專利名稱：Ect2肽及包含它們的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體的說是癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及作為癌癥疫苗極為有用的新肽，以及用于治療和預(yù)防腫瘤的藥物。_2] 優(yōu)先權(quán)
本申請要求2010年4月2日提交的美國臨時申請61/320，577的權(quán)益，通過述及將其全部內(nèi)容收入本文。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證明，⑶8陽性CTL可識別主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I類分子上出現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細胞。從TAA的第一個例子——黑素瘤抗原(MAGE)家族被發(fā)現(xiàn)起，人們主要通過免疫學(xué)手段(NPL I, Boon T, Int J Cancer 1993 May 8，54(2):177-80;NPL 2,Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar1,183(3) : 725-92)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA。這些TAA中的一些目前正在作為免疫治療靶標(biāo)接受臨床開發(fā)。
有利的TAA對于癌細胞的擴增和存活而言是不可或缺的。使用這樣的TAA作為免疫治療的靶標(biāo)，可以最大程度的減小人們熟知的癌細胞免疫逃逸的風(fēng)險。癌細胞免疫逃逸可歸因于治療驅(qū)動的免疫選擇(therapeutically drivenimmune selection) 而導(dǎo)致的TAA刪除、突變或下調(diào)。因此，能夠誘導(dǎo)強力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新 TAA的鑒定保證了進一步開發(fā)，而且針對各種類型癌癥的肽疫苗接種策略的臨床考察正在進行中(NPL 3, Harris CC, J NatlCancer Inst 1996 Oct 16,88(20) : 1442-55; NPL 4,Butterfield LH et al. , CancerRes 1999 Jul 1，59 (13):3134-42;NPL 5, Vissers JL et al. , Cancer Res 1999 Novi, 59 (21) : 5554-9; NPL 6, van der Burg SH et al. , J Tmmunol 1996May 1，156(9):3308-14;NPL 7, Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct15,57(20):4465-8;NPL 8，F(xiàn)ujie T et al.,Int J Cancer 1999Jan 18，80 (2):169-72;NPL 9, Kikuchi M et al. , Int J Cancer 1999 May 5，81 (3):459-66;NPL 10，Oiso M et al. , Int J Cancerl999 May 5，81 (3) : 387-94)。迄今為止，已經(jīng)有數(shù)項使用這些腫瘤相關(guān)抗原衍生的肽進行臨床試驗的報告。不幸的是，當(dāng)前進行的癌癥疫苗試驗很多只觀察到較低的客觀應(yīng)答率(NPL 11，Belli F et al. , J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20) :4169-80;NPL 12, Coulie PG et al.，Immunol Rev 2002 Oct,188:33-42;NPL 13, Rosenberg SA et al. , Nat Med 2004 Sep, 10(9) : 909-15) 0因此，仍然需要鑒定能作為免疫治療靶的新TAA。
表皮細胞轉(zhuǎn)化序列2(ECT2)癌基因(GenBank Accession No. AY376439;例如 SEQ ID No:41)是從被鑒定為在癌癥中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物中被發(fā)現(xiàn)的。ECT2基因在多種癌癥的腫瘤細胞中特異性上調(diào)，這樣的癌癥包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、結(jié)腸直腸癌、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和小細胞肺癌(SCLC)，因此是本發(fā)明特別感興趣的(PTL 1,W02007/013671;PTL2,W02008/102557;PTL3，W02010/007791)。尤其是，源自ECT2的免疫原性肽可能對選擇性殺滅表達此類抗原的腫瘤細胞特別有用。弓丨用表非專利文獻[NPL l]Boon T, Int J Cancer 1993 May 8，54 (2):177-80[NPL 2]Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar 1，183 (3):725-9[NPL 3]Harris CC, J Natl Cancer Inst 19960ct 16，88 (20):1442-55[NPL 4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999 Jul 1，59 (13):3134-42[NPL 5]Vissers JL et al. , Cancer Res 1999 Nov 1，59(21):5554-9[NPL 6]van der Burg SH et al. , J Immunol 1996 May 1，156 (9):3308-14[NPL 7]Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct 15，57(20):4465-8[NPL 8]Fujie T et al. , Int J Cancer 1999 Jan 18，80 (2):169-72[NPL 9]Kikuchi M et al. , Int J Cancer 1999 May 5,81(3) : 459-66[NPL 10]0iso M et al. , Int J Cancer 1999 May 5，81(3):387-94[NPL ll]Belli F et al. , J Clin Oncol 2002 Oct 15，20(20):4169-80[NPL 12]Coulie PG et al. , Immunol Rev 2002 Oct, 188:33-42[NPL 13]Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep, 10(9):909-15專利文獻[PTL 1]W02007/013671[PTL 2]W02008/102557[PTL 3]W02010/00779
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明至少部分地基于免疫療法的合適靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。由于TAA —般被免疫系統(tǒng)察 覺為“自身”并因此常常沒有免疫原性，適宜靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)是極其重要的。意識到ECT2 (SEQ ID N0:42，由GenBank登錄號AY376439(例如SEQID N0:41)的基因編碼)已經(jīng)被鑒定為在 癌癥(例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、 NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC)中上調(diào)，本發(fā)明聚焦于ECT2作為癌癥/腫 瘤免疫療法靶標(biāo)，更具體地說可作為合適的免疫治療靶的新ECT2表位肽的候選者。為此目的，本發(fā)明至少部分地致力于從ECT2的基因產(chǎn)物中鑒定具有誘導(dǎo)針對 ECT2的CTL的能力的特異性表位肽。如下文詳細討論的，使用源自ECT2的HLA_A*0201結(jié) 合性候選肽刺激從健康供體獲得的外周血單個核細胞(PBMC)。然后建立了具有針對經(jīng)每種 候選肽沖激的HLA-A2陽性靶細胞的特異性細胞毒性的CTL系。本文中的結(jié)果證明這些肽 是鑒定了可誘導(dǎo)針對表達ECT2的細胞的強而特異性的免疫應(yīng)答的HLA-A2限制型表位肽。 這些結(jié)果進一步證明了 ECT2具有強免疫原性，而且它的表位是癌癥/腫瘤免疫療法的有效 靶標(biāo)。因此，本發(fā)明的一個目的是提供結(jié)合HLA抗原的分離的肽，包括ECT2(SEQ ID NO:42)及其免疫學(xué)活性片段。這樣的肽可望具有CTL誘導(dǎo)能力，因此可以用來離體誘導(dǎo)CTL 或者用來施用給受試者以誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答，癌癥的例子包括但不限于膀胱癌、乳 腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC。優(yōu)選的肽是九肽和十肽，更優(yōu)選地是顯示強的CTL誘導(dǎo)能力，并具有選自SEQID NO: 1-40的氨基酸序列的九肽和十肽。具有選自SEQ ID N0:l、3和21的氨基酸序列的肽顯示強的CTL誘導(dǎo)能力，因此是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明還考慮修飾的肽，它們具有選自SEQ ID NO: 1-40的氨基酸序列，其中替換、 插入、缺失或添加了一個、兩個或更多個氨基酸，只要所述的修飾的肽保留所需的原始肽的 CTL誘導(dǎo)能力。
本發(fā)明還涵蓋編碼任何本發(fā)明的肽的分離的多核苷酸。這些多核苷酸可以用來誘導(dǎo)或制備具有CTL誘導(dǎo)能力的APC或者可以和本發(fā)明的肽一樣施用給受試者以誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答。
當(dāng)施用給受試者時，本發(fā)明的肽被呈遞在抗原呈遞細胞的表面上，以誘導(dǎo)靶向相應(yīng)肽的CTL。因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于誘導(dǎo)CTL的作用劑、組合物和/或物質(zhì)，其包括或納入有任何本發(fā)明的肽或者多核苷酸。這樣的作用劑、組合物和物質(zhì)可以用來治療和/或預(yù)防癌癥和/或癌癥的手術(shù)后復(fù)發(fā)，所述癌癥尤其是膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC。因此，本發(fā)明的另一個目的是提供用于治療和/或預(yù)防癌癥，和/或防范其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥劑、藥物組合物和/或藥物物質(zhì)，其包含或納入有一種或多種本發(fā)明的肽或多核苷酸。作為本發(fā)明的肽或多核苷酸的替代或者補充，本發(fā)明的藥劑、藥物組合物或藥物物質(zhì)可包括呈遞任何本發(fā)明的肽的APC或外體作為有效成分。
本發(fā)明的肽或多核苷酸可以用來誘導(dǎo)在表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物的APC，例如通過使來源于受試者的APC與所述肽接觸或者將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC中。這樣的APC具有針對靶肽的高的CTL誘導(dǎo)能力并且能夠用于癌癥免疫治療。因此，本發(fā)明涵蓋用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法，以及通過此類方法獲得的 APC。
本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供用于誘導(dǎo)CTL的方法，此類方法包括將⑶8陽性細胞與在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外體共培養(yǎng)的步驟，或者導(dǎo)入包括編碼結(jié)合本發(fā)明的肽的T細胞受體(TCR)亞單位多肽的多核苷酸的基因的步驟。通過此類方法獲得的CTL 可以用來治療和/或預(yù)防癌癥，癌癥的例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC。因此，本發(fā)明的另一個目的是提供通過本發(fā)明的方法獲得的CTL。
本發(fā)明的還有一個目的是提供在有需要的受試者體內(nèi)誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括施用含有ECT2多肽或其免疫學(xué)活性片段、編碼ECT2多肽的多核苷酸、呈遞ECT2多肽的APC或外體的組合物或物質(zhì)的步驟。
本發(fā)明的應(yīng)用延及多種與ECT2過表達相關(guān)，或者源于ECT2過表達的疾病中的任何一種，諸如癌癥，癌癥的例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC。
具體而言，本發(fā)明涉及下述
(I). 一種分離的肽，其由SEQ ID NO:42的氨基酸序列或其免疫學(xué)活性片段組成， 其中所述肽結(jié)合HLA抗原并誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，
(2). (I)的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A2，
(3)⑴或⑵的分離的肽，其中所述肽包含選自SEQ ID NO: 1-40的氨基酸序列，
(4)分離的肽，其選自下組
(a)結(jié)合HLA抗原，誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，且由SEQ ID NO:42的氨基酸序列或其免疫學(xué)活性片段組成的分離的肽，
(b) (a)的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A2，
(c) (a)或(b)的分離的肽，其包含選自SEQ ID NO: 1-40的氨基酸序列，和
(d) (a)或(b)的分離的肽，其中所述肽由選自SEQ ID NO: 1-40的氨基酸序列組成，其中替代、缺失或添加了 1、2或幾個氨基酸，條件是所述修飾肽保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力，
(5)⑷的分離的肽，其由選自SEQ ID NO: 1-40的氨基酸序列組成，其中所述肽具有下述特征之一或二者
(a)自N端起的第二個氨基酸選自亮氨酸或甲硫氨酸；和
(b) C末端氨基酸選自纈氨酸或亮氨酸，
(6) (1)-(5)中任一項的分離的肽，其中所述肽是九肽或十肽，
(7) 一種分離的多核苷酸,其編碼(1)_(6)中任一項的肽，
(8) 一種用于誘導(dǎo)CTL的組合物，其中所述組合物包含一種或多種(I) _(6)中任一項的肽，或者一種或多種(7)的多核苷酸，
(9) 一種用于治療和/或預(yù)防癌癥、和/或防止癌癥手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物，其中所述組合物包含一種或多種(1)_(6)中任一項的肽，或者一種或多種(7)的多核苷酸，
(10) (9)的藥物組合物，其中所述組合物配制為供施用于HLA抗原為HLA-A2的受試者，
(11) (9)或(10)的藥物組合物，其中所述組合物配制為用于治療癌癥，
(12) 一種用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細胞(CTL)的方法，其包括選自下組的步驟
(a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC與(1)-(6)中任一項的肽接觸，和
(b)將編碼(1)_(6)中任一項的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC,
(13) 一種通過包含選自下組的步驟的方法來誘導(dǎo)CTL的方法
(a)將⑶8陽性T細胞與在表面上呈遞HLA抗原與(I)-(6)中任一項的肽的復(fù)合物的APC共培養(yǎng)；
(b)將⑶8陽性T細胞與在表面上呈遞HLA抗原與(I)-(6)中任一項的肽的復(fù)合物的外體共培養(yǎng)；
(c)將包含編碼結(jié)合(I) _(6)中任一項的肽的T細胞受體(TCR)亞單位多肽的多核苷酸的基因?qū)隩細胞，
(14) 一種分離的APC，所述APC在其表面上呈遞HLA抗原與(1)_(6)中任一項的肽的復(fù)合物，
(15) (14)的APC，其是通過(12)的方法誘導(dǎo)的，
(16) 一種分離的CTL，其靶向(1)_(6)中任一項的肽，
(17) (16)的CTL，其是通過(13)的方法誘導(dǎo)的，
(18) 一種在有需要的受試者中誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對7受試者施用包含(1)_(6)中任一項的肽、其免疫學(xué)活性片段、或編碼所述肽或所述片段的多核苷酸的組合物的步驟，
(19)針對(1)_(6)中任一項的肽的抗體或其免疫學(xué)活性片段，
(20) 一種載體,其包含編碼(1)_(6)中任一項的肽的核苷酸序列，
(21) 一種診斷試劑盒，其包含(1)_(6)中任一項的肽、(7)的核苷酸、或(19)的抗體。
要理解的是，前面的發(fā)明概述和下面的詳述都是對示例性的實施方案的說明，不對本發(fā)明或者本發(fā)明的其他備選實施方案構(gòu)成限定。
除了上述之外，在聯(lián)系附圖
和實施例閱讀下面的詳細說明時，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將變得更加顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，前面的發(fā)明概要和后面的詳細說明都僅僅提出了示例性的實施方案，并不對本發(fā)明或本發(fā)明的其它可替換實施方案構(gòu)成限制。 尤其是，雖然在本文中就若干具體的實施方案對本發(fā)明進行了說明，應(yīng)當(dāng)理解這些描述對本發(fā)明而言是示例說明性的，不解釋成對本發(fā)明的限制。在不背離如隨附的權(quán)利要求所描述的本發(fā)明的精神和范圍的前提下本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地想到本發(fā)明的多種修改和應(yīng)用。類似地，本發(fā)明的其它目的、特征、好處和優(yōu)勢是從此處的概要和下文描述的特定實施方案可以容易地想到的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以顯見的。根據(jù)上文的內(nèi)容并結(jié)合隨附的實施例、數(shù)據(jù)、附圖以及從中能夠合理推斷的內(nèi)容，或者進一步考慮本文中引用的參考文獻，這樣的目的、特征、好處和優(yōu)勢是容易想到的。
附圖簡述
本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了下文的附圖簡要說明及對本發(fā)明及其優(yōu)選實施方案的詳細說明后將清楚地得知本發(fā)明的各個方面的應(yīng)用。
[圖I]圖I由一組照片(a)-(c)組成，描繪顯示對用源自ECT2的肽誘導(dǎo)的CTL進行的IFN-Y ELISP0T測定的結(jié)果。用ECT2-A02-9-34 (SEQ ID NO: I)刺激的6號孔(a),用 ECT2-A02-9-664(SEQ ID NO:3)刺激的 5 號孔(b)、和用 ECT2-A02-10-33 (SEQ ID N0:21) 刺激的I號孔(c)中的CTL分別與對照相比顯示了強的IFN-Y生成。這些圖片上孔上的方框表示來自相應(yīng)孔中的細胞被擴增以建立CTL系。這些圖片上孔上的方框表示來自相應(yīng)孔中的細胞被擴增以建立CTL系。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)適宜肽沖激的靶細胞的IFN-Y 生成，而〃_〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細胞的IFN- Y生成。
