專利名稱：無毛nod scid小鼠的制作方法
技術領域：
本公開內容概括而言涉及生物醫(yī)學研究。更具體地，本公開內容涉及具有用于生物醫(yī)學研究的遺傳優(yōu)勢的小鼠。 背景和簡述
在小鼠和大鼠中有數以百計的病理學突變體，其中的許多是為了生物醫(yī)學研究的目的。突變小鼠通常用于專門的研究和開發(fā)項目。突變小鼠可用遠交或近交遺傳背景維持，其性質賦予遺傳優(yōu)勢或劣勢。例如,遠交HsdCpb:NMRI背景下的無胸腺裸基因產生相對強壯的動物，而在具有BALB/cOlaHsd背景下的小鼠中相同突變產生不太強壯的動物。Prkdcscid為編碼DNA活化蛋白激酶(Prkdc)催化亞基的基因的突變，導致重度聯合免疫缺陷(scid)(綜述見Bosma和Carroll，1991)。其為常染色體隱性突變，由于產生B和T細胞受體所必需的可變、多樣和連接的(VDJ)重組酶系統缺陷使B細胞和T細胞祖細胞分化中斷。Prkdc突變的小鼠缺乏Thy-I陽性樹突表皮細胞。與裸鼠不同的是，
突變小鼠具有胸腺和淋巴結。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠為I型糖尿病動物模型，其顯示對自身免疫性T細胞介導的胰島素依賴性糖尿病(IDDM)自發(fā)發(fā)生的易感性。NOD品系和相關品系由Makino及其同事在日本Aburahi的Shionogi研究實驗室開發(fā)，并且在1980年首次報道(Makino等，1980)。此外，NOD品系通常特征在于自然殺傷(NK)細胞功能缺陷、骨髓發(fā)育和功能以及抗原呈遞細胞(APC)分化和功能缺陷、抑制溶血補體的經典和替代途徑的C5缺陷(Greiner等，1998)。攜帶/突變的小鼠品系雖然顯示B和T細胞功能缺乏，但表現出正常水平的NK細胞、溶血補體和骨髓功能。此外，隨小鼠變老各種背景品系的突變體產生低水平的免疫球蛋白和功能性T細胞，這一現象被稱為“滲漏(leakiness)”。這些先天免疫性質對某些研究應用，特別是人腫瘤細胞系的移入是不利的。Prkdcscid突變已經由C. B-17背景轉移至糖尿病易感的非肥胖性糖尿病(NOD)背景，被稱為NOD scid.與通常的NOD小鼠不同的是，自身免疫性糖尿病并非由于T細胞功能缺乏而發(fā)生。NOD scid小鼠的特征進一步在于NK細胞功能缺陷、巨噬細胞缺陷和可檢測的溶血補體缺乏(Greiner等，1998)。此外，與多種遺傳背景下的其它scid小鼠相比，由VDJ重組酶活性的不完全阻斷(其導致殘留B和T細胞活性)引起的純合scid小鼠的“滲漏”表型在本模型中被抑制。這些特征對涉及移植細胞的長期生長的研究是有利的。例如，人細胞系例如PC-3、DU145以及⑶-34陽性干細胞可在NOD scid小鼠中有效地長期生長，但在NK細胞功能、巨噬細胞和循環(huán)補體(其可影響腫瘤生長或人干細胞移入)正常的其它scid小鼠中不能。NOD scid小鼠的免疫概況使其可用于腫瘤學、免疫學、血液學、HIV病理學和其它領域的生物醫(yī)學研究。盡管適合多數應用，但NOD scid小鼠顯示的一些特征可對某些研究目的不利。例如，NOD scid小鼠具有白化毛的完全皮毛，因此在接種細胞前須將毛刮去，隨后的腫瘤顯示和成像比無毛模型困難。此外，甚至在刮去有 毛小鼠的毛后，也殘留毛囊，這可產生自身熒光，干擾使用生物發(fā)光和熒光報告物的成像研究。