步的方法，本發(fā)明涉及本發(fā)明的葡糖淀粉酶在淀粉轉(zhuǎn)化中的用途。此外，本發(fā)明的葡糖淀粉酶可用于包括連續(xù)糖化工藝的連續(xù)淀粉轉(zhuǎn)化工藝。糖漿、飲料和/或發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)本發(fā)明的葡糖淀粉酶的用途包括將淀粉轉(zhuǎn)化為例如糖漿飲料，和/或發(fā)酵產(chǎn)物，包括乙醇。本發(fā)明亦提供了使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶從含淀粉材料產(chǎn)生糖漿，如葡萄糖等的工藝。合適的起始材料例示于“含淀粉材料”部分。一般而言，所述工藝包括下述步驟在單獨的本發(fā)明葡糖淀粉酶或其與α-淀粉酶的組合的存在下部分或完全地水解含淀粉材料(液化和/或糖化)以從淀粉或相關(guān)的寡糖和多糖分子的非還原端釋放葡萄糖。本發(fā)明的葡糖淀粉酶亦可以以固定化的形式使用。這適用于并常常用于產(chǎn)生特種糖漿如麥芽糖糖漿，以及與果糖糖漿例如高果糖糖漿(HFS)相關(guān)的寡糖的萃余液流中。本發(fā)明的葡糖淀粉酶亦可用于產(chǎn)生多種飲料，如但不限于，番茄、馬鈴薯、甜薯(Chinesepotato)、甘薯和/或南瓜的飲料。發(fā)酵產(chǎn)物術(shù)語“發(fā)酵產(chǎn)物”意指通過包括使用發(fā)酵生物的發(fā)酵工藝的工藝產(chǎn)生的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明涵蓋的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇(例如，阿拉伯糖醇(arabinitol)、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1，3_丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；烷烴(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；環(huán)烷烴(例如，環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)庚烷和環(huán)辛烷)；烯烴(例如，戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO));抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素，B12,β-胡蘿卜素)；和激素。在一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇，例如燃料乙醇；飲用乙醇，即，可飲用的中性酒；或工業(yè)乙醇或用于可飲用醇類工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工業(yè)(例如，發(fā)酵的乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)的產(chǎn)物。優(yōu)選的啤酒類型包括愛兒啤酒(ale)、烈性啤酒(stout)、缽爾透黑啤酒(porters)、陳忙啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麥芽酒(maltliquors)、發(fā)泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcoholbeer)、低醇啤酒(low-alcoholbeer)、低熱量啤酒(low-caloriebeer)或清淡啤酒(lightbeer)。使用的優(yōu)選發(fā)酵工藝包括醇發(fā)酵工藝,其是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選的發(fā)酵工藝為厭氧發(fā)酵工藝，其是本領(lǐng)域公知的。釀造本發(fā)明的葡糖淀粉酶高度熱穩(wěn)定，并因此其可用于需要高溫下淀粉水解的工業(yè)。舉例而言，本發(fā)明的葡糖淀粉酶可用于釀造工業(yè)。本發(fā)明的葡糖淀粉酶以有效量添加，其可方便地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。液化、糖化和/或發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生在此方面，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料產(chǎn)生液化、糖化和/或發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，包括下述步驟用本發(fā)明的多肽處理含淀粉材料。合適的含淀粉起始材料列于下文“含淀粉材料”部分。涵蓋的酶列于下文“酶”部分。