[圖2]圖2由一組照片(a)- (c)組成，描繪IFN- Y ELISA測定法的結(jié)果， 顯示(a)ECT2-A02-9-34(SEQ ID NO:I)， (b)ECT2-A02-9-664(SEQ ID NO:3)和(c) ECT2-A02-10-33 (SEQ ID N0:21)刺激的CTL系的IFN-γ生成。結(jié)果顯示用每種肽刺激而建立的CTL與對照相比顯示了強的IFN-Y生成。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)適宜肽沖激的靶細胞的IFN-Y生成，而〃_〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細胞的IFN-Y生成。
[圖3]圖 3 描繪一對線圖，(a)和(b)，顯示從用(a) ECT2-A02-9-34 (SEQ IDNO: I) 和(b)ECT2-A02-9-664(SEQ ID N0:3)刺激的CTL系通過有限稀釋而建立的CTL克隆的 IFN-Y的生成。結(jié)果證明了通過用每種肽刺激而建立的CTL克隆顯示與對照相比強的 IFN-Y生成。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)適宜肽沖激的靶細胞的IFN-Y生成，而〃_〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細胞的IFN-Y生成。
[圖4]圖4描繪一對線圖，(a)和(b)，描繪針對外源表達ECT2和HLA_A*0201的靶細胞的特異性CTL活性。制備用HLA-A*0201或用全長ECT2基因轉(zhuǎn)染的C0S7細胞作為對照。用 ECT2-A02-9-34 (SEQ ID NO: I) (a)建立的 CTL 克隆和用 ECT2-A02-10-33 (SEQ ID NO: 21) (b)建立的CTL系顯示針對用ECT2和HLA_A*0201 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細胞的特異性 CTL活性(黑色圓形)。另一方面，沒有檢測到顯著的針對表達HLA-A*0201 (三角形)或ECT2 (白色圓形)任一的靶細胞的特異性CTL活性。
實施方案的描述
現(xiàn)在描述優(yōu)選的材料、裝置、和方法，不過在實施或檢驗本發(fā)明的實施方案時可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方法之前，要理解這些描述只是說明性的，并不意圖限定。還要理解的是，本發(fā)明不限于特定大小、性狀、尺度、材料、方法學(xué)、方案等，因為它們可因循例行實驗和/或優(yōu)化而變化。此外，所述描述中使用的術(shù)語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權(quán)利要求來限制。
通過提述明確地將本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖墓_文本完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開文本。
除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常知曉的意義。如果有沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實例僅為舉例說明而不構(gòu)成限制。
I.定義
如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非另有明確說明。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基可以是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在型殘基(諸如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
本說明書中有時使用的術(shù)語“寡肽”用于指長度為20個殘基或更少，典型地為15 個殘基或更少的本發(fā)明的肽，通常由約8個-約11個殘基，經(jīng)常為9個或10個殘基組成。
如本文中使用的，術(shù)語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及具有與天然存在的氨基酸相似的功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。氨基酸可以是L-氨基酸或 D-氨基酸。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細胞中在翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和O-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在型氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)(α碳與氫、羧基、氨基、和R基團結(jié)合)但具有一個或多個經(jīng)過修飾的R基團或經(jīng)過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學(xué)化合物。
氨基酸在本文中可以通過它們公知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號來指稱。
術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中除非另有明確說明可互換使用，而且與氨基酸類似地通過它們普遍接受的單字母代碼來指稱。
術(shù)語“(作用)劑”、“物質(zhì)”、和“組合物”和在本文中可以互換使用，指包含規(guī)定量的規(guī)定成分的產(chǎn)品，以及通過所述規(guī)定量的規(guī)定成分的組合直接或間接地得到的任何產(chǎn)品。這些術(shù)語當(dāng)與修飾語“藥(物)”(例如“藥劑”和“藥物組合物”)關(guān)聯(lián)使用時，意在涵蓋包括活性成分以及任何組成擔(dān)載體的惰性成分的產(chǎn)品，以及通過所述任何兩種或更多種成分的組合、復(fù)合或聚集，或通過一種或多種組分的解離，或通過一種或多種成分的其他類型的反應(yīng)或相互作用而直接或間接地得到的任何產(chǎn)品。相應(yīng)地，在本發(fā)明的語境中，術(shù)語 “藥劑”和“藥物組合物”指任何通過混合本發(fā)明的化合物與藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的擔(dān)載體而制成的產(chǎn)品。
本文中所用的短語“藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體”或“生理學(xué)上可接受的擔(dān)載體”意思是藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的材料、組合物、物質(zhì)或媒介，包括但不限于擔(dān)載或運輸主題的支架多聚藥效團從一個器官或身體部分到另一個器官或身體部分所涉及的液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包埋材料。
本發(fā)明的藥劑或藥物組合物特別可以用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(又稱“免疫原性組合物)是指在接種到動物體內(nèi)后具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫功能的物質(zhì)。
術(shù)語“活性成分”在本文中意指作用劑或組合物中具有生物學(xué)活性或生理學(xué)活性的物質(zhì)。尤其是，在藥劑或藥物組合物的語境中，術(shù)語“活性成分”是指顯示客觀的藥理學(xué)效果的物質(zhì)。例如，在用于治療或預(yù)防癌癥的藥劑或藥物組合物的場合，作用劑或組合物中的活性成分可直接或間接地導(dǎo)致對于癌細胞和/或組織的至少一種生物學(xué)或生理學(xué)作用。優(yōu)選地，這樣的作用可包括減少或抑制癌細胞生長、破壞或殺死癌細胞和/或癌組織， 等等。典型地，活性成分的間接效果包括誘導(dǎo)可識別或殺死癌細胞的CTL。在配制之前，“活性成分”又可稱“原料藥” (bulk)、“藥物物質(zhì)” (drug substance)或“技術(shù)產(chǎn)品” (technical product)ο
除非另有定義，術(shù)語“癌癥”指過表達ECT2基因的癌癥，過表達ECT2的癌癥的實例包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC。
除非另有定義，術(shù)語“細胞毒性T淋巴細胞”、“細胞毒性T細胞”和“CTL”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細胞(例如腫瘤/癌細胞、病毒感染的細胞)并誘導(dǎo)此類細胞死亡的T淋巴細胞亞群。
除非另有定義，本文中使用的術(shù)語“HLA-A2”代表性地指亞型，其例子包括但不限于 HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA_A*0203、HLA_A*0204、HLA_A*0205、HLA_A*0206、 HLA-A*0207、HLA_A*0210、HLA_A*0211、HLA_A*0213、HLA_A*0216、HLA_A*0218、HLA_A*0219、 HLA-A*0228 和 HLA_A*0250。
除非另有定義，如本文中所用的術(shù)語“試劑盒”是指試劑及其他材料的組合?？紤]術(shù)語“試劑盒”可包括微陣列、芯片、標(biāo)記物、等等。術(shù)語“試劑盒”不意圖限于某種特定的試劑和/或材料組合。
如本文中使用的，在受試者或者患者的語境中，短語“HLA-A2陽性”是指受試者或患者純合地或者雜合地擁有HLA-A2抗原基因,且HLA-A2抗原在受試者或患者的細胞中作為HLA抗原表達。
以本發(fā)明的方法和組合物在“治療”癌癥的語境中有用為限，如果治療導(dǎo)致臨床上的收益，例如受試者體內(nèi)ECT2基因表達的減少、或者癌癥的尺寸、普遍性(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力的降低，則認為治療是“有效的”。當(dāng)預(yù)防性地進行治療時，“有效的”意思是其阻礙或阻止癌癥的形成，或者阻止或減輕癌癥的臨床癥狀?！坝行浴苯Y(jié)合用于診斷或治療特定腫瘤類型的任何已知方法來確定。
以本發(fā)明的材料和方法可用于“預(yù)防”和“防范”癌癥的語境為限，此類術(shù)語在本文中可互換使用，指降低緣于疾病的死亡率或發(fā)病率負擔(dān)的任何活動。預(yù)防和防范可發(fā)生于 “一級、二級和三級預(yù)防水平”。一級預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級水平的預(yù)防和防范涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病的進展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復(fù)功能和減輕疾病相關(guān)并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負面影響的活動?；蛘撸A(yù)防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴(yán)重性(例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等)的多種多樣的預(yù)防性療法。
在本發(fā)明的語境中，治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)去除癌細胞、抑制癌性細胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和阻抑癌癥發(fā)生、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防可降低患癌個體死亡率及改善其預(yù)后，降低其血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預(yù)防，包括10%、20%、30%或更多降低，或?qū)崿F(xiàn)病情穩(wěn)定。
在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“抗體”指可以與指定的蛋白或其肽具有特異性反應(yīng)性的免疫球蛋白及其片段?？贵w可以包括人抗體、靈長源化(primatized)抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、與其它蛋白或放射性標(biāo)記物融合的抗體、和抗體片段。另外，在本文中，抗體以最廣義使用，具體涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性?！翱贵w”指示所有類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知曉的相同涵義。
II.肽
為了證明源自ECT2的肽發(fā)揮被CTL所識別的抗原的功能，對源自ECT2 (SEQ ID NO: 42)的肽進行了分析以確定它們是否為HLA-A24或A2限制性的抗原表位，HLA-A2是經(jīng)常遇到的 HLA 等位基因(Date Y et al. , Tissue Antigens47:93-101，1996;Kondo A et al.,J Tmmunol 155:4307-12，1995;Kubo RT et al. , J Tmmunol 152:3913-24,1994)。
基于它們對HLA-A2的結(jié)合親和力，鑒定了源自ECT2的HLA-A24結(jié)合肽的候選者。 鑒定出了下列候選肽
ECT2-A2-9-34(SEQ ID NO:I),
ECT2-A2-9-619(SEQ ID NO:2)，
ECT2-A2-9-664(SEQ ID NO:3)，
ECT2-A2-9-662(SEQ ID NO:4)，
ECT2-A2-9-634(SEQ ID NO:5)，
ECT2-A2-9-145(SEQ ID NO:6)，
ECT2-A2-9-561(SEQ ID NO:7)，
ECT2-A2-9-98(SEQ ID NO:8)，
ECT2-A2-9-575(SEQ ID NO:9)，
ECT2-A2-9-240(SEQIDNO10)，
ECT2-A2-9-292(SEQIDNO11),
ECT2-A2-9-823(SEQIDNO12),
ECT2-A2-9-220(SEQIDNO13)，
ECT2-A2-9-755(SEQIDNO14),
ECT2-A2-9-357(SEQIDNO15)，
ECT2-A2-9-438(SEQIDNO16)，
ECT2-A2-9-874(SEQIDNO17),
ECT2-A2-9-568(SEQIDNO18),
ECT2-A2-9-166(SEQIDNO19)，
ECT2-A2-9-443(SEQIDNO20)，
ECT2-A2-10-33(SEQIDNO21)，
ECT2-A2-10-633(SEQIDNO:22)，
ECT2-A2-10-144(SEQID NO:23)，
ECT2-A2-10-701(SEQID NO:24)，
ECT2-A2-10-754(SEQID NO:25),
ECT2-A2-10-557(SEQID NO:26)，
ECT2-A2-10-191(SEQID NO:27)，
ECT2-A2-10-774(SEQID NO:28)，
ECT2-A2-10-428(SEQID NO:29)，
ECT2-A2-10-618(SEQID NO:30),
ECT2-A2-10-97(SEQID N0:31),
ECT2-A2-10-20(SEQID NO:32)，
ECT2-A2-10-574(SEQIDNO:33)
ECT2-A2-10-461(SEQIDNO:34)，
ECT2-A2-10-664(SEQIDNO:35)，
ECT2-A2-10-575(SEQIDNO:36)，
ECT2-A2-10-430(SEQIDNO:37)，
ECT2-A2-10-511(SEQIDNO:38)，
ECT2-A2-10-471(SEQIDNO:39)和
ECT2-A2-10-87(SEQ ID NO:40)。
此外，用經(jīng)過這些肽沖激(加載)了的樹突細胞(DC)體外刺激T細胞后，通過使用下述每一種肽刺激DC成功地建立了 CTL
ECT2-A2-9-34(SEQ ID NO:I),
ECT2-A2-9-664(SEQ ID NO:3)和
ECT2-A2-10-33 (SEQ ID N0:21)。
這些建立的CTL針對經(jīng)相應(yīng)肽沖激的靶細胞顯示強且特異性的CTL活性。這些結(jié)果證明ECT2是被CTL識別的抗原，且這些被測試的肽是ECT2的受HLA-A2限制的表位肽。
由于ECT2基因在大多數(shù)癌細胞(如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)12腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC)中過表達，而在大多數(shù)正常器官中不表達，它是良好的癌癥免疫治療靶標(biāo)。因此，本發(fā)明提供來源于ECT2的被CTL 識別的表位的九肽(由九個氨基酸殘基組成的肽)和十肽(由十個氨基酸殘基組成的肽)。或者，本發(fā)明提供結(jié)合HLA抗原且誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的分離的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列或者是其免疫學(xué)活性片段。更具體地，在一些實施方案中， 本發(fā)明提供具有選自1-40的氨基酸序列的肽。
—般而言，目前可以通過例如互聯(lián)網(wǎng)訪問的軟件程序，如Parker KC et al. , J Immunol 1994Jan 1，152 (I) : 163-75，和 Nielsen M et al. Protein Sci, 12:1007-17 等中描述的那些，可以用來在計算機上計算不同肽與HLA抗原之間的結(jié)合親和力。與HLA抗原的結(jié)合親和力可以按照例如下列文獻中描述的那樣進行測定Parker KC et al. , J Immunol 1994Jan 1，152(I) :163-75 和 Kuzushima K et al. , Blood 2001，98(6):1872-81，Larsen MV et al. BMCBioinformatics. 20070ct 31;8:424,Buus S et al. Tissue Antigens.,6 2:378-84，2003，Nielsen M et al. , Protein Sci 2003;12:1007-17，and Nielsen M et al. PLoSONE 2007; 2: e796,總結(jié)在例如 Lafuente EM et al., Current PharmaceuticalDesi gn, 2009, 15, 3209-3220中。用于測定結(jié)合親和力的方法在例如Journal of Immunological Methods (1995，185:181-190);和 Protein Science (2000，9:1838-1846)中有描述。因而可以利用這樣的軟件程序來選擇具有高度的HLA抗原結(jié)合親和力的源自ECT2的片段。因此， 本發(fā)明涵蓋由任何可通過這些已知程序被確定為與HLA抗原結(jié)合的ECT2片段構(gòu)成的肽。此外，這樣的肽可包括由ECT2全長構(gòu)成的肽。
本發(fā)明的肽，尤其是本發(fā)明的九肽和十肽，在其側(cè)翼可以具有額外的氨基酸殘基， 只要該肽保持其CTL誘導(dǎo)能力即可。具體的額外氨基酸殘基可以由任何種類的氨基酸構(gòu)成，只要其不損害原來的肽的CTL誘導(dǎo)能力。因此，本發(fā)明涵蓋具有對HLA抗原的結(jié)合親和力的肽，包括源自ECT2的肽。這樣的肽為例如少于約40個氨基酸，經(jīng)常少于約20個氨基酸，通常少于約15個氨基酸。