與裸鼠不同，無毛純合突變體缺乏毛囊(Lyon等，1996)，因此消除了其它異種移植模型中出現的毛囊自身熒光。本文描述了 NOD SCid小鼠的改進，其如下進行JfNOD scid小鼠與攜帶無毛基因(Nr)突變的小鼠雜交并與NOD scid遺傳背景回交得到無毛NOD scid小鼠品系。本文公開的無毛NOD scid小鼠對異種移植、自發(fā)性腫瘤、癌細胞腫瘤發(fā)生、腫瘤血管發(fā)生、腫瘤轉移潛能、腫瘤抑制治療、致癌調控、腫瘤成像和人干細胞移入的研究尤其有利?？紤]下述多個實施方案
I)非肥胖糖尿病(NOD)背景下具有B細胞、T細胞、NK細胞、巨噬細胞和補體缺陷的無毛、免疫缺陷小鼠。2)條款I的小鼠，其中所述小鼠為等位基因純合的。3)條款2的小鼠,其中所述/ 士/c等位基因為(Prkdccld) 04)條款1-3中任一項的小鼠，其中所述小鼠為I等位基因純合的。5)條款4的小鼠，其中所述汝等位基因為Ar (Jirhr)06)條款1-5中任一項的小鼠，其中所述非肥胖糖尿病背景為NOD. QMl-Prkdcscid。7)條款1-5中任一項的小鼠，其中非肥胖糖尿病背景為NOD. Cmi-Prkdcscid/NCrHsd08)條款1-7中任一項的無毛小鼠，進一步具有樹突細胞缺陷，其中所述樹突細胞缺陷為與相同背景的非無毛免疫缺陷小鼠相比樹突細胞的數目減少。9)生產非肥胖糖尿病(NOD)背景下無毛、免疫缺陷小鼠的方法，所述方法包括
(a)將等位基因純合的NODscid小鼠品系與/Zr等位基因純合的第二小鼠品系雜交，以產生I等位基因和等位基因均雜合的子代；
(b)將步驟(a)產生的雜合子代與NODscid小鼠互交；
(c)選擇步驟(b)中等位基因純合并具有更類似于NODscid的基因型的后代；
(d)將步驟(c)中選擇的后代與/Zr等位基因純合或雜合的小鼠雜交。10)條款9的方法,其中所述等位基因為(Prkdcscld)。11)條款9-10中任一項的方法，其中所述I等位基因為Ar Qlrhr)。12)條款9-11中任一項的方法，其中使用以下方法對步驟(a)產生的子代進行基因型分析
單核苷酸多態(tài)性等位基因鑒別(discrimination)、聚合酶鏈反應和單核苷酸多態(tài)性概況分析(profiling)。13)條款9-12中任一項的方法，其中步驟(a)和(b)的NOD scid小鼠為N0D.CBHtdTMcsW 小鼠。14)條款9-12中任一項的方法，其中步驟(a)和(b)的NOD scid小鼠為N0D.CB17-Prkdcscid/}\CrWsd-PrkcIcSCId 小鼠。
15)條款9-14中任一項的方法，其中步驟(a)的第二小鼠品系為MF_l_Ar小鼠。附圖簡述
圖I顯示雄性和雌性NOD scid和Hr NOD scid小鼠的腸系膜淋巴結(上部)和脾(下部)的組織切片。圖2顯示⑶49b的流式細胞術(FACS)結果的點圖。象限中的數字為平均百分比。圖3顯示⑶Ilc的流式細胞術(FACS)結果的點圖。象限中的數字為平均百分比。圖4顯示⑶3e和⑶49b的流式細胞術(FACS)結果的點圖。象限中的數字為平均百分比。圖5顯示⑶3e和⑶49b的流式細胞術(FACS)結果的點圖。象限中的數字為平均百分比。圖6顯示⑶3e和⑶8 α的流式細胞術(FACS)結果的點圖。象限中的數字為平均百分比。圖7顯示⑶49b的流式細胞術(FACS)結果的點圖。象限中的數字為平均百分比。圖8顯示⑶49b的流式細胞術(FACS)結果的點圖。象限中的數字為平均百分比。圖9顯示從異種移植入Hr NOD scid小鼠中的人套細胞淋巴瘤細胞系JEK0-1的腫瘤發(fā)生。