優(yōu)選地，本發(fā)明的工藝包括用單獨的本發(fā)明多肽或其與α-淀粉酶一同處理含淀粉材料。優(yōu)選地，用本發(fā)明的多肽(單獨或在α-淀粉酶存在下)處理含淀粉材料的步驟是在40°C至100°C，優(yōu)選65°C至90°C，更優(yōu)選80°C至85°C進(jìn)行，和/或在2.O至7.O的pH，優(yōu)選pH4.O至pH6.0，更優(yōu)選pH4.5至pH5.5進(jìn)行。本發(fā)明的液化和/或糖化產(chǎn)物是糊精，或低分子糖例如DP1-3。在液化工藝中，淀粉至葡萄糖、糊精和/或低分子量糖的轉(zhuǎn)化通過添加本發(fā)明的葡糖淀粉酶而增強(qiáng)。發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇可任選地在發(fā)酵之后例如通過蒸餾來回收。發(fā)酵優(yōu)選在酵母，優(yōu)選在酵母屬的菌株的存在下進(jìn)行。合適的發(fā)酵生物列于下文的“發(fā)酵生物”部分。在發(fā)酵產(chǎn)物特別是乙醇的產(chǎn)生中，最廣泛使用的工藝是同時糖化和發(fā)酵(SSF)工藝，其中可將發(fā)酵生物如酵母，和糖化酶一同添加。SSF通常在25°C至40°C，如29°C至35°C，如30°C至34°C，如大約32°C的溫度進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明在發(fā)酵過程中可將溫度調(diào)高或調(diào)低。本發(fā)明的葡糖淀粉酶當(dāng)用于液化工藝時可良好地增強(qiáng)乙醇產(chǎn)生。本發(fā)明的葡糖淀粉酶當(dāng)與α-淀粉酶一同添加時，可加速發(fā)酵速率，且亦可增加最終乙醇效價。常規(guī)糖化可使用本領(lǐng)域公知的條件進(jìn)行。舉例而言，完整的糖化工藝可持續(xù)高至約24至72小時，然而，通常僅在30至65°C，通常約60°C的溫度進(jìn)行通常40至90分鐘的預(yù)糖化，接著在同時糖化和發(fā)酵(SSF)的發(fā)酵過程中進(jìn)行完全糖化。糖化通常在30至65°C，通常大約60°C的溫度進(jìn)行。本發(fā)明的葡糖淀粉酶高度熱穩(wěn)定，因此本發(fā)明的預(yù)糖化和/或糖化可在與常規(guī)預(yù)糖化和/或糖化相比更高的溫度進(jìn)行。在一個實施方案中，本發(fā)明的工藝包括在同時糖化和發(fā)酵(SSF)工藝之前預(yù)糖化含淀粉材料。預(yù)糖化可在高溫進(jìn)行(例如50至85°C，優(yōu)選60至75V)，然后移至SSF。含淀粉材料可通過減少粒徑，優(yōu)選通過濕法磨制，減少至O.05至3.Omm,優(yōu)選O.I至O.5mm來制備。在對其進(jìn)行本發(fā)明的工藝之后,至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，優(yōu)選至少99%，并且甚至更優(yōu)選100%的含淀粉材料的干固形物轉(zhuǎn)化為可溶性淀粉水解物。在一個實施方案中，本發(fā)明的工藝包括在本發(fā)明的葡糖淀粉酶的存在下糖化含淀粉材料，例如DEll(右旋糖當(dāng)量11)麥芽糊精，以產(chǎn)生糖，其可由合適的發(fā)酵生物發(fā)酵為期望的發(fā)酵產(chǎn)物。所述發(fā)酵工藝可進(jìn)行I至250小時，優(yōu)選25至190小時，更優(yōu)選30至180小時，更優(yōu)選40至170小時，甚至更優(yōu)選50至160小時，仍更優(yōu)選50至130小時的期間?？芍苽浜矸鄄牧先缌畹矸鄣臐{料，其具有10至55被％含淀粉材料的干固形物(DS)，優(yōu)選25至40wt%干固形物，更優(yōu)選30至35wt%干固形物。所述漿料可含有水和/或工藝水(processwater),如爸懼物(逆流(backset))、洗漆水(scrubberwater)、蒸發(fā)器冷凝液或懼出物、來自蒸懼的側(cè)線汽提器水(side-stripperwater)或其他發(fā)酵產(chǎn)物設(shè)備(plant)的工藝水。在對其進(jìn)行本發(fā)明的工藝之后，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，優(yōu)選至少99%，并且甚至更優(yōu)選100%的含淀粉材料的干固形物轉(zhuǎn)化為可溶性淀粉水解物。含淀粉材料根據(jù)本發(fā)明，可使用任何合適的含淀粉的起始材料，包括粒狀淀粉。所述起始材料通?；谄谕陌l(fā)酵產(chǎn)物而選擇。適用于本發(fā)明工藝的含淀粉的起始材料的實例包括塊莖、根、莖、全谷粒、玉米、玉米穗軸、小麥、大麥、黑麥、買羅高粱、西米、木薯、樹薯、高粱、稻、豌豆(pea)、豆(bean)或甘薯，或它們的組合，或谷類，含糖的原材料如糖蜜，果物材料，甘蔗或糖甜菜，馬鈴薯，以及含纖維素材料，如木質(zhì)或植物殘余物，或其組合。涵蓋蠟質(zhì)和非蠟質(zhì)兩者類型的玉米和大麥。