—般而言，已知肽中一個或多個氨基酸的修飾不影響肽的功能，或者在有些情況下甚至?xí)鰪娫鞍踪|(zhì)的期望功能。事實上，已知有經(jīng)過修飾的肽(即由與原始參照序列相比其中修飾(即由通過對原參考序列替代、缺失、插入、或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基而修飾的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學(xué)活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1984，81:5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500;Dal badie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明的具有CTL誘導(dǎo)能力的肽可以由具有選自SEQ ID N0:l-40的氨基酸序列，其中添加、缺失、和/或替代一個、兩個或甚至更多個氨基酸的肽構(gòu)成。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認可，改變氨基酸序列中的單個氨基酸或少數(shù)百分比氨基酸的個別添加、缺失、插入或替代會導(dǎo)致原始氨基酸側(cè)鏈的特性得以保留；因此其被稱作“保守替代”或“保守修飾”，其中對蛋白質(zhì)的改變導(dǎo)致具有類似的功能的蛋白質(zhì)。提供功能上相似的氨基酸的保守替代表是本領(lǐng)域公知的。氨基酸側(cè)鏈特征的例子包括例如疏水性氨基酸 (A, I, L, M, F，P，W, Y，V)、親水性氨基酸(R, D, N, C，E, Q, G，H, K, S，T)、和具有下面的共同官能團或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P);含羥基側(cè)鏈(S, T, Y);含硫原子側(cè)鏈(C1M)； 含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D, N, E, Q);含堿側(cè)鏈(R, K, H);和含芳香族側(cè)鏈(H, F，Y，W)。另外，下面的八組各自含有互為保守替代的氨基酸
I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；
5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和
8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。
此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，可包括非保守修飾，只要該肽保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不應(yīng)排除ECT2的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的可誘導(dǎo)CTL的肽。
可以對本發(fā)明的肽插入、替換或添加氨基酸殘基，或者，可以從本發(fā)明的肽缺失氨基酸殘基，以實現(xiàn)更高的結(jié)合親和力。為了保持所需的CTL誘導(dǎo)能力，可以修飾(插入、缺失、添加和/或替代)少數(shù)(例如，I個、2個或數(shù)個)或小百分比的氨基酸。這里，術(shù)語“數(shù)個”意指5個以下的氨基酸，如4個或3個以下。要被修飾的氨基酸的百分比優(yōu)選為20%以下，更優(yōu)選15%以下，更優(yōu)選10%以下，進一步更優(yōu)選或1_5%。
當(dāng)在癌癥免疫療法中使用時，本發(fā)明的肽可呈遞在細胞或外體的表面上，作為與 HLA抗原的復(fù)合物。因此，優(yōu)選選擇不僅誘導(dǎo)CTL而且具有對HLA抗原的高結(jié)合親和力的肽。為此目的，可以對肽通過缺失、替代、插入和/或添加氨基酸殘基來加以修飾以產(chǎn)生具有更好的結(jié)合親和力的修飾肽。除了天然被展示的肽之外，由于已經(jīng)知道通過結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列規(guī)律(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41:178; J Immunol 1994, 155:4307)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的免疫原性肽。
例如，具有高的HLA-A2結(jié)合親和力的肽的自N端起的第二個氨基酸傾向于被替代為亮氨酸或甲硫氨酸。類似地，C端氨基酸被替代為纈氨酸或亮氨酸的肽可以優(yōu)選地使用。 因此，具有選自SEQ ID NO: 1-40的氨基酸序列，其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的自N 端起的第二個氨基酸被替代為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的C端被替代為纈氨酸或亮氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。
不僅可以在肽的末端氨基酸處引入替換，而且可以在肽的潛在T細胞受體 (TCR)識別位置處引入替換。數(shù)項研究已證明了具有氨基酸替代的肽可具有等同于或好于原來的功能，例如 CAP1、p53(264_272)、Her-2/neu(369-377)或 gpl00(2(l9_217) (Zaremba et al.Cancer Res.57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. JImmunol. (2002)Feb I;168(3):1338-47. , S. 0. Dionne et al. Cancer ImmunoIimmunother. (2003)52:199-206 及 S.0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53, 307-314)。
本發(fā)明還考慮向本發(fā)明的肽的N和/或C端添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸。此類具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導(dǎo)能力的修飾肽也包含在本發(fā)明之內(nèi)。例如，本發(fā)明提供長度少于14、13、12、11或10個氨基酸的分離的肽，其包含選自下組的氨基酸序列
⑴選自SEQ ID NO: 1_20的氨基酸序列，其中替代了 1、2或幾個氨基酸，其中所述肽結(jié)合HLA抗原并誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞，和14
(ii) (i)的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有下述特征之一或二者
(a)所述SEQ ID NO的自N端起的第二個氨基酸選自亮氨酸或甲硫氨酸；和
(b)所述SEQ ID NO的C末端氨基酸選自纈氨酸或亮氨酸。
此外，本發(fā)明還提供長度少于15、14、13、12或11個氨基酸的分離的肽，其包含選自下組的氨基酸序列
⑴選自SEQ ID NO:21-40的氨基酸序列，其中替代了 1、2或幾個氨基酸，其中所述肽結(jié)合HLA抗原并誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞，和
(ii) (i)的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有下述特征之一或二者
(a)所述SEQ ID NO的自N端起的第二個氨基酸選自亮氨酸或甲硫氨酸；和
(b)所述SEQ ID NO的C末端氨基酸選自纈氨酸或亮氨酸。
當(dāng)這些肽與APC接觸或者被導(dǎo)入APC時，這些肽在APC中被加工，從而在APC上呈遞⑴、m)、α’)和m’)的肽。
然而，當(dāng)肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時，可能誘導(dǎo)副作用，諸如自身免疫性病癥或針對特定物質(zhì)的變應(yīng)性癥狀。因此，可以利用可用的數(shù)據(jù)庫實施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。當(dāng)根據(jù)同源性搜索清楚了即使對目標(biāo)肽僅有I個或2個氨基酸差異的肽亦不存在時， 可以修飾目標(biāo)肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導(dǎo)能力，而沒有任何發(fā)生此類副作用的危險。。
雖然如上所述的對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽預(yù)期是高度有效的，但還是對根據(jù)高結(jié)合親和力的存在為指標(biāo)選出的候選肽檢查了 CTL誘導(dǎo)能力的存在。這里，短語 “CTL誘導(dǎo)能力”指肽被呈遞到抗原呈遞細胞(APC)上時誘導(dǎo)CTL的能力。另外，“CTL誘導(dǎo)能力”包括肽誘導(dǎo)CTL活化、CTL增殖、促進CTL溶解靶細胞、和提高CTL IFN- Y生成的能力。
CTL誘導(dǎo)能力的確認如下來實現(xiàn)，誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的APC(例如B-淋巴細胞、巨噬細胞、和樹突細胞(DC))，或者更具體地說，源自人外周血單核白細胞的DC，并且在用肽刺激后，與CD8-陽性細胞混合，然后測量由CTL針對靶細胞生成和釋放的IFN-Y。 作為反應(yīng)系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成的表達人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如BenMohamed L， Krishnan R, Longmate J, Auge C，Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Tmmunol 2000 Aug, 61(8):764-79Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimalepitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice:dependent on MHC(HLA) class II restricted T (H)response中描述的那些)。例如,可以用51Cr等放射性標(biāo)記革巴細胞，并且可以自靶細胞釋放的放射性計算細胞毒性活性?；蛘撸梢匀缦略u估測量在攜帶固定化肽的(APC存在下由CTL生成和釋放的IFN- Y，并使用抗IFN- Y單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。
作為如上所述檢查肽的CTL誘導(dǎo)能力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)選自具有選自SEQ IDNO: 1-40 的氨基酸序列的那些肽的九肽和十肽不但具有對HLA抗原的高親和力，還具有特別高的 CTL誘導(dǎo)能力。因此，例舉這些肽為本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。
另外，同源性分析的結(jié)果顯示了該肽與自任何其它已知人基因產(chǎn)物衍生的肽不共享顯著的同源性。這降低了用于免疫療法時發(fā)生未知的或不想要的免疫應(yīng)答的可能性。因此，也是根據(jù)這個方面，這些肽可用于在癌癥患者中引發(fā)針對ECT2的免疫力。因此，本發(fā)明的肽，優(yōu)選具有選自SEQ ID NOs: 1-40的氨基酸序列的肽，被本發(fā)明所涵蓋。
除上文討論的對本發(fā)明的肽的修飾之外，還可將本發(fā)明的肽連接至其它肽，只要所得的連接肽保留原始肽所需的CTL誘導(dǎo)能力，并且，優(yōu)選地，還保留所需的HLA結(jié)合。示例性的“其他肽”包括本發(fā)明的肽或者從其他TAA衍生的能誘導(dǎo)CTL的肽。肽間的接頭是本領(lǐng)域公知的，例如 AAY (P. M. Daftarian et al. , J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. SutmulIer et al. , J Immunol. 2000，165: 7308-7315)或 K(S.0ta et al. , Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al. , J Immunol. 2002, 168:5709-5715)。
例如，還可以基本上同時地使用非ECT2的腫瘤相關(guān)抗原肽，來增加藉由HLA I類和/或HLA II類的免疫應(yīng)答。公認癌細胞能表達多于一種腫瘤相關(guān)基因。因此，確定特定的受試者是否表達其他腫瘤相關(guān)基因，然后將源自這樣的基因的表達產(chǎn)物的HLA I類和/ 或HLA II類結(jié)合肽包含在本發(fā)明的ECT2組合物或疫苗中，是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)實驗的范圍之內(nèi)的。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會知曉I類HLAI和II類HLA結(jié)合肽的例子(例如參見 Coulie, Stem Cells 13:393-403，1995)，而且可以以與本文公開類似的方式用于本發(fā)明。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能依照分子生物學(xué)的常規(guī)規(guī)程來制備包括一種或多種ECT2肽和一種或多種非ECT2肽的多肽，或編碼此類多肽的核酸。
上述連接的肽在本文中被稱為“多表位”(polytope) ”，即兩個或更多個潛在免疫原性或免疫應(yīng)答刺激性肽構(gòu)成的組，這些肽可以以各種排列方式(例如串聯(lián)、交疊)連接在一起。該多表位(或編碼該多表位的核酸)可以以標(biāo)準(zhǔn)免疫方案來施用，例如施用于動物，以測試該多表位刺激、增強和/或引起免疫應(yīng)答的有效性。
肽可直接地或經(jīng)使用側(cè)翼序列連接在一起以形成多表位，而且多表位作為疫苗的用途是本領(lǐng)域公知的(參見例如Thomson et al. , Proc. Natl. Acad. SciUSA 92(13):5845-5849, 1995;Gilbert et al. , Nature Biotechnol. 15 (12):1280-128 4,1997;Thomson et al.,J Immunol. 157 (2):822-826，1996;Tarn et al.,J Exp. Med. 171(1) :299-306, 1990)?？芍苽浜胁煌瑪?shù)目和組合的表位的多表位并測試它們被 CTL識別的情況及提高免疫應(yīng)答的功效。
可將本發(fā)明的肽進一步連接至其它物質(zhì)，只要它們保留所需的所需的CTL誘導(dǎo)能力。這樣的“其它”物質(zhì)的示例性例子包括，但不限于肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；?、天然的和合成的聚合物等。肽還可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化；前提是該修飾不破壞如肽的本文所述的生物學(xué)活性?？梢赃M行這些類型的修飾以賦予額外的功能(例如靶向功能和投遞功能)或使多肽穩(wěn)定。
例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明多肽。可以以多種方式測定多肽的穩(wěn)定性。例如， 可使用肽酶和各種生物學(xué)介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來測試穩(wěn)定性(參見例如Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302)。
此外，如上文所述，在替換、插入、缺失或添加了一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基的修飾肽中，可以篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高者。因此，本發(fā)明還提供由于篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高的修飾肽的方法。例如，所述方法可包括下述步驟
a:對本發(fā)明的肽替換、插入、刪除或添加至少一個氨基酸殘基，
b:測定肽的活性，和
c :選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的肽。
本文中，要測定的活性可包括MHC結(jié)合活性，APC或CTL誘導(dǎo)能力，和細胞毒活性。
本文中，本發(fā)明的肽也可以稱為“ECT2肽”或“ECT2多肽”。
III.ECT2 狀的制各
本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來制備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成來制備。本發(fā)明的肽可個別地合成，或合成為包括兩個或更多個肽的較長多肽。然后可以分離，即純化或分離所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主細胞蛋白質(zhì)及其片段或任何其它化學(xué)物質(zhì)。
本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，前提是該修飾不破壞原始肽的生物學(xué)活性。其他示例性的修飾包括摻入D-氨基酸或其他可用的氨基酸模擬物，以便例如增加肽的血清半壽期。
可以根據(jù)選定的氨基酸序列，借助化學(xué)合成來獲得本發(fā)明的肽?？蛇m用于合成的常規(guī)肽合成法的例子包括
(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976 ；
(iii) Peptide Synthesis (日文)，Maruzen Co. , 1975 ；
(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(日文),Maruzen Co.,1985 ；
(ν) Development of Pharmaceuticals (second volume)(日文)，Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ；
(vi)W099/67288 ;和
(v i i) Barany G. &Merr i f i e I d R. B. , Peptides Vol. 2，"Solid Phase PeptideSynthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。
或者，可采用任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽(例如 Morrison J, J Bacteriology 1977,132:349-51;Clark-Curtiss&Curtiss, Methodsin Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101:347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達形式(例如處于相當(dāng)于啟動子序列的調(diào)節(jié)序列下游)的編碼目標(biāo)肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)化入合適的宿主細胞。本發(fā)明也提供這樣的載體和宿主細胞。然后培養(yǎng)宿主細胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn)肽。
IV.多核苷酸
本發(fā)明還提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括源自天然存在型ECT2 基因(GenBank Accession No. AY376439 (例如，SEQ ID NO: 41))的多核苷酸以及具有它們的經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語“經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列” 指編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，對于任何給定蛋白質(zhì)都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成所述的任何相應(yīng)密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異在本領(lǐng)域中稱為“沉默變異”，是保守修飾變體的一種。本文中描述的編碼肽的每一種核酸序列也描述該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認識到，核酸中的每一個密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)都可以被修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因而，每一種公開的編碼肽的核苷酸序列都構(gòu)成對與之相關(guān)的沉默變異的隱含公開。