圖10顯示從異種移植入無胸腺裸鼠中的人套細胞淋巴瘤細胞系JEK0-1的腫瘤發(fā) 生。圖11顯示從異種移植入無全身照射的Hr NOD scid小鼠中的人大細胞淋巴瘤細胞系KARPAS-299的腫瘤發(fā)生。發(fā)明詳述
盡管本發(fā)明可以有各種修飾和替代形式，但本文將詳細描述特定實施方案。然而，應理解的是，其無意將本發(fā)明限制在所描述的特定形式，恰恰相反，意圖是涵蓋落入本發(fā)明范圍的所有修飾、等同物和替代方案。說明書全文中使用的以下術語意欲具有下列含義
如本文所使用的，短語“更類似于NOD scid”指在特定的世代中具有比同代其它小鼠更類似NOD scid品系的基因型的小鼠。其可例如，通過單核苷酸多態(tài)性分析定量。本文公開了無毛NOD scid小鼠的生產。無毛NOD scid小鼠對于利用異種移植、自發(fā)性腫瘤、癌細胞腫瘤發(fā)生、腫瘤血管發(fā)生、腫瘤轉移潛能、腫瘤抑制治療、致癌調控、腫瘤成像和人干細胞移入的生物醫(yī)學研究和開發(fā)實驗尤其有利。NOD scid 小鼠
突變已經從C.B-17背景轉移至糖尿病易感的非肥胖糖尿病(NOD)背景，被稱為NOD scid。NOD scid突變小鼠由國家癌癥研究所(National Cancer Institute),Frederick, Maryland 于 2004 從國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health),Bethesda, Maryland接收。NOD scid具有影響T細胞和B細胞發(fā)育的重度聯合免疫缺陷(scid).與典型NOD小鼠不同的是，自身免疫性糖尿病不因為T細胞功能缺乏而發(fā)生。NODscid小鼠的特征進一步在于具有NK細胞功能缺陷、巨噬細胞缺陷以及無循環(huán)補體。NODscid小鼠對機會致病菌易感，并且具有隨年齡增加的胸腺淋巴瘤發(fā)病率。無毛(Hr)小鼠純合的Qir/hr)小鼠具有正常的皮毛，直至約10天齡，此時開始脫毛。盡管稀疏的毛生長以每月一次的間隔出現，但小鼠在5-6周齡時基本為無毛的。完整的毛從毛囊消失(Crew和Mirskaia，1931)。觸須重復脫落，并且隨年齡增長變得更加異常。無毛基因為甲狀腺激素應答基因和甲狀腺激素受體的輔阻遏物，介導甲狀腺激素在腦和皮膚的作用(Potter等，2001)。這些小鼠的趾甲往往長而彎曲。一般而言，維持無毛小鼠不需要特殊的飼養(yǎng)程序。除了偶爾的皮膚膿腫，其對感染的易感性通常不增加。然而，無毛小鼠確實有輕度免疫缺陷，可能是由于T-輔助細胞缺陷(Reske-Kunz等，1979)。與A/>々小鼠相比,Ar/fer具有高白血病發(fā)病率(Heiniger等，1974)并伴隨免疫缺陷和受損的移植物抗宿主(GVH)反應(L’Anson和Gasser，1973)。無毛小鼠中缺陷的免疫功能與淋巴瘤發(fā)生的關聯可由于該突變體對同源淋巴瘤細胞和純化小鼠白血病病毒(MuLV)的免疫反應降低(Johnson和Meier，1981)。