發(fā)酵牛物“發(fā)酵生物”指任何適用于發(fā)酵工藝并能夠產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物的生物，包括細(xì)菌和真菌生物。特別合適的發(fā)酵生物能夠?qū)⑻侨缙咸烟腔螓溠刻侵苯踊蜷g接發(fā)酵(即轉(zhuǎn)化)為期望的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵生物的實例包括真菌生物，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種，特別是釀酒酵母的菌株。商業(yè)上可獲得的酵母包括例如RedStar/LesaffreEthanolRed(可從RedStar/Lesaffre,USA獲得)，F(xiàn)ALI(可從BurnsPhilpFoodInc.，USA的分支機(jī)構(gòu)Fleischmann’sYeast獲得)，SUPERSTART(可從Alltech獲得)，GERTSTRAND(可從GertStrandAB,Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。酶葡糖淀粉酶葡糖淀粉酶優(yōu)選為本發(fā)明的葡糖淀粉酶。然而如上所述，本發(fā)明的葡糖淀粉酶亦可與其他葡糖淀粉酶組合。葡糖淀粉酶可以以0.001至10AGU/gDS，優(yōu)選0.01至5AGU/gDS，如大約0.05，0.1，0·3，0·5，I或2AGU/gDS,特別是0.05至0.5AGU/gDS或0.02_20AGU/gDS，優(yōu)選0.l-10AGU/gDS的量添加。α-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明α-淀粉酶可為任何來源的。優(yōu)選真菌或細(xì)菌來源的α-淀粉酶。在一個優(yōu)選的方面，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如真菌酸性α-淀粉酶或細(xì)菌酸性α-淀粉酶。術(shù)語“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加、在pH范圍3至7，優(yōu)選3.5至6，或更優(yōu)選4至5具有最優(yōu)活性的α-淀粉酶(EC3.2.I.I)。細(xì)菌α-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，細(xì)菌α-淀粉酶優(yōu)選來源于芽孢桿菌屬。在一個優(yōu)選的方面，所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶來源于地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株，但亦可來源于其他芽孢桿菌菌種。涵蓋的α-淀粉酶的具體實例包括示于WO99/19467中SEQIDNO:4的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(BLA)，示于WO99/19467中SEQIDNO:5的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(BAN)，和示于WO99/19467中SEQIDNO:3的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(BSG)。在一個本發(fā)明的實施方案中，所述α-淀粉酶為分別與WO99/19467中示為SEQIDNO:1、2、3、4或5的任何序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性的同一性程度的酶。所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶亦可為變體和/或雜合體，特別是WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和TO02/10355(所有文獻(xiàn)通過提述并入本文)任一篇中所描述的。具體而言，涵蓋的α-淀粉酶變體公開于美國專利號6，093，562,6,297，038或美國專利號6，187，576(通過提述并入本文)，并包括在位置179至182具有一個或兩個氨基酸缺失的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)變體，所述缺失優(yōu)選為WO1996/23873中公開的雙缺失(參見，例如第20頁第1_10行，通過提述并入本文)，優(yōu)選與WO99/19467中公開的SEQIDNO:3中所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比對應(yīng)于Λ(181-182)，或使用WO99/19467(通過提述并入本文)中SEQIDNO:3的編號方式的氨基酸179和180的缺失。