本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物構(gòu)成。如本領(lǐng)域公知的，DNA分子由堿基諸如天然存在的堿基A、T、C、和G合適地構(gòu)成，而T在RNA中被U替換。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到非天然存在的堿基也包括在多核苷酸中。
本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個本發(fā)明肽，其中有或無居間氨基酸序列存在。例如， 居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(例如酶識別序列)。另外，多核苷酸除編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表達肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標(biāo)志基因等等的表達載體 (質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規(guī)重組技術(shù)操作多核苷酸來制備，例如通過使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。
重組和化學(xué)合成技術(shù)都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細胞后能表達的適宜載體來生成多核苷酸?；蛘?，可借助PCR技術(shù)或通過在合適宿主中的表達來擴增多核苷酸(參見例如Sambrooket al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)?；蛘?，可使用固相技術(shù)來合成多核苷酸，如 Beaucage SL&Iyer RP, Tetrahedron 1992，48:2223-311; Matthes et al. , EMBO J 1984，3:801-5 中記載的。
V.夕卜體(exosomes)
本發(fā)明進一步提供了稱作外體的細胞內(nèi)囊泡，這些外體在它們的表面上呈遞本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合體。外體可以通過，例如在日本專利申請公表公報平 11-510507和W099/03499中詳細描述的方法來制備，并可以用從作為治療和/或預(yù)防對象的患者獲得的APC制備。本發(fā)明的外體可以作為疫苗以與本發(fā)明的肽相似的方式進行接種。
復(fù)合體中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預(yù)防的受試者的類型匹配。例如，對日本人群而言，HLA-A2,尤其是 HLA-A*0201，HLA-A*0202，HLA-A*0203, HLA-A *0204，HLA-A*0205, HLA_A*0206，HLA_A*0207，HLA_A*0210，HLA_A*0211, HLA_A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA_A*0219, HLA_A*0228 和 HLA_A*0250 常常是合適的。使用在日本人和白種人中高度表達的A24型或A2型對于獲得有效的結(jié)果是有利的，而且還可以使用 HLA-A祁201, HLA-A祁202，HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207 ，HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA_A*0213, HLA_A*0216, HLA_A*0218, HLA_A*0219, HLA_A*0228 和HLA-A*0250等亞型。典型地，在臨床上，預(yù)先考察需要治療的患者的HLA抗原類型，這樣就能夠合適地選擇對這種抗原具有高水平的結(jié)合親和力、或者具有藉由抗原呈遞的CTL誘導(dǎo)能力的肽。此外，為了獲得顯示高結(jié)合親和力和CTL誘導(dǎo)能力的肽，可以在天然存在的 ECT2部分肽的氨基酸序列的基礎(chǔ)上進行I個、2個或數(shù)個氨基酸的替換、缺失和/或添加。
當(dāng)本發(fā)明的外體使用A2型HLA抗原時，具有SEQ ID NO: 1-40中任一序列的肽是特別有用的。
VI.杭原旱遞細朐(APC)
本發(fā)明還提供在其表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的分離的 APC0所述APC可源自作為治療和/或預(yù)防對象的患者，而且可作為疫苗單獨地或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外體、或CTL)組合來施用。
APC不限于特定種類的細胞，包括樹突細胞(DC) ,Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞、和活化的T細胞，已知這些細胞可在它們的細胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，以供淋巴細胞識別。由于DC是APC中具有最強CTL誘導(dǎo)活性的代表性APC，DC可以用作本發(fā)明的 APC。
例如，可通過自外周血單核細胞誘導(dǎo)DC，然后在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸(刺激)它們來獲得APC。當(dāng)對受試者施用本發(fā)明的肽時，在受試者的身體中誘導(dǎo)出呈遞本發(fā)明肽的APC。因此，可以通過對受試者使用本發(fā)明的肽，然后從受試者收集APC，來獲得本發(fā)明的APC?；蛘?，可以通過使從受試者收集的APC與本發(fā)明的肽接觸來獲得本發(fā)明的 APC。
本發(fā)明的APC可以單獨或者與其他藥物，包括本發(fā)明的肽、外體或CTL組合施用給受試者，以在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答。例如，離體施用可包括下述步驟
a 自第一受試者收集APC ；
b 使肽接觸步驟a的APC ；并
c :對第二受試者步驟b的APC。
第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體。步驟b獲得的 APC可以作為疫苗施用來治療和/或預(yù)防癌癥，癌癥的例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、 宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和 SCLC。
本發(fā)明還提供用于制備誘導(dǎo)APC的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法包括將本發(fā)明的肽與藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體混合或配制的步驟。
依照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的APC具有高水平的CTL誘導(dǎo)能力。在術(shù)語“高水平的CTL誘導(dǎo)能力”中，高水平是相對于未與肽接觸或與不能誘導(dǎo)CTL的肽接觸的APC的該水平而言的。這樣的具有高水平CTL誘導(dǎo)能力的APC除了用上文描述的方法外，還包括在體外將含有編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移至APC的步驟的方法來制備。所導(dǎo)入的基因可以是DNA或RNA的形式。用于進行導(dǎo)入的方法的例子包括但不具體限于本領(lǐng)域中常規(guī)實施的各種方法，諸如可以使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、或磷酸鈣法。更具體的說，可以如Cancer Res 1996，56:5672-7; J Immunol 1998，161:5607-13; J Exp Medl996, 184:465-72;國際公開文本No. 2000-509281的已
公開日文翻譯中所述來實施。通過將基因轉(zhuǎn)移入APC，基因在細胞中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工，并經(jīng)由呈遞途徑呈遞給本發(fā)明的部分肽。
VII.細胞毒件T細胞(CTL)
誘導(dǎo)出的針對任何本發(fā)明肽的CTL可在體內(nèi)加強靶向癌細胞的免疫應(yīng)答，因此可以以與所述肽相似的方式用作疫苗。因此，本發(fā)明提供由任何本發(fā)明肽特異性誘導(dǎo)或活化的、分離的CTL。
此類CTL可通過下述步驟來獲得(I)對受試者施用本發(fā)明的肽；或(2)在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)源自受試者的APC，以及CD8-陽性細胞或外周血單核白細胞；或(3) 在體外使CD8-陽性細胞或外周血單核白細胞接觸在其表面上呈遞HLA抗原與所述肽之間形成的復(fù)合物的APC或外體；或(4)導(dǎo)入包括編碼能結(jié)合本發(fā)明的肽的T細胞受體(TCR) 亞單位的多核苷酸的基因。上述APC或外體可通過上文記載的方法來制備，而且(4)之方法的詳情記載于下文“VIII. T細胞受體(TCR) ”部分。
本發(fā)明的CTL可以從要進行治療和/或預(yù)防的患者獲取，而且可以將它們單獨施用，或者與其它藥物(包括本發(fā)明的肽或外體)組合施用以產(chǎn)生調(diào)節(jié)效果。所得到的CTL特異性針對呈遞本發(fā)明的肽(例如與用于誘導(dǎo)的肽相同的肽)的靶細胞起作用。靶細胞可以是內(nèi)源表達ECT2的細胞，例如癌細胞，或者或被ECT2基因轉(zhuǎn)染的細胞；而且因本發(fā)明肽的刺激而在細胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細胞也可充當(dāng)活化CTL攻擊的靶標(biāo)。
VIII. T 細朐等體(TCR)
本發(fā)明還提供包含編碼能夠形成T細胞受體(TCR)的亞單位的多肽的核酸的組合物，及使用該組合物的方法。這些TCR亞基具有形成這樣的TCR的能力，所述TCR 賦予T細胞以針對呈現(xiàn)ECT2的腫瘤細胞的特異性。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，可鑒定出在用本發(fā)明的一種或多種肽誘導(dǎo)的CTL中表達作為TCR亞基的α和β鏈的核酸序列(W02007/032255 及 Morgan et al.，JImmunol, 171，3288(2003))。例如，優(yōu)選用PCR方法分析TCR。用于分析的PCR引物可以是，例如，作為5’側(cè)引物的5’ -R引物 (5' -gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(SEQ ID N0:43)，以及作為 3’側(cè)引物的對 TCR α 鏈 C 區(qū)特異的 3-TRa-C 引物(5，-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)(SEQ ID NO: 44),對 TCR β 鏈 C I 區(qū)特異的 3-TRb-Cl 引物(5，-tcagaaatcctttctcttgac-3’)(SEQ ID NO: 45)，或?qū)CR β 鏈 C2 區(qū)特異的 3_TRbeta_C2 引物(5，_ctagcctctggaatcctttctctt_3’)(SEQ ID NO: 46),但不限于此。衍生的TCR能夠以高親合力結(jié)合展示ECT2肽的靶細胞，并任選地在體內(nèi)和體外介導(dǎo)針對呈遞ECT2肽的靶細胞的高效殺傷。
可以將編碼TCR亞單位的核酸摻入合適的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。這些載體是本領(lǐng)域公知的?？梢詫⑺龊怂峄蛘甙鼈兊妮d體有用地轉(zhuǎn)入T細胞，例如來自患者的T細胞中。有利的是，本發(fā)明提供一種即配即用型組合物，其容許快速修飾患者自己的 T細胞(或其他哺乳動物的T細胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細胞殺傷特性的修飾型T細胞。
特異性的TCR是這樣的受體，它能夠特異性地識別本發(fā)明的肽與HLA分子的復(fù)合物，當(dāng)TCR被呈現(xiàn)在T細胞的表面上時給予T細胞針對靶細胞的特異性。上述復(fù)合物的特異性識別可以通過任何已知方法來確認，優(yōu)選的方法包括，例如，利用HLA分子和本發(fā)明的肽的HLA多聚體染色分析、以及ELISP0T測定。通過實施ELISP0T測定，可以確認在細胞表面上表達TCR的T細胞借助TCR識別細胞，且信號在細胞內(nèi)被傳遞。也可以通過已知方法來確認上述復(fù)合物當(dāng)存在于T細胞表面時能夠給予T細胞以細胞毒活性。優(yōu)選的方法包括， 例如，測定針對HLA陽性靶細胞的細胞毒活性，例如鉻釋放測定。
此外，本發(fā)明提供通過用編碼在HLA-A2的背景下結(jié)合ECT2肽(例如SEQID NO: 1-40)的TCR亞單位多肽的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)而制備的CTL。
經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTL在體內(nèi)能夠歸巢(homing)到癌細胞，并且可以利用公知的體外培養(yǎng)方法擴增(例如 Kawakami et al. , J Immunol.，142，3452-3461 (1989))?？梢岳帽景l(fā)明的T細胞來形成免疫原性組合物,所述組合物可以用來在需要治療或保護的患者中治療或預(yù)防癌癥(W02006/031221)。
IX.藥物物質(zhì)或藥物纟目合物
由于ECT2表達在數(shù)種癌癥(包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC)中與正常組織相比上調(diào)， 本發(fā)明的肽或多核苷酸可用于治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物物質(zhì)或藥物組合物，所述藥劑、物質(zhì)或組合物包括一種或多種本發(fā)明肽或多核苷酸作為活性成分?；蛘?，可以在任何上述外體或細胞(諸如APC)的表面上表達本發(fā)明的肽，以用作藥物物質(zhì)或藥物組合物。另外，上述靶向任何本發(fā)明的肽的CTL也可用作本發(fā)明藥物物質(zhì)或藥物組合物的活性成分。
本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(也稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動物后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。
本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺乳動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、 和黑猩猩，特別是商業(yè)上重要的動物或馴養(yǎng)的動物)中治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供活性成分在制備配制為用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物中的用途，所述活性成分選自下組
(a)本發(fā)明的肽，
(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外體，和
(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。
或者，本發(fā)明進一步提供用于治療或預(yù)防癌癥或腫瘤的選自下組的活性成分
(a)本發(fā)明的肽，
(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
(C)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外體，和
(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。
或者，本發(fā)明進一步提供一種制備用于治療或預(yù)防癌癥或腫瘤的藥劑、藥物組合物或藥物物質(zhì)的方法或工藝，其中該方法或工藝包括配制藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的擔(dān)載體與選自下組的活性成分作為活性成分的步驟
(a)本發(fā)明的肽，
(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外體，和
(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療或預(yù)防癌癥或腫瘤的藥劑、藥物組合物或藥物物質(zhì)的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性成分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟，其中所述活性成分選自下組
(a)本發(fā)明的肽，
(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外體，和
(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。
依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有選自SEQ ID NO: 1_40中的氨基酸序列的肽是可能誘導(dǎo)強且特異性的免疫應(yīng)答的HLA-A2限制性表位肽或候選者。因此，包括任何這些具有SEQ ID NO: 1-40的氨基酸序列的肽的本發(fā)明藥物物質(zhì)或藥物組合物特別適合于對其HLA抗原為HLA-A2的受試者施用。對于包含編碼這些肽中的任一個的多核苷酸(即本發(fā)明的多核苷酸)的藥物物質(zhì)或藥物組合物也是如此。
要用本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物治療的癌癥或腫瘤不受限制，包括其中涉及 (例如過表達)ECT2的任何癌癥，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、 結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC。
本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物除上述活性成分之外還可含有其它具有誘導(dǎo)針對癌性細胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細胞，等等。在本文中，其它具有誘導(dǎo)針對癌性細胞的CTL的能力的肽以癌癥特異性抗原 (例如已鑒定的TAA)為例，但是不限于此。
如果需要，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可任選包括其它治療性物質(zhì)作為活性成分，只要該物質(zhì)不抑制活性成分(例如任何本發(fā)明肽)的抗腫瘤效果。例如，配制劑可包括抗炎物質(zhì)或組合物、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。除了藥物自身中的其它治療性物質(zhì)之外， 本發(fā)明的藥物還可以與一種或多種其它藥理學(xué)物質(zhì)或組合物順序或同時施用。藥物和藥理學(xué)物質(zhì)或組合物的量取決于例如所使用的藥理學(xué)物質(zhì)或組合物的類型、所治療的疾病、及施用的時序安排和路徑。
應(yīng)當(dāng)理解，除在本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可包括與所討論的配制劑類型相關(guān)的本領(lǐng)域常規(guī)的其它作用劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可包括在制品和試劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病(例如癌癥)的病理狀況的材料。制品可包括任何本發(fā)明藥物物質(zhì)或藥物組合物的容器及標(biāo)簽。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器上的標(biāo)簽應(yīng)指明該物質(zhì)或組合物用于治療或預(yù)防疾病的一種或多種狀況。標(biāo)簽還可指明關(guān)于施用的指導(dǎo)等等。