此外，已證明該突變體的脾T細胞對I區(qū)同種異體抗原的增殖反應降低(Morrissey等，1980)。此夕卜，已經發(fā)現在脾中Ly-I+和Ly-123+ T細胞的正常比例反轉(Reske-Kunz等，1979)?！慕M織病理學上看，從約14天開始無毛小鼠毛管上部的復層上皮角化過度。杵狀毛(Hair club)形成是異常的，且內部根鞘在毛干末端部分周圍聚結，使毛鞘下部不能隨杵狀毛上升而上升，進而滯留在真皮。胞囊從兩個源頭發(fā)育，即角化過度的毛管上部和滯留在真皮的異常毛囊的鞘(Fraser，1946 ;Mann，1971)。Fukui等，1975描述了無毛小鼠中的腎小球變化。無毛小鼠可生育，但大多數雌性不能很好地哺乳其幼仔。最有效的繁育系統使用純合的突變體雄性和雜合的雌性(ILAR，1989)。NK細胞、巨噬細胞和補體功能的存在可影響腫瘤細胞植入后的初期腫瘤生長和轉移擴散。各種造血癌細胞系在不同動物模型中的腫瘤生長速率的比較研究顯示在B細胞、T細胞、NK細胞、巨噬細胞和補體缺陷的模型中獲得較好的生長速率，如在無毛NOD scid小鼠模型中出現的。此外，相對于其它原位小鼠模型，無毛NOD scid小鼠具有高轉移潛能。無毛NOD scid小鼠是異種移植和人源化研究的有用模型，并且與其它遺傳背景的scid突變體相比具有遺傳和表型優(yōu)勢。在一個實施方案中，公開了非肥胖糖尿病(NOD)背景的無毛、免疫缺陷小鼠。該無毛免疫缺陷小鼠具有B細胞、T細胞、NK細胞、巨噬細胞和補體缺陷。此外，該無毛免疫缺陷小鼠出人意料地具有樹突細胞缺陷，其中與有毛的NOD scid小鼠相比，無毛NOD scid小鼠的樹突細胞數目減少。樹突細胞的減少導致更大程度的免疫缺陷，其對于涉及異種移植、自發(fā)性腫瘤、癌細胞腫瘤發(fā)生、腫瘤血管發(fā)生、腫瘤轉移潛能、腫瘤抑制治療、致癌調控、腫瘤成像和人干細胞移入的實驗可為有利的。
實施例實施例選擇育種以生產無毛NOD scid小鼠
按照表I所示繁育小鼠。概括來說，其步驟如下(突變等位基因的存在用符號+表示)步驟⑴用純合的NOD scid {Prkdc +/+)小鼠繁育純合的無毛(/Zr勹小鼠。優(yōu)選/Zr小鼠為雄性，這是因為Hr雌性可顯示較差的母性特征。步驟I產生的Fl小鼠全部為雜合的-,Hr+/_。步驟(2):選擇NOD scid雜合雄性，將其與NOD scid Prkdc +/+純合雌性回交。N2小鼠為基因型的混合。通過PCR檢測后代中/Zr基因的存在情況，通過單核苷酸多態(tài)性等位基因鑒別檢測后代中基因的存在情況，通過單核苷酸多態(tài)性概況分析檢測后代中NOD scid遺傳背景。步驟(3):選擇具有至少80. 8% NOD scid遺傳背景并且純合(Prkdc +/+)和 雜合(Jlr +/1的雄性和雌性，相應地用NOD scid雄性或雌性繁育它們。步驟⑷通過PCR檢測后代中汝基因的存在情況，通過單核苷酸多態(tài)性概況分析檢測后代中NOD scid遺傳背景。選擇具有至少94% NOD scid遺傳背景并且/^知/c純合(PrAdc +/+)和雜合Qir +/1的雄性和雌性，相應地用NOD scid雄性或雌性繁育它們。步驟(5):通過PCR檢測后代中I基因的存在情況，通過單核苷酸多態(tài)性概況分析檢測后代中NOD scid遺傳背景。