甚至更優(yōu)選的是與WO99/19467中公開的SEQIDNO:3中所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有對應(yīng)于Λ(181-182)的雙缺失，并進(jìn)一步包含N193F取代(亦表示為I181*+G182*+N193F)的芽孢桿菌屬α-淀粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶。所述α-淀粉酶亦可為產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶。“產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麥芽水解酶，EC3.2.I.133)能夠?qū)⒅辨湹矸酆椭ф湹矸?amylopectin)水解為α-構(gòu)型的麥芽糖。一種來自嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株NCIB11837的產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶商業(yè)上可從NovozymesA/S,Denmark獲得。產(chǎn)麥芽糖α_淀粉酶描述于美國專利號4，598，048,4,604，355和6，162，628，其通過提述并入本文。細(xì)菌雜合α-淀粉酶具體涵蓋的雜合α-淀粉酶包含地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(示為WO99/19467中的SEQIDNO:4)的445個C端氨基酸殘基和來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶(示為WO99/194676中的SEQIDNO:3)的37個N端氨基酸殘基，并具有一個或多個，特別是所有的下述取代G48A+T49I+G107Α+Η156Υ+Α181Τ+Ν190F+I201F+A209V+Q264S(使用地衣芽孢桿菌編號)。亦優(yōu)選具有一個或多個下述突變(或其他芽孢桿菌屬α-淀粉酶骨架中對應(yīng)的突變)的變體H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S，和/或位置176和179之間兩個殘基的缺失，優(yōu)選缺失E178和G179(使用WO99/19467的SEQIDNO:5的編號方式)。真菌α-淀粉酶真菌酸性α-淀粉酶包括來源于曲霉屬菌株的酸性α-淀粉酶，如米曲霉、黑曲霉或川地曲霉α-淀粉酶。優(yōu)選的酸性真菌α-淀粉酶是Fungamyl樣α-淀粉酶,其優(yōu)選來源于米曲霉的菌株。在本公開中，術(shù)語“Fungamyl樣α-淀粉酶”指與示于WO96/23874的SEQIDNO:10的氨基酸序列的成熟部分呈現(xiàn)高同一性，即高于70%，高于75%，高于80%，高于85%，高于90%，高于95%，高于96%，高于97%，高于98%，高于99%或甚至100%同一性的α-淀粉酶。另一種優(yōu)選的酸性α-淀粉酶來源于黑曲霉菌株。在一個優(yōu)選的方面，所述酸性真菌α-淀粉酶是來自黑曲霉、作為“AMYAASPNG”以初級登錄號Ρ56271公開于Swiss-prot/TeEMBL數(shù)據(jù)庫并更具體描述于WO89/01969(實施例3)的α-淀粉酶。所述酸性黑曲霉酸性α-淀粉酶在WO2004/080923(Novozymes)(通過提述并入本文)亦顯示于SEQIDNO:I。還涵蓋了所述酸性真菌淀粉酶與WO2004/080923中的SEQIDNO:I具有至少70%同一性，如至少80%或甚至至少90%同一性，如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的變體。在一個優(yōu)選的方面，所述α-淀粉酶來源于川地曲霉，并公開于Kaneko等，J.Ferment.Bioeng.81:292-298(1996)“Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stablealpha—amylasefromAspergilluskawachii〃；并進(jìn)一步作為EMBL:#AB008370公開。所述真菌酸性α-淀粉酶亦可為包含糖結(jié)合模塊(CBM)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非雜合體)，或其變體。在一個實施方案中，所述野生型酸性α-淀粉酶來源于川地曲霉的菌株。酸性α-淀粉酶可根據(jù)本發(fā)明以O(shè).01至10AFAU/gDS,優(yōu)選O.01至5AFAU/gDS，特別是O.02至2AFAU/gDS的量添加。真菌雜合α-淀粉酶在一個優(yōu)選的方面，所述真菌酸性α-淀粉酶是雜合α-淀粉酶。真菌雜合α-淀粉酶的優(yōu)選實例包括WO2005/003311或美國專利發(fā)明者李明,段俊欣,劉崢,福山志朗,綾部圭,G.科沃德-凱利,R.戴因哈默申請人:諾維信公司