除上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥物物質(zhì)或藥物組合物的試劑盒還可任選進一步包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受的稀釋劑。它可進一步包括從商業(yè)和用戶立場看期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝插頁。
如果期望的話，藥物物質(zhì)或藥物組合物可在藥包或分配器裝置中提供，該藥包或分配器裝置可裝有一個或多個含有活性成分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或塑料箔， 諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。
(I)含有肽作為活性成分的藥物物質(zhì)或藥物組合物
本發(fā)明的肽可以作為藥物物質(zhì)或藥物組合物直接施用，或者如果必要，通過常規(guī)配制方法來配制。在后一種情況中，除本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包括通常用于藥物的擔(dān)載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類擔(dān)載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液、等等。另外，藥物物質(zhì)或藥物組合物可在必要時含有穩(wěn)定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等等。本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可用于抗癌目的。
本發(fā)明的肽可制備成組合，其包含兩種或更多種本發(fā)明肽，以在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL。 肽可以形成雞尾酒，或者可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此綴合。例如，可以將各個肽化學(xué)連接或表達成為單一融合多肽序列，該序列可具有一個或數(shù)個氨基酸作為接頭(例如賴氨酸接頭 K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002, 168:5709-5715)。組合中的各個妝可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā)明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后誘導(dǎo)出與所展示的肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合物特異性起反應(yīng)的CTL?；蛘?，從受試者分離APC (例如 DC)，然后用本發(fā)明的肽刺激它們，來獲得在其細胞表面上展示任何所述本發(fā)明肽的APCJf 這些APC重新施用給受試者而在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出CTL，結(jié)果，可提高針對腫瘤相關(guān)內(nèi)皮的攻擊性。
包括任何本發(fā)明的肽作為活性成分、用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物還可包括佐劑，以便有效地建立細胞免疫。或者，所述藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可以與其它活性成分一起施用，或者可以通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學(xué)活性的蛋白質(zhì)一起(或順序)施用時增強針對該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的任何化合物、物質(zhì)或組合物?？梢詰?yīng)用的佐劑包括文獻中記載的那些(Clin Microbiol Rev 1994，7:277-89)。示例性的佐劑包括但不限于磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、不完全弗氏佐劑(IFA)、完全弗氏佐劑(CFA)、ISCOMatrix、GM-CSF，Cp G，0/W乳液等等，但不限于此。
另外，可方便地使用脂質(zhì)體配制劑、其中肽結(jié)合至幾微米直徑的珠子的顆粒配制劑、和其中脂質(zhì)結(jié)合至肽的配制劑。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的肽還可以作為可藥用鹽的形式施用。所述鹽的優(yōu)選實例包括與堿金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機堿的鹽、與有機酸的鹽、和與無機酸的鹽。
在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可進一步包括引發(fā)(prime) CTL的成分。已經(jīng)確認脂質(zhì)是能夠在體內(nèi)引發(fā)針對病毒抗原的CTL的物質(zhì)或組合物。例如， 可將棕櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的ε-和α-氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后該脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化。作為脂質(zhì)引發(fā)CTL應(yīng)答的另一個例子，大腸桿菌(E. coli)脂蛋白，諸如三棕櫚?；?S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS),當(dāng)與適宜的肽共價連接時,可用來引發(fā)CTL (參見例如Deres et al. , Nature 1989，342:561-4)。
施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。本發(fā)明肽的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)加以調(diào)整，通常是O. OOlmg 至IOOOmg,例如O. Olmg至IOOmg,例如O. Img至IOmg,而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。
(2)含有多核苷酸作為活性成分的藥物物質(zhì)或藥物組合物
本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物也可含有處于可表達形式的編碼本文中公開的肽的核酸。在本文中，短語“處于可表達形式的”意味著多核苷酸在導(dǎo)入細胞時會在體內(nèi)表達成誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表達所必需的調(diào)節(jié)元件。多核苷酸可具有為實現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細胞的基因組所需的配置(關(guān)于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR&Capecchi MR, Cell 1987，51:503-12)。還參見例如 Wolff et al. , Science 1990，247:1465-8;美國專利 No. 5， 580，859; 5，589，466; 5，804，566; 5，739，118; 5，736，524; 5，679，647;及 W098/04720)?；?DNA的投遞技術(shù)的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導(dǎo)的)投遞、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介導(dǎo)的(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的投遞(參見例如美國專利No. 5，922，687)。
本發(fā)明的肽還可用病毒或細菌載體來表達。表達載體的例子包括減毒病毒宿主， 諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如牛痘病毒作為載體來表達編碼肽的核苷酸序列。 在導(dǎo)入宿主后，重組牛痘病毒表達表達免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應(yīng)答。可用于免疫接種方案的牛痘載體和方法記載于例如美國專利No. 4，722，848。另一種載體是卡介苗(BCG， Bacille Calmette Guerin)。BCG 載體記載于 Stover et al. , Nature 1991,351:456-60。 有很多種可用于治療性施用或免疫接種的其它載體是容易想到的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此類。參見例如 Shata et al. , Mol Med Today 2000，6:66-71; Shedlocket al. , J Leukoc Biol 2000,68:793-806;Hipp et al. , In Vivo 2000,14:571-85。
將多核苷酸投遞入患者可以是直接的，其中使受試者直接暴露于攜帶多核苷酸的載體，或者是間接的，其中首先在體外用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)化細胞，然后將細胞移植入患者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。
關(guān)于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy1993， 12:488-505;Wu and ffu,Biotherapy 1991,3:87-95;Tolstoshev,Ann RevPharmacol Toxicol 1993，33:573-96;MulIigan, Science 1993,260:926-32;M organ&Anderson, Ann Rev Biochem 1993，62:191-217;Trends inBiotechnology 1993，11(5):155-215。 在 eds.Ausubel et al. , Current Protocols inMolecular Biology, John ffiley&Sons, NY,1993;及 Krieger,于 Gene Transferand Expression,A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990中描述的重組DNA技術(shù)領(lǐng)域的公知方法可應(yīng)用于本發(fā)明。
施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。合適的擔(dān)載體或經(jīng)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細胞中的多核苷酸的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)加以調(diào)整,通常是O. OOlmg至lOOOmg，例如 O. Olmg至IOOmg,例如O. Img至IOmg,而且可以每數(shù)天施用一次至每數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。
X.使用肽、外體、APC和CTL的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的肽和編碼此類肽的多核苷酸可用于制備或誘導(dǎo)APC和CTL。本發(fā)明的外體和APC也可用于誘導(dǎo)CTL。以及用于誘導(dǎo)針對癌癥或腫瘤的免疫應(yīng)答。所述肽、多核苷酸、外體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要該其他的化合物不抑制CTL誘導(dǎo)能力。因此，任何前文所述的本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物均可用于誘導(dǎo)CTL。除它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于誘導(dǎo)APC，如下文解釋的。
(I)誘導(dǎo)抗原呈遞細胞(APC)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或多核苷酸來誘導(dǎo)具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法。
本發(fā)明的方法包括在體外、離體或體內(nèi)使APC與本發(fā)明的肽接觸的步驟。例如，離體將APC與肽接觸的方法可包括下述步驟
a :從受試者收集APC ;和
b :使步驟a的APC與肽接觸。
APC不限于特定種類的細胞，而且包括DC、Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞、和活化的T細胞，已知它們在它們的細胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細胞識別。優(yōu)選地，可使用DC，因為DC是APC中具有最強CTL誘導(dǎo)能力的。任何本發(fā)明肽都可以單獨或與其它本發(fā)明的肽一起使用。
另一方面，當(dāng)將本發(fā)明的肽施用給受試者時，APC在體內(nèi)接觸到所述肽，結(jié)果，在受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC。因此，本發(fā)明包括將本發(fā)明的肽施用于受試者。類似地，當(dāng)將處于可表達形式的本發(fā)明的多核苷酸施用于受試者時，本發(fā)明的肽在體內(nèi)表達并與APC接觸，結(jié)果，在受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC。因此，本發(fā)明還可包括將本發(fā)明的多核苷酸施用于受試者。“可表達的形式”描述于上文“IX.藥物物質(zhì)和藥物組合物，(2)含有多核苷酸作為活性組分的藥物物質(zhì)或藥物組合物”部分。
此外，本發(fā)明可包括將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入APC以誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的 APC0例如，該方法可包括下述步驟
a 自受試者收集APC ；并
b :導(dǎo)入編碼本發(fā)明肽的多核苷酸。
步驟b可如上文“VI.抗原呈遞細胞”部分中所述來實施。
或者，本發(fā)明提供了一種用于制備特異性誘導(dǎo)針對ECT2的CTL活性的抗原呈遞細胞(APC)的方法，其中所述方法可包括下述步驟之一
(a)在體外、離體或體內(nèi)使APC與本發(fā)明的肽接觸；和
(b)將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC中。
(2)誘導(dǎo)CTL的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的肽、多核苷酸、或外體或APC來誘導(dǎo)CTL的方法。
本發(fā)明還提供了使用編碼能形成T細胞受體(TCR)亞單位的多肽的多核苷酸來誘導(dǎo)CTL的方法，所述TCR亞單位識別本發(fā)明的肽與HLA抗原的復(fù)合物。優(yōu)選地，所述誘導(dǎo) CTL的方法可包括選自下組的至少一個步驟
a)使⑶8陽性T細胞與抗原呈遞細胞和/或外體接觸，所述抗原呈遞細胞和外體在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物；和
b)向CD8陽性T細胞中導(dǎo)入編碼能夠形成TCR亞單位的多肽的多核苷酸，所述TCR 亞單位可識別HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物。
當(dāng)本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外體被施用給受試者后，受試者的身體中誘導(dǎo)出 CTL，而且靶向癌細胞的免疫應(yīng)答的強度增強。因此，本發(fā)明的方法包括將本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外體施用于受試者的步驟。
或者，也可通過離體使用它們來誘導(dǎo)CTL，并且在誘導(dǎo)CTL后，可將活化的CTL返還受試者。例如，該方法可包括下述步驟25
a:自受試者收集APC;
b :用肽接觸步驟a的APC ;并
c :將步驟b的APC與⑶8陽性細胞共培養(yǎng)。
上文步驟c中要與⑶8陽性細胞共培養(yǎng)的APC也可通過將包括本發(fā)明多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移入如上文“VI.抗原呈遞細胞”部分所述的APC來制備，但是本發(fā)明不限于此，而且涵蓋任何在表面上有效呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的APC。
作為此類APC的替代，也可使用在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的外體。即，本發(fā)明可包括將在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的外體共培養(yǎng)的步驟。此類外體可通過上文“V.外體”部分中描述的方法來制備。
另外，可通過將包括編碼能與本發(fā)明的肽結(jié)合的TCR亞單位的多核苷酸的基因?qū)擘?陽性細胞來誘導(dǎo)CTL。此類轉(zhuǎn)導(dǎo)可如上文“VIII. T細胞受體(TCR) ”部分中所述來實施。
另外，本發(fā)明提供了一種制造用于誘導(dǎo)CTL的藥用物質(zhì)或藥物組合物的方法或工藝，其中該方法包括混合或 配制本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟。
(3)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法
此外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對涉及ECT2的疾病的免疫應(yīng)答的方法。合適的疾病可包括癌癥，其例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC。
本發(fā)明的方法可包括施用含有任何本發(fā)明肽或編碼它們的多核苷酸的物質(zhì)或組合物的步驟。本發(fā)明的方法還涵蓋施用呈遞任何本發(fā)明肽的外體或APC。關(guān)于詳情參見 “IX.藥用物質(zhì)或藥物組合物”項，特別是描述本發(fā)明的藥用物質(zhì)或藥物組合物作為疫苗的用途的部分。另外，可用于本發(fā)明誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法的外體和APC詳細描述于上文“V.外體”、“VI.抗原呈遞細胞(APC) ”、和“X.使用肽、外體、APC和CTL的方法”的⑴和⑵部分。
本發(fā)明還提供了一種制造用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥用物質(zhì)或藥物組合物的方法或工藝，其中該方法可包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟。
或者，本發(fā)明的方法可包括施用本發(fā)明的疫苗或藥物組合物的步驟，所述疫苗或藥物組合物包含
(a)本發(fā)明的肽；
(b)處于可表達的形式的編碼如本文公開的此類肽的核酸；
(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外體；或
(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。
在本發(fā)明的語境中，過表達ECT2的癌癥可用這些活性組分來治療。所述癌癥的例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC。因而，在施用包括活性組分的疫苗或藥物組合物之前，優(yōu)選確認要治療的細胞或組織中的ECT2表達水平與同一器官的正常細胞相比是否增強了。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療(過)表達ECT2的癌癥的方法，該方法可包括下述步驟
i)測定自具有要治療的癌癥的受試者獲得的細胞或組織中的ECT2表達水平；
ii)將該ECT2表達水平與正常對照比較；并