選擇具有至少99% NOD scid遺傳背景并且/^知/c純合 (PrAdc +/+)和雜合Qir +/1的雄性和雌性，相應地用NOD scid雄性或雌性繁育它們。步驟(6):通過PCR檢測后代中I基因的存在情況，通過單核苷酸多態(tài)性概況分析檢測后代中NOD scid遺傳背景。選擇具有基本上100% NOD scid遺傳背景并且純合{Prkdc +/+)和雜合Qlr +勺的雄性和雌性，相應地用NOD scid雄性或雌性繁育它們。步驟(7):繁育步驟6得到的小鼠以建立無毛NOD scid群體。Prkdc叛令(Prkdc+/+)和汝純合(Jlr +/+)的雄性可用純合(Prkdc +/+)和汝純合Qir +/+)或雜合Qir+/1的雌性繁育。表I :生產無毛NOD scid小鼠的繁育圖解
權利要求
1.非肥胖糖尿病(NOD)背景下的無毛、免疫缺陷小鼠，其具有B細胞、T細胞、NK細胞、巨 噬細胞和補體缺陷。
2.權利要求I的小鼠，其中所述小鼠為等位基因純合的。
3.權利要求2的小鼠，其中所述等位基因為scid(Prkdccld)。
4.權利要求1-3中任一項的小鼠，其中所述小鼠為/Zr等位基因純合的。
5.權利要求4的小鼠，其中所述I等位基因為ArQirhr).
6.權利要求1-5中任一項的小鼠，其中所述非肥胖糖尿病背景為NOD.QMl-Prkdcscid。
7.權利要求1-6中任一項的無毛小鼠，進一步具有樹突細胞缺陷，其中所述樹突細胞缺陷為與相同背景而非無毛的免疫缺陷小鼠相比樹突細胞的數目減少。
8.生產非肥胖糖尿病(NOD)背景下的無毛、免疫缺陷小鼠的方法，所述方法包括 (a)將等位基因純合的NODscid小鼠品系與/Zr等位基因純合的第二小鼠品系雜交，以產生I等位基因和等位基因均雜合的子代； (b)將步驟(a)產生的雜合子代與NODscid小鼠互交；(c)選擇步驟(b)中等位基因純合并具有更類似于NODscid的基因型的后代； (d)將步驟(c)中選擇的后代與/Zr等位基因純合或雜合的小鼠雜交。
9.權利要求8的方法，其中所述等位基因為scid(Prkdcscld)。
10.權利要求8-9中任一項的方法，其中所述I等位基因為ArQirhr)。
11.權利要求8-10中任一項的方法，其中使用選自以下的方法對步驟(a)產生的子代進行基因型分析 單核苷酸多態(tài)性等位基因鑒別、聚合酶鏈反應和單核苷酸多態(tài)性概況分析。
12.權利要求8-11中任一項的方法，其中步驟(a)和(b)的NODscid小鼠為N0D.CBHtdTMcsW 小鼠。
13.權利要求8-12中任一項的方法，其中步驟(a)的第二小鼠品系為MF-I-Ar小鼠。
全文摘要
本文公開了非肥胖糖尿病(NOD)背景下的無毛、免疫缺陷小鼠及其生產方法。所述小鼠為無毛的，并且具有多重免疫缺陷，包括B細胞和T細胞缺陷，以及受損的巨噬細胞和補體功能。所述小鼠還在免疫系統的自然殺傷細胞和樹突細胞中具有進一步的缺陷。所述小鼠可用于生物醫(yī)學研究，例如涉及異種移植、自發(fā)性腫瘤、癌細胞腫瘤發(fā)生、腫瘤血管發(fā)生、腫瘤轉移潛能、腫瘤抑制治療、致癌調控和腫瘤成像的研究。
文檔編號C12N15/00GK102971420SQ201180029157
公開日2013年3月13日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權日2010年4月14日
發(fā)明者S.維爾德特 申請人:哈倫實驗室有限公司