iii)對具有與正常對照相比過表達ECT2的癌癥的受試者施用至少一種選自上文所述(a)至⑷的成分。
或者，本發(fā)明還提供包括至少一種選自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或藥物組合物，其用于對具有過表達ECT2的癌癥的受試者施用。換言之，本發(fā)明進一步提供了用于鑒定要用本發(fā)明ECT2多肽來治療的受試者的方法，所述方法包括測定源自受試者的癌細胞或組織中的ECT2表達水平的步驟，其中該水平與該基因的正常對照水平相比的升高指示該受試者可能具有可用本發(fā)明ECT2多肽來治療的癌癥。本發(fā)明的治療癌癥的方法在下面更加詳細的加以敘述。
任何源自受試者的細胞或組織均可用于測定ECT2表達水平，只要其包括目標(biāo)的 ECT2轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。合適樣品的例子包括但不僅限于身體組織與體液，例如血液、痰與尿液。優(yōu)選地，源自受試者的細胞或組織樣品含有這樣的細胞群體，該群體包括上皮細胞，更優(yōu)選癌性上皮細胞或源自懷疑為癌性的組織的上皮細胞。進一步，如果必要，可從所得的身體組織與體液中純化所述細胞，然后將其用作源自受試者的樣品。
需用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不僅限于例如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。
根據(jù)本發(fā)明，可以測定在自受試者獲得的細胞或組織中ECT2的表達水平。表達水平可在轉(zhuǎn)錄(核酸)產(chǎn)物水平確定，使用本領(lǐng)域已知方法。舉例而言，ECT2的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量。檢測可在芯片、陣列等等上實施。對檢測 ECT2的表達水平而言，可優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用ECT2的序列信息制備上述探針。舉例而言，ECT2的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物來標(biāo)記，例如染料、熒光物質(zhì)和同位素，且所述基因的表達水平可以作為所雜交的標(biāo)記物的強度檢測。
此外，ECT2(例如SEQ ID NO:42)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還可通過基于擴增的檢測方法(例如， RT-PCR)使用引物定量。此類引物可基于所述基因的可得序列信息制備。
具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或低嚴(yán)格條件下與ECT2的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的， 而且在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察到。 一般地，嚴(yán)格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強度和PH下的熱熔點(Tm)低大約5° C。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm，平衡時50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件會是這樣的其中鹽濃度小于大約I. OM鈉離子，典型地大約 O. 01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，ρΗ7· 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30° C，用于較長的探針或引物是至少大約60° C。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定物質(zhì)，例如甲酰胺，來實現(xiàn)。
本發(fā)明的探針或引物典型地是基本上純化的寡核苷酸。寡核苷酸典型地包括這樣的核苷酸序列區(qū)域，其在嚴(yán)格條件下與包括ECT2序列的核酸的至少大約2000，1000，500， 400，350，300，250，200，150，100，50，或25個連續(xù)有義鏈核苷酸序列，或者包括ECT2序列的核酸的反義鏈核苷酸序列，或者這些序列的天然存在的突變體雜交。尤其是，例如，在優(yōu)選的實施方案中，可以使用長度為5-50的寡核苷酸作為引物來擴增要檢測的基因。更優(yōu)選地，可以用特定大小，一般是長度15-30b的寡核苷酸探針或引物來檢測ECT2基因的mRNA 或 cDNA。
在優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸探針或引物的長度可以從15-25中選擇。使用此類寡核苷酸探針或引物檢測基因的測定程序、裝置或試劑是公知的(例如寡核苷酸微陣列或PCR)。在這些測定中，探針或引物也可以包括標(biāo)簽或接頭序列。此外，可以使用可檢測的標(biāo)記物或待捕捉的親和配體來修飾探針或引物?；蛘?，在基于雜交的檢測程序中，也可以使用長度為數(shù)百個(例如約100-200個)堿基至數(shù)千個(例如約1000-2000個)堿基的多核苷酸用于探針(例如Northern印跡測定或cDNA微陣列分析)。
或者，可以檢測翻譯產(chǎn)物以進行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定ECT2蛋白(SEQ ID NO:42)或其免疫學(xué)活性片段的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定方法， 此類方法使用特異識別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對ECT2蛋白的結(jié)合能力即可。本發(fā)明也提供這樣的針對本發(fā)明的肽及的抗體及其片段。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。
作為另一種基于ECT2的翻譯產(chǎn)物檢測ECT2基因的表達水平的方法，可利用針對 ECT2蛋白的抗體通過免疫組織化學(xué)分析測量其染色的強度。意即，在這種測量中，強染色表明所述蛋白質(zhì)存在/水平增加，且同時表明ECT2基因的高表達水平。
對于癌細胞中的靶基因(例如ECT2基因)，如果其較之靶基因的對照水平(例如正常細胞中的水平)增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過I. I倍，超過I. 5倍，超過2. O倍，超過5. O倍，超過10倍或者更多，則可以認為其在癌細胞中的表達水平增加了。
對照水平可以與癌細胞同時確定，使用先前從疾病狀態(tài)(患癌或未患癌)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得的正常細胞可用作正常對照?；蛘?，對照水平可以借助統(tǒng)計方法，根據(jù)通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的ECT2基因表達水平獲得的結(jié)果加以確定。進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達模式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中ECT2基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的樣品的組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中ECT2基因表達水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn)值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，平均值+/-2S. D.或平均值+/-3S. D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。
在本發(fā)明的語境中，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平從癌性生物樣品確定，則會稱作“癌性對照水平”。樣品表達水平與對照水平間的差異可以相對已知表達水平不會隨著細胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對照核酸(例如管家基因)的表達水平加以標(biāo)準(zhǔn)化。示例的對照基因包括，但不僅限于，肌動蛋白、甘油醛-3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。
當(dāng)ECT2基因的表達水平相比正常表達水平有所提高，或與癌性對照水平相似/等同，則受試者可診斷為具有要治療的癌癥。
本發(fā)明還提供了一種(i)診斷受試者是否疑似具有要治療的癌癥，和/或(ii)選擇受試者進行癌癥治療的方法，該方法可包括下述步驟
a)測定ECT2在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細胞或組織中的表達水平；
b)將ECT2的表達水平與正常對照水平比較；
c)若ECT2的表達水平與正常對照水平相比升高的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并
d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進行癌癥治療。
或者，此類方法可包括下述步驟
a)測定ECT2在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的細胞或組織中的表達水平；
b)將ECT2的表達水平與癌性對照水平比較；
c)若ECT2的表達水平與癌性對照水平相似或等同的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并
d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進行癌癥治療。
本發(fā)明還提供了用于診斷或確定患有或疑似患有能用本發(fā)明的ECT2多肽來治療的癌癥的受試者的診斷試劑盒，其亦可用于評價和/或監(jiān)測癌癥免疫療法的功效或適用性。優(yōu)選地，癌癥包括，但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC。更特別地，所述試劑盒優(yōu)選可包含至少一種在源自受試者的細胞中檢測ECT2基因表達的試劑，所述試劑可選自下組
(a)用于檢測ECT2基因的mRNA的試劑；
(b)用于檢測ECT2蛋白或其免疫學(xué)活性片段的試劑；和
(c)用于檢測ECT2蛋白的生物學(xué)活性的試劑。
適于檢測ECT2基因mRNA的試劑可包括特異性結(jié)合或識別ECT2mRNA的核酸，諸如具有與ECT2mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對ECT2mRNA 特異性的引物與探針。這類寡核苷酸可基于本領(lǐng)域眾所周知的方法制備。如果需要，用于檢測ECT2mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測 ECT2mRNA的試劑。
另一方面，適于檢測ECT2蛋白或其免疫學(xué)活性片段的試劑可包括針對ECT2蛋白或其免疫學(xué)活性片段的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述試劑,只要所述片段或經(jīng)修飾抗體保留與ECT2蛋白或其免疫學(xué)活性片段的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備此類抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其等價物。進一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號的分子通過直接連接或間接標(biāo)記技術(shù)進行標(biāo)記。標(biāo)記物與標(biāo)記抗體以及檢測抗體與其靶的結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標(biāo)記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種用于檢測ECT2蛋白的試劑。
所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。所述試劑盒還可包含用于結(jié)合針對ECT2基因的探針或者針對ECT2肽的抗體的固體基質(zhì)和試劑、用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基和容器、陽性和陰性對照試劑、和用于檢測針對ECT2肽的抗體的第二抗體。舉例而言，從沒有癌癥或患有癌癥的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進一步包括其它從商業(yè)或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾器、針頭、注射器和帶有使用說明書(例如，書面的、磁帶、CD-ROM等等)的裝箱單。這些試劑之類的可標(biāo)上標(biāo)簽包含在容器中。合適的容器可包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可用多種材料制造，例如玻璃或塑料。
在本發(fā)明的一個實施方案中，當(dāng)所述試劑是針對ECT2mRNA的探針時，所述試劑可固定化于固體基質(zhì)例如多孔條上，以形成至少一個檢測位置。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個位置，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位置。 或者，對照位置可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位置上量較大而在后面的位置上量較小。在加入測試樣品之后， 顯示可檢測信號位置的數(shù)目提供了在樣品中存在的ECT2mRNA量的定量指征。所述檢測位置可設(shè)置成具有任何合適可檢測的形狀，通常是橫跨測試條寬度的條狀或點狀。
本發(fā)明所述試劑盒可進一步包括陽性對照樣品或ECT2標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的所述陽性對照樣品可通過收集ECT2陽性樣品，隨后測定其ECT2水平來制備。此外，可將純化的 ECT2蛋白或多核苷酸添加到不表達ECT2的細胞中以形成所述陽性樣品或ECT2標(biāo)準(zhǔn)樣品。 在本發(fā)明中，純化的ECT2可以是重組蛋白。例如，陽性對照樣品的ECT2水平大于截留值。
在一個實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種診斷試劑盒，其包括能夠特異性識別本發(fā)明抗體的蛋白或其部分蛋白或其免疫原性片段。
本發(fā)明的部分肽的例子包括由本發(fā)明蛋白的氨基酸序列中的至少8個、優(yōu)選15 個、和更優(yōu)選20個連續(xù)氨基酸構(gòu)成的多肽。癌癥可通過使用本發(fā)明的蛋白或肽(多肽)檢測樣品(例如血液、組織)中的抗體來診斷。上文描述了用于制備本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明用于診斷癌癥的方法可通過如上所述測定抗ECT2抗體量和相應(yīng)對照樣品中的量之間的差異來進行。若受試者的細胞或組織含有針對該基因的表達產(chǎn)物(ECT2)的抗體并且測得的抗ECT2抗體的量大于截留值(與正常對照中的水平相比)的話，則該受試者懷疑患有癌癥。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒可包括本發(fā)明的肽及與它結(jié)合的HLA 分子。使用抗原性肽和HLA分子檢測抗原特異性CTL的合適方法早已確立(例如Altman JD et al.，Science. 1996，274(5284) : 94-6)。因此，本發(fā)明肽和HLA分子形成的復(fù)合物可用于檢測方法來檢測腫瘤抗原特異性CTL，由此能夠較早檢測癌癥的復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移。進一步，它可用于選擇適用包含本發(fā)明肽作為活性組分的藥物的受試者或評估該藥物的治療效果O
特別地，依照已知方法(參見例如AltmanJD et al. , Science. 1996, 274(5284) :9 4-6)，可制備放射性標(biāo)記的HLA分子和本發(fā)明肽的寡聚物復(fù)合物，諸如四聚體。可例如通過使用該復(fù)合物來對源自懷疑患有癌癥的受試者的外周血淋巴細胞中的抗原-肽特異性CTL 定量來進行診斷。
本發(fā)明進一步提供了使用如本文所述的肽表位來評估受試者的免疫學(xué)應(yīng)答的方法或診斷試劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，可使用本文所述的HLA-A02限制肽作為試劑30來評估或預(yù)測受試者的免疫應(yīng)答。要評估的免疫應(yīng)答可以是通過在體外或在體內(nèi)使免疫原接觸免疫活性細胞來誘導(dǎo)的。在一些實施方案中，任何可導(dǎo)致識別和結(jié)合肽表位的抗原特異性CTL的生成的物質(zhì)或組合物均可用作所述試劑。肽試劑無需用作所述免疫原。用于此類分析的測定系統(tǒng)包括相對較新的技術(shù)發(fā)展，諸如四聚體、胞內(nèi)淋巴因子染色和干擾素釋放測定法、或ELI SPOT測定法。在優(yōu)選的實施方案中，用于評估免疫應(yīng)答的免疫活性細胞可以選自外周血、外周血淋巴細胞(PBL)、和外周血單個核細胞(PBMC)。用于收集或分離此類免疫活性細胞的方法是本領(lǐng)域公知的。在備選的優(yōu)選的實施方案中，要與肽試劑接觸的免疫活性細胞可以包括抗原呈遞細胞，如樹突細胞。
例如，本發(fā)明的肽可用于四聚體染色測定法，評估外周血單個核細胞在暴露于腫瘤細胞抗原或免疫原后抗原特異性CTL的存在。HLA四聚體復(fù)合物可用于直接顯現(xiàn)抗原特異性CTL(參見例如Ogg et al. , Science 279:2103-2106，1998;和Altman et al, Science 174:94-96, 1996)和測定抗原特異性CTL群體在外周血單個核細胞樣品中的頻率。使用本發(fā)明肽的四聚體試劑可如下所述來生成。
與HLA分子結(jié)合的肽在相應(yīng)HLA重鏈和β 2_微球蛋白存在下重折疊以生成三分子復(fù)合物。在該復(fù)合物中，重鏈的羧基末端在先前工程化到蛋白質(zhì)中的位點處被生物素化。 然后，將鏈親和素素添加至復(fù)合物以形成由三分子復(fù)合物和鏈親和素組成的四聚體。借助熒光標(biāo)記的鏈親和素，可利用該四聚體對抗原特異性細胞染色。然后可例如通過流式細胞術(shù)鑒定細胞。此類分析可用于診斷或預(yù)后目的。通過該規(guī)程鑒定的細胞也可用于治療目的。
本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明肽的用于免疫回憶應(yīng)答的試劑(參見例如 Bertoni et al,J. Clin. Invest. 100:503-513, 1997 和 Penna et al. , J Exp. Med. 174:1565-1570, 1991)。例如，可使用特定肽對來自具有要治療的癌癥的個體的患者 PBMC樣品分析抗原特異性CTL的存在。含有單個核細胞的血液樣品可如下評估培養(yǎng)PBMC， 并用本發(fā)明的肽刺激該細胞。適宜培養(yǎng)時段后，可對擴增的細胞群體進行分析，例如分析 CTL活性。
肽還可作為試劑用于評估疫苗的功效。可使用例如上文所述方法來分析自疫苗接種免疫原的患者獲得的PBMC。測定患者的HLA型，并選擇識別患者中存在的等位基因特異性分子的肽表位試劑進行分析。疫苗的免疫原性可通過PBMC樣品中表位特異性CTL的存在來指示。本發(fā)明的肽還可用于制備抗體，使用本領(lǐng)域公知技術(shù)(參見例如 CURRENTPR0T0C0LSINIMMUN0L0GY，Wiley/Greene, NY ;和 AntibodiesA Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),其可作為試劑用于診斷、檢測或監(jiān)測癌癥。此類抗體可包括識別HLA分子背景中的肽的抗體，即結(jié)合肽-MHC復(fù)合物的抗體。
本發(fā)明的肽和組合物還具有多種其他應(yīng)用，本文中描述了其中一些。例如，本發(fā)明提供了一種用于診斷或檢測以ECT2免疫原性多肽表達為特征的病癥的方法。這些方法涉及測定ECT2HLA結(jié)合肽、或ECT2HLA結(jié)合肽與I類HLA分子形成的復(fù)合物在生物學(xué)樣品中的表達。肽或肽和I類HLA分子形成的復(fù)合物的表達可通過用針對肽或復(fù)合物的結(jié)合配偶測定來測定或檢測。在一個優(yōu)選的實施方案中，針對肽或復(fù)合物的結(jié)合配偶可以是識別和特異性結(jié)合該肽的抗體。ECT2在生物學(xué)樣品諸如腫瘤活檢中的表達也可使用ECT2引物通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增方案來測試。本文中呈現(xiàn)了腫瘤表達的一個例子，而且用于ECT2擴增的例示性條件和引物的進一步公開內(nèi)容可見于W02003/27322，茲通過提述并入其全部內(nèi)容。
優(yōu)選地，診斷方法涉及使自受試者分離的生物學(xué)樣品接觸對ECT2HLA結(jié)合肽特異性的作用劑以檢測ECT2HLA結(jié)合肽在該生物學(xué)樣品中的存在。如本文中使用的，“接觸”意味著在適宜條件(例如濃度、溫度、時間、離子強度)下放置生物學(xué)樣品使其足夠接近所述作用劑，以容許作用劑和生物學(xué)樣品中存在的ECT2HLA結(jié)合肽之間的特異性相互作用。一般地，作用劑接觸生物學(xué)樣品的條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的可促進生物學(xué)樣品中分子與其關(guān)聯(lián)物(例如蛋白質(zhì)與其受體關(guān)聯(lián)物、抗體與其蛋白質(zhì)抗原關(guān)聯(lián)物、核酸與其互補序列關(guān)聯(lián)物)之間的特異性相互作用的條件。用于促進分子與其關(guān)聯(lián)物之間的特異性相互作用的例示性條件記載于授權(quán)給Low等人的美國專利No. 5，108, 921,茲通過提述并入其全部內(nèi)容。
本發(fā)明的診斷方法可以在體內(nèi)和/或在體外實施。因而，生物學(xué)樣品在本發(fā)明中可位于體內(nèi)或體外。例如，生物學(xué)樣品可以是體內(nèi)組織，而且可使用對ECT2免疫原性多肽特異性的作用劑來檢測此類分子在組織中的存在?；蛘撸稍隗w外收集或分離生物學(xué)樣品 (例如血液樣品、腫瘤活檢、組織提取物)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，生物學(xué)樣品可以是含有細胞的樣品，更優(yōu)選自要診斷或治療的受試者收集的含有腫瘤細胞的樣品。
或者，診斷可使用容許通過對熒光素標(biāo)記的HLA多聚體復(fù)合物染色而直接定量抗原特異性 T 細胞的方法來進行(例如 Altman, J. D. et al. , 1996, Science274:94; Altman, J. D. et al. , 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10330)。還提供了對胞內(nèi)淋巴因子的染色和干擾素-Y釋放測定法或ELISP0T測定法。多聚體染色、胞內(nèi)淋巴因子染色和ELISP0T測定法都表現(xiàn)出比更常規(guī)的測定法靈敏至少10倍(Murali-Krishna，K. et al. , 1998, Immunity 8:177; Lalvani, A. et al. , 1997, J. Exp. Med. 186:859; Dunbar, P. R. et al.，1998，Curr. Biol. 8:413)。也可使用五聚體(例如 US 2004-209295A)、Dextramers (例如 WO 02/072631)、和 Str印tamers (例如 Nature medicine 6.631-637(2002))。
由此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種用于診斷或評價被施用了至少一種本發(fā)明的ECT2肽的受試者的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括下述步驟
(a)在適合誘導(dǎo)對免疫原特異性的CTL的條件下使免疫原與具免疫活性細胞接觸；
(b)檢測或測定步驟(a)中誘導(dǎo)的CTL的誘導(dǎo)水平；和
(c)將所述受試者的免疫應(yīng)答與所述CTL誘導(dǎo)水平相關(guān)聯(lián)。
在本發(fā)明的語境中，免疫原是下述中至少一種(a)選自SEQ ID NO: 1-40的ECT2 肽，(b)具有所述氨基酸序列中已經(jīng)過I個、2個或更多個氨基酸替換而修飾的氨基酸序列的肽。同時，適合誘導(dǎo)免疫原特異性CTL的條件是本領(lǐng)域公知的。例如，可以在體外在免疫原存在下培養(yǎng)具免疫活性細胞來誘導(dǎo)免疫原特異性CTL。為了誘導(dǎo)免疫原特異性CTL，可以將任何刺激因子添加至細胞培養(yǎng)物。例如，IL-2是用于CTL誘導(dǎo)的優(yōu)選的刺激因子。
在一些實施方案中，對要用肽癌癥療法治療的受試者的免疫應(yīng)答的監(jiān)測或評價步驟可以在治療之前、之中和/或之后進行。一般而言，在癌癥治療規(guī)程中，反復(fù)地對要治療的受試者施用免疫原性肽。例如，可以每周施用免疫原性肽3-10周。相應(yīng)地，可以在整個癌癥治療程序中評價或監(jiān)測受試者的免疫應(yīng)答?；蛘撸u價或監(jiān)測免疫應(yīng)答的步驟可以在治療程序完成時進行。
根據(jù)本發(fā)明，免疫原特異性CTL的誘導(dǎo)相對于對照增強，表明要評價或診斷的受試者對已施用的免疫原免疫應(yīng)答。用于評價免疫應(yīng)答的合適的對照可包括，例如，免疫活性細胞未與肽接觸時的CTL誘導(dǎo)水平，或者與具有ECT2肽之外的氨基酸序列(例如隨機氨基酸序列)的對照肽接觸時的CTL誘導(dǎo)水平。在一個優(yōu)選的實施方案中，以序列特異性的方式評價受試者的免疫應(yīng)答，方法是在施用給受試者的各種免疫原之間比較免疫應(yīng)答。具體地，即使當(dāng)數(shù)種ECT2肽的混合物被施用給受試者時，免疫應(yīng)答也會依賴于肽而改變。在這種情況下，通過比較每種肽的免疫應(yīng)答，可以鑒定出受試者對其顯示更高應(yīng)答的肽。
XI.杭體
本發(fā)明進一步提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。優(yōu)選的抗體特異性結(jié)合本發(fā)明的肽且不會結(jié)合(或會微弱結(jié)合)非本發(fā)明的肽?；蛘撸贵w能結(jié)合本發(fā)明的肽及其同源物。 針對本發(fā)明肽的抗體可用于癌癥診斷和預(yù)后測定法、及成像方法學(xué)。類似地，此類抗體可用于其它癌癥的治療、診斷、和/或預(yù)后，只要癌癥患者中也表達或過表達ECT2。此外，胞內(nèi)表達的抗體(例如單鏈抗體)在治療上可用于治療涉及ECT2表達的癌癥，這樣的癌癥的例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、 胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC。
本發(fā)明還提供了多種免疫學(xué)測定法，用于檢測和/或定量ECT2蛋白(SEQID NO:42)或其片段，包括具有選自SEQ ID NO: 1_40的氨基酸的多肽。此類測定法可根據(jù)需要包括一種或多種能夠識別和結(jié)合ECT2蛋白或其片段的抗ECT2抗體。在本發(fā)明中，與ECT2 多肽結(jié)合的抗ECT2抗體優(yōu)選識別具有選自SEQ ID NO: 1_40基酸序列的多肽?？贵w的結(jié)合特異性可用抑制測試來確認。即，當(dāng)要分析的抗體與全長ECT2多肽之間的結(jié)合在任何具有選自SEQ ID NO: 1-40序列的片段多肽存在下受到抑制時，此抗體特異性結(jié)合該片段。在本發(fā)明的語境中，此類免疫學(xué)測定法以本領(lǐng)域公知的各種免疫學(xué)測定形式實施，包括但不限于各種類型的放射免疫測定法、免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測定法(ELIFA)、等等。
本發(fā)明的相關(guān)免疫學(xué)的但非抗體的測定法也包括T細胞免疫原性測定法(抑制性的或刺激性的)以及MHC結(jié)合測定法。另外，本發(fā)明還提供能夠檢測表達ECT2的癌癥的免疫學(xué)成像方法，包括但不限于使用經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明抗體的放射閃爍成像方法。此類測定法在臨床上可用于表達ECT2的癌癥的檢測、監(jiān)測、和預(yù)后，所述癌癥但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和 SCLC。
本發(fā)明還提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以以任何形式使用， 例如單克隆或多克隆抗體，而且包括通過用本發(fā)明的肽免疫動物(諸如家兔)而獲得的抗血清、所有種類的多克隆和單克隆抗體、及通過遺傳重組生成的人抗體和人源化抗體。
本發(fā)明的作為抗原用于獲得抗體的肽可來源于任何動物物種，但優(yōu)選來源于哺乳動物，諸如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選來源于人。來源于人的肽可以由本文所公開的核苷酸或氨基酸序列獲得。
根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的肽可以是完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分肽。部分肽可以包含例如本發(fā)明肽的氨基(N)末端或羧基(C)末端片段。
在本文中，抗體定義為能與ECT2肽的全長或片段起反應(yīng)的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體可識別具有選自SEQ ID NO: 1-40的氨基酸序列的ECT2的片段肽。用于合成寡肽的方法是本領(lǐng)域公知的。合成后，可任選在作為免疫原使用之前純化肽。 在本發(fā)明的語境中，寡肽(例如9或10聚物)可與擔(dān)載體綴合或連接以增強免疫原性。匙孔 +成血藍蛋白(KLH)作為擔(dān)載體是公知的。用于綴合KLH和肽的方法也是本領(lǐng)域公知的。
或者，可以將編碼本發(fā)明肽或其片段的基因插入已知的表達載體，然后用該載體轉(zhuǎn)化本文所述宿主細胞?？梢酝ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細胞外部或內(nèi)部回收所需肽或其片段，然后可將其用作抗原?；蛘?，表達肽的完整細胞或其溶胞物或者化學(xué)合成的肽也可用作抗原。
可以用抗原免疫任何哺乳動物，但優(yōu)選考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性。通常，可使用卩齒齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長目(Primate)的動物。 嚙齒科動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形科動物包括例如家兔。靈長科動物包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old worldmonkey))諸如食蟹猴(Macaca fascicularis) > 恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。
用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域已知的。腹膜內(nèi)注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體的說，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，可將抗原懸浮液與適量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑諸如弗氏(Freund)完全佐劑混合，制成乳狀液，然后施用于哺乳動物。優(yōu)選的是，其后每4-21天施用數(shù)次與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原。還可使用適宜的擔(dān)載體進行免疫。如上所述進行免疫后，可通過標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗血清中所需抗體的量的增加。
可以如下制備針對本發(fā)明肽的多克隆抗體從經(jīng)過免疫的哺乳動物(該哺乳動物經(jīng)檢驗其血清中所需抗體增加)收集血液,并通過任何常規(guī)方法從血液中分離血清。多克隆抗體可包括含有多克隆抗體的血清，以及可以從所述血清中分離的、含有該多克隆抗體的級分?？梢允褂美缗悸?lián)有本發(fā)明肽的親和柱從僅識別本發(fā)明肽的級分中制備免疫球蛋白G或M，并進一步使用蛋白A或蛋白G柱純化該級分。
為了制備單克隆抗體，從經(jīng)過抗原免疫并如上所述檢查出血清中所需抗體水平升高的哺乳動物收集免疫細胞，并進行細胞融合。用于細胞融合的免疫細胞可優(yōu)選獲自脾。其它要與上述免疫細胞融合的優(yōu)選親本細胞包括例如哺乳動物的骨髓瘤細胞，更優(yōu)選具有為了用藥物選擇融合細胞而獲得的特性的骨髓瘤細胞。
可根據(jù)已知的方法，例如Milstein 等(Galfre 和 Milstein, Methods Enzymo173:3-46 (1981))的方法，將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞進行融合。
對于由細胞融合得到的雜交瘤，可在標(biāo)準(zhǔn)選擇培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)以進行選擇。通常，細胞培養(yǎng)在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)進行數(shù)天至數(shù)周，培養(yǎng)的時間足以使除了所需雜交瘤之外的所有其它細胞(非融合的細胞) 死亡。然后，可進行標(biāo)準(zhǔn)有限稀釋(standardlimiting dilution)來篩選和克隆生成所需抗體的雜交瘤細胞。
除了上述用抗原免疫非人動物來制備雜交瘤的方法外，還可以在體外用肽、表達肽的細胞或其溶胞物免疫人淋巴細胞，諸如那些感染了 EB病毒的人淋巴細胞。然后，使經(jīng)過免疫的淋巴細胞與能夠無限分裂的源自人的骨髓瘤細胞諸如U266融合，以產(chǎn)生期望的生成能夠與所述肽結(jié)合的人抗體的雜交瘤(已公開但未審查的日本專利申請No. Sho3463-17688)。
隨后將所得雜交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的單克隆抗體可通過例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)有本發(fā)明肽的親和柱進行純化。 本發(fā)明的抗體不僅可用于純化和檢測本發(fā)明的肽，還可以用作本發(fā)明肽的激動劑和拮抗劑的候選物。
或者，可以通過癌基因使生成抗體的免疫細胞(諸如經(jīng)過免疫的淋巴細胞)永生化，并用于制備單克隆抗體。
如此獲得的單克隆抗體也可以使用遺傳工程技術(shù)來重組制備(參見例如 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies,由MacMillanPublishers LTD在英國出版(1990))。例如，可以從生成抗體的免疫細胞諸如雜交瘤或經(jīng)免疫淋巴細胞克隆編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體，并導(dǎo)入宿主細胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供如上所述制備的重組抗體。
此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或經(jīng)過修飾的抗體，只要它結(jié)合一種或多種本發(fā)明的肽。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或?qū)碜訦鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv) (Huston et al. , ProcNatl Acad Sci USA 85:5879-83 (1988))。更具體的說，可以通過用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來生成抗體片段。或者，可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體，并在合適的宿主細胞中表達(參見例如 Co et al. , J Immunol 152:2968-76 (1994) ; Better and Horwitz, Methods Enzymol 178:476-96(1989) ; Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178:497-515(1989);Lamoyi, Methods Enzymol 121:652-63(1986);Rousseaux et al., MethodsEnzymol 121: 663-9(1986);Bird and Walker, Trends Biotechnol 9:132-7(1991))。
抗體可以通過與多種分子諸如聚乙二醇(PEG)綴合來修飾。本發(fā)明提供了經(jīng)過這樣修飾的抗體。可通過化學(xué)修飾抗體來獲得經(jīng)過修飾的抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的。
或者，可以以源自非人抗體的可變區(qū)與源自人抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體或者包含源自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、源自人抗體的框架區(qū)(FR)及恒定區(qū)的人源化抗體的形式來獲得本發(fā)明的抗體。此類抗體可依照已知技術(shù)來制備。人源化可通過用嚙齒類的⑶R或⑶R序列替換人抗體的相應(yīng)序列來進行(參見例如Verhoeyen et al. , Science 239:1534-1536(1988))。因而，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中人可變域的一小部分已被來自非人物種的相應(yīng)序列所替換。
也可以使用完全的人抗體，這樣的抗體除了人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)。此類抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來制備。例如，體外方法包括使用展示在噬菌體上的人抗體片段的重組文庫(例如Hoogenboom&ffinter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991))。 類似的，可通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或完全滅活的小鼠，來生成人抗體。該方法記載于例如美國專利Nos. 6，150，584 ;5，545，807 ； 5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016。
可以將如上獲得的抗體純化至同質(zhì)。例如，可依照用于一般蛋白質(zhì)的分離和純化方法進行抗體的分離和純化。例如，可以通過適當(dāng)選擇和組合使用柱層析諸如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦來分出和分離抗體(Antibodies:A Laboratory Manual. Ed Harlow 和 David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)),但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的可使用的蛋白 A 柱包括例如 HyperD、POROS 和 Sepharose F. F. (Pharmacia)。
除親和層析外的例示性層析包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析、等等(Strategies for Protein Purification 和 Characterization:A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))?？梢酝ㄟ^液相層析來進行層析規(guī)程,諸如HPLC和FPLC。
例如，可使用吸光度測量、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)和/或免疫熒光來測量本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定化在板上，將本發(fā)明的肽施加到該板上，再施加含有期望的抗體的樣品， 諸如生成抗體的細胞的培養(yǎng)物上清液或純化的抗體。然后施加用酶(諸如堿性磷酸酶)標(biāo)記的、識別所述第一抗體的第二抗體，并將板溫育。接著，在洗滌后，向板中加入酶底物，諸如磷酸對硝基苯酯，并測量吸光度以評估樣品的抗原結(jié)合活性?？梢允褂秒牡钠?，諸如 C-末端或N-末端片段作為抗原來評估抗體的結(jié)合活性?？梢允褂肂IAcore (Pharmacia) 來評估本發(fā)明抗體的活性。
上述方法允許通過將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明肽的樣品，并檢測或測量由抗體與肽形成的免疫復(fù)合物，來檢測或測量本發(fā)明的肽。
因為依照本發(fā)明的肽檢測或測量方法可特異性的檢測或測量肽，所以該方法可用于使用肽的各種實驗。
XII.載體和宿主細胞
本發(fā)明還提供了導(dǎo)入有編碼本發(fā)明肽的核苷酸的載體和宿主細胞。本發(fā)明的載體可用于在宿主細胞中維持本發(fā)明的核苷酸、尤其是DNA，用于表達本發(fā)明的肽，或者用于施用本發(fā)明的核苷酸以用于基因療法。
當(dāng)宿主細胞為大腸桿菌且在大腸桿菌(例如JM109、DH5a、HBlOl或XLlBlue)中大量擴增和生成載體時，載體應(yīng)具有能在大腸桿菌中擴增的“(復(fù)制)起點”和用于選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)志基因(例如通過藥物諸如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等進行選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、 pBluescript、pCR_Script等。另外，與上述載體一樣，pGEM_T、pDIRECT和pT7也可以用于亞克隆和提取cDNA。當(dāng)使用載體來生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，表達載體是有用的。
例如，要在大腸桿菌中表達的表達載體應(yīng)具備上述在大腸桿菌中擴增的特征。當(dāng)使用大腸桿菌諸如JM109、DH5a、HBlOl或XLlBlue作為宿主細胞時，載體應(yīng)具有能在大腸桿菌中高效表達所需基因的啟動子，例如IacZ啟動子(Ward et al. , Nature 341:544-6(1989);FASEB J 6:2422-7 (1992))、araB 啟動子(Better et al. , Science 240:1041-3(1988))、T7 啟動子等。在這方面，可以使用例如 pGEX_5X_I (Pharmacia)、 “QIAexpress系統(tǒng)” (Qiagen)、pEGFP和pET(在這種情況中，宿主優(yōu)選為表達T7RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另外，載體還可以包含用于肽分泌的信號序列。指導(dǎo)肽分泌至大腸桿菌周質(zhì)的例示性信號序列有pelB信號序列(Lei et al.，J Bacteriol 169:4379(1987))。用于將載體導(dǎo)入靶宿主細胞的手段包括例如氯化鈣法和電穿孔法。
除了大腸桿菌夕卜，還可以使用例如源自哺乳動物的表達載體(例如 pcDNA3 (Invitrogen)和 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18 (17):5322 (1990))、pEF、 PCDM8)、源自昆蟲細胞的表達載體(例如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)”(GIBCO BRL)、 pBacPAK8)、源自植物的表達載體(例如pMHl、pMH2)、源自動物病毒的表達載體(例如 pHSV、pMV、pAdexLcw)、源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體(例如pZIpneo)、源自酵母的表達載體 (例如“畢赤酵母表達試劑盒”(Invitrogen)、pNVll、SP-QOI)及源自枯草芽孢桿菌的表達載體(例如PPL608、pKTH50)來生成本發(fā)明的多肽。
為了在動物細胞諸如CHO、COS或NIH3T3細胞中表達載體，載體應(yīng)攜帶在所述細胞中進行表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan et al. , Nature 277:108(1979))、MMLV-LTR 啟動子、EFla 啟動子(Mizushima et al. , Nucleic Acids Res 18:5322(1990))、CMV啟動子、等等，及優(yōu)選用于選擇轉(zhuǎn)化子的標(biāo)志基因(例如通過藥物(例如新霉素、G418)進行選擇的藥物抗性基因)。具有這些特征的已知載體的例子包括例如 pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 和 pOP 13。
提供下面的實施例來例示本發(fā)明及幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來制備和使用本發(fā)明。實施例并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例
材料和方法
細朐系
人B-淋巴母細胞樣細胞系T2 (HLA-A2)和非洲綠猴腎細胞系C0S7購自ATCC。
源自ECT2的肽的候詵者詵擇
使用結(jié)合預(yù)測軟件〃BIMAS〃 (www-bimas. citdcrt. nih. gov/cgi_bin/molbio/hla_ bindken_parker_comboform)(Parker et al. (JImmunol 1994， 152(I):163-75)，Kuzushima et al. (Blood 2001, 98(6) : 1872-81))預(yù)測了源自 ECT2 的結(jié)合 HLA_A*0201 分子的 9 聚體和10聚體肽。這些肽由BioSynthesis. (Lewisville, Texas)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成,并通過反相高效液相色譜(HPLC)純化。分別通過分析型HPLC和質(zhì)譜分析來確定肽的純度 (>90%)和身份。將肽以20mg/ml溶解在二甲基亞砜中并保存于-80°C。
體外CTL誘導(dǎo)
使用單核細胞衍生的樹突細胞(DC)作為抗原呈遞細胞來誘導(dǎo)針對呈現(xiàn)在人白細胞抗原(HLA)上的肽的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應(yīng)答。如他處所述(Nakahara S et al. , Cancer Res 2003 Jul 15，63 (14) :4112_8)體外制備 DC。具體地說，對于用 Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液從正常志愿者(HLA_A*0201陽性)分離的外周血單個核細胞(PBMC)，通過粘附塑料組織培養(yǎng)盤(BectonDickinson)加以分離，以將它們作為單核細胞級分加以富集。將富集了單核細胞的群體在含2%熱滅活的自體血清(AS)的AM-V 培養(yǎng)基(Invitrogen)中，在1000U/ml的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(R&D System) 和1000U/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細胞因子誘導(dǎo)的DC在AIM-V培養(yǎng)基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽于37° C沖激3小時。所生成的細胞表觀上在它們的細胞表面上表達DC相關(guān)分子，諸如 ⑶80、⑶83、⑶86和HLA II類(數(shù)據(jù)未顯示)。然后將這些經(jīng)肽沖激的DC用X輻照(20Gy)滅活，并以1:20比例與用⑶8陽性分離試劑盒(Dynal)通過正選擇獲得的自體⑶8+T細胞混合。在48孔板(Corning)中設(shè)立這些培養(yǎng)物；每個孔在O. 5ml AIM-V/2%AS培養(yǎng)基中含有 I. 5xl04 個經(jīng)肽沖激的 DC、3xl05 個 CD8+T 細胞和 10ng/ml IL-7 (R&D System)。3 天后， 給這些培養(yǎng)物補充IL-2 (CHIRON)至終濃度20IU/ml。在第7天和第14天，將T細胞用經(jīng)肽沖激的自體DC進一步刺激。每次通過與上文所述相同的方式來制備DC。在第21天在第三輪肽刺激后測試針對經(jīng)肽沖激的T2細胞的CTL (TanakaH et al. , Br J Cancer 2001 Jan 5，84(1):94-9;Umano Y et al. , Br J Cancer 200IApr 20，84 (8):1052-7;Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15，10 (24):8577-86;Suda T et al. , Cancer Sci 2006 May,97 (5):411-9;Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506)。
CTL擴增規(guī)稈
使用與Riddell 等人(Walter EA et al. , N Engl J Med 1995 Oct19,333(16) : 1038-44; Riddell SR et al.，Nat Med 1996 Feb, 2 (2) : 216-23)記載的方法相似的方法在培養(yǎng)中擴增CTL。將總共5xl04個CTL在25ml AIM-V/5%AS培養(yǎng)基中懸浮， 其中有在40ng/ml抗CD3單克隆抗體(Pharmingen)存在下經(jīng)絲裂霉素C滅活的兩種人 B-淋巴母細胞樣細胞系。啟動培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第 8天和第11天給培養(yǎng)物補加新鮮的含有30IU/ml IL-2的AIM_V/5%AS培養(yǎng)基(Tanaka H et al. , Br J Cancer 2001 Jan 5,84 (I):94-9;Umano Y et al. , Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8):1052-7;Uchida N et al. , ClinCancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86;Suda T et al. , Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9;Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug, 96(8) : 498-506)。
CTL克降的津立
在96圓底微量滴定板(Nalge Nunc International)中進行稀釋以獲得O. 3、 I和3個CTL/孔。在總共150微升/孔的含5%AS的AIM-V培養(yǎng)基中，將CTL與1x104 個細胞/孔的兩種人B-淋巴母細胞樣細胞系、30ng/ml的抗CD3抗體，和125U/ml的 IL-2 一起培養(yǎng)。10天后向培養(yǎng)基中加入50微升/孔的IL-2以達到終濃度125U/ml的 IL-2。在第14天測試CTL活性，并使用如上所述的相同方法擴增CTL克隆(Uchida N et al. , Clin Cancer Res 2004Dec 15,10(24):8577-86;SudaT et al. , Cancer Sci 2006 May,97 (5):411-9;Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug, 96(8):498-506)。
特異件CTL活件
為了檢查特異性CTL活性，實施了干擾素(IFN)I酶聯(lián)免疫斑點(ELISP0T)測定法和IFN-Y酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。具體而言，制備經(jīng)肽沖激的T2 (IxlO4/孔)作為刺激細胞。使用48孔中培養(yǎng)的細胞作為應(yīng)答細胞。依照制造商的規(guī)程實施IFN-Y ELISP0T 測定法和IFN- Y ELISA測定法。
強迫表汰靶基因和/或HLA-A02的細胞的津立
通過PCR來擴增編碼靶基因可讀框或HLA_A*0201的cDNA。將PCR擴增產(chǎn)物克隆入載體。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推薦的規(guī)程將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入 C0S7(靶基因和HLA-A*0201陰性的細胞系)。自轉(zhuǎn)染起2天后，用Versene (Invitrogen) 收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞，并用作CTL活性測定法的靶細胞(5X104個細胞/孔)。
結(jié)果
癌癥中ECT2表汰提iWt
利用cDNA微陣列從不同癌癥中獲得的全局基因表達譜數(shù)據(jù)顯示ECT2 (GenBank Accession No. AY376439，例如SEQ ID No:41)表達升高。ECT2表達在19例膀胱癌中的17 例，12例乳腺癌中的5例，14例宮頸癌中的14例，13例膽管細胞癌中的13例，5例CML中的 5例,8例結(jié)腸直腸癌中的7例，16例食道癌中的12例，16例NSCLC中的6例，10例淋巴瘤中的8例，I例胰腺癌中的I例，13例前列腺癌中的10例，6例腎癌中的3例，及13例SCLC 癌癥中的12例中與相應(yīng)的正常組織相比有效升高(表I)。
表I
在癌組織中與正常相應(yīng)組織相比觀察到ECT2上調(diào)的病例的比例
權(quán)利要求
1.一種分離的肽，其由SEQ ID NO:42的氨基酸序列或其免疫學(xué)活性片段組成，其中所述肽結(jié)合HLA抗原并誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。
2.權(quán)利要求I的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A2。
3.權(quán)利要求I或2的分離的肽，其中所述肽包含選自SEQID NO: 1-40的氨基酸序列。
4.分離的肽，其選自下組(a)結(jié)合HLA抗原并誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，并且由SEQID NO:42的氨基酸序列或其免疫學(xué)活性片段組成的分離的肽；(b)(a)的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A2 ；(c)(a)或(b)的分離的肽，其包含選自SEQ ID NO: 1-40的氨基酸序列；和(d)(a)或(b)的分離的肽，其中所述肽由選自SEQ ID NO: 1-40的氨基酸序列組成，其中替代、缺失或添加了 1、2或幾個氨基酸，條件是所述修飾肽保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。
5.權(quán)利要求4的分離的肽，其由選自SEQID NO: 1-40的氨基酸序列組成，其中所述肽具有下述特征之一或二者(a)自N端起的第二個氨基酸選自亮氨酸或甲硫氨酸；和(b)C端氨基酸選自纈氨酸或亮氨酸。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的分離的肽，其中所述肽是九肽或十肽。
7.—種分離的多核苷酸,其編碼權(quán)利要求1-6中任一項的肽。
8.一種用于誘導(dǎo)CTL的組合物，其中所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-6中任一項的肽，或者一種或多種權(quán)利要求7的多核苷酸。
9.一種用于治療和/或預(yù)防癌癥、和/或防止癌癥手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物，其中所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-6中任一項的肽，或者一種或多種權(quán)利要求7的多核苷酸。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述組合物配制為供施用于HLA抗原為HLA-A2的受試者。
11.權(quán)利要求9或10的藥物組合物，其中所述組合物配制為用于治療癌癥。
12.一種用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細胞(CTL)的方法，其包括選自下組的步驟(a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC與權(quán)利要求1-6中任一項的肽接觸，和(b)將編碼權(quán)利要求1-6中任一項的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC。
13.一種通過包含選自下組的步驟的方法來誘導(dǎo)CTL的方法(a)將CD8陽性T細胞與在表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1_6中任一項的肽的復(fù)合物的APC接觸；(b)將CD8陽性T細胞與在表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1_6中任一項的肽的復(fù)合物的外體接觸；和(c)將包含編碼結(jié)合權(quán)利要求1-6中任一項的肽的T細胞受體(TCR)亞單位多肽的多核苷酸的基因?qū)隩細胞。
14.一種分離的APC，所述APC在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1_6中任一項的肽的復(fù)合物。
15.權(quán)利要求14的APC，其是通過權(quán)利要求12的方法誘導(dǎo)的。
16.一種分離的CTL，其靶向權(quán)利要求1-6中任一項的肽。
17.權(quán)利要求16的CTL，其是通過權(quán)利要求13的方法誘導(dǎo)的。
18.一種在有需要的受試者中誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對受試者施用包含權(quán)利要求1-6中任一項的肽、其免疫學(xué)活性片段、或編碼所述肽或所述片段的多核苷酸的組合物的步驟。
19.針對權(quán)利要求1-6中任一項的肽的抗體或其免疫學(xué)活性片段。
20.—種載體,其包含編碼權(quán)利要求1-6中任一項的肽的核苷酸序列。
21.—種診斷試劑盒,其包含權(quán)利要求1-6中任一項的肽、權(quán)利要求7的核苷酸、或權(quán)利要求19的抗體。
22.權(quán)利要求1-6中任一項的分離的肽或權(quán)利要求7的多核苷酸所編碼的肽，其中所述肽由選自SEQ ID N0:l、3和21的氨基酸序列組成。
全文摘要
本發(fā)明中描述了源自SEQ ID NO:42的分離的肽及其片段，它們結(jié)合HLA抗原并誘導(dǎo)細胞毒性T細胞(CTL)，因此適合用于癌癥免疫治療，更具體地說是癌癥疫苗的語境。本發(fā)明的肽涵蓋上述的氨基酸序列及其修飾的形式，其中替代、缺失、插入或添加了一個、兩個或者數(shù)個氨基酸，只要這樣的修飾形式保留所需原始序列的HLA結(jié)合和/或CTL誘導(dǎo)能力。進一步提供了編碼上述任何肽的核酸，以及包含任何上述肽或核酸的藥劑、藥物物質(zhì)和/或藥物組合物。本發(fā)明的肽、核酸、藥劑、藥物物質(zhì)和藥物組合物在癌癥和腫瘤(包括例如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC)的治療中特別有用。
文檔編號C12N15/09GK102939379SQ201180027360
公開日2013年2月20日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者中村佑輔, 角田卓也, 大澤龍司, 吉村祥子, 渡邊朝久 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司