基于組織因子的腫瘤多肽疫苗、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于組織因子的腫瘤多肽疫苗，為將人源TF基因中的包含表位靶點(diǎn)的序列片段表達(dá)后形成的AnsB-TF融合蛋白。還公開了該腫瘤多肽疫苗的制備方法和應(yīng)用。該本發(fā)明通過基因工程手段將包含表位靶點(diǎn)的TF多肽片段與AnsB載體相連，獲得了一種以組織因子為靶抗原表位的腫瘤多肽疫苗。該疫苗通過對TF表位靶點(diǎn)的主動(dòng)免疫獲得對腫瘤的預(yù)防和治療作用。這種主動(dòng)免疫不但能完全阻斷TF在腫瘤表面的效應(yīng)，還避免了多次給藥的麻煩。
【專利說明】基于組織因子的腫瘤多肽疫苗、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽疫苗、制備方法及其應(yīng)用，尤其是一種腫瘤多肽疫苗、制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]組織因子(tissue factor, TF)的凝血功能眾所周知，它與活化凝血因子W (activated factor W, F Wa)結(jié)合后，形成TFPF YD a復(fù)合物,啟動(dòng)外源性凝血途徑；亦可激活凝血因子XI，啟動(dòng)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)。它是機(jī)體內(nèi)活性最強(qiáng)的促凝物質(zhì)之一，在生理性止、凝血過程及多種血栓栓塞性疾病中發(fā)揮重要作用。然而，TF作為凝血系統(tǒng)中惟一在細(xì)胞表面表達(dá)的跨膜糖蛋白，是否具有受體特性并具備非凝血功能，逐漸成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。近期研究提示，TF具有信號傳導(dǎo)受體的功能，可通過介導(dǎo)多種信號傳導(dǎo)，影響腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移、胚胎發(fā)育、血管新生、炎癥、動(dòng)脈粥樣斑塊形成等多種病理、生理過程。
[0003]以組織因子作為靶點(diǎn)來治療腫瘤是現(xiàn)在腫瘤研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。最直接的優(yōu)點(diǎn)就是靶向性好。正常的生理?xiàng)l件下，TF—般不外露，只有在腫瘤血管內(nèi)皮和腫瘤細(xì)胞中才特異性表達(dá)升高。這就為腫瘤的靶向免疫治療提供了可能。但是如果用TF全蛋白免疫，就很可能帶來全身性的凝血功能障礙。
[0004]國外學(xué)者以組織因子為靶點(diǎn)，進(jìn)行免疫治療，最有成就的進(jìn)展是HU和Garen將免疫球蛋白Gl (IgGl)的Fab段換作凝血因子VII (FVII)，即TF的天然配基，同時(shí)突變FVII的341密碼子:從賴氨酸AAG突變?yōu)楸彼酖CC，使二者結(jié)合以后的促凝活性部分喪失。結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有良好的抗腫瘤作用。但是，他們以TF全蛋白作為靶點(diǎn)，用抗體或FVII進(jìn)行治療，存在著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、工藝難度大、易引發(fā)機(jī)體過敏反應(yīng)等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種以組織因子為靶抗原表位的腫瘤多肽疫苗。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種基于組織因子的腫瘤多肽疫苗，其活性成分為將人源TF基因中的包含表位靶點(diǎn)的DNA序列片段表達(dá)后形成的門冬酰胺酶(AnsB) -TF表位靶點(diǎn)融合蛋白，其中包含的TF表位靶點(diǎn)多肽片段為位于TF蛋白表面的易引起免疫反應(yīng)的多肽片段。
[0007]進(jìn)一步的，所述TF表位靶點(diǎn)多肽片段的序列為:GDWKSKCFYTTDTEraLTDE (SEQ IDNO:1)。
[0008]進(jìn)一步的，所述疫苗在AnsB的C端加入一個(gè)25肽的破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞輔助表位TTP作為支臂，在TTP之后又加了一個(gè)3肽的柔性接頭Ser-Gly-Thr，TF表位靶點(diǎn)多肽片段接于柔性接頭后，形成AnsB-TTP -TF的結(jié)構(gòu)，其序列見SEQ ID NO:2。
[0009]本發(fā)明還提供了上述的基于組織因子的腫瘤多肽疫苗的制備方法，其步驟包括:將人源包含TF表位靶 點(diǎn)的DNA序列片段插入AnsB下游，獲得相應(yīng)的重組基因工程菌；重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后在大腸桿菌中表達(dá)出AnsB-TF表位靶點(diǎn)融合蛋白，經(jīng)純化后得到基于組織因子的腫瘤多肽疫苗。
[0010]進(jìn)一步的，其步驟包括:
(1)用加端PCR的方法在AnsB-TTP序列后加入人源TF基因中的包含表位靶點(diǎn)的DNA序列，獲得AnsB-TTP-TF序列；
(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28-ansB-TTP-TF ；
(3)將重組質(zhì)粒pET28-ansB-TTP-TF轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌中，經(jīng)篩選后的陽性菌
活化培養(yǎng)；
(4)裂解菌體后分離提純，得到AnsB-TF表位靶點(diǎn)融合蛋白。
[0011]本發(fā)明還提供了上述的基于組織因子的腫瘤多肽疫苗在制備預(yù)防和治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明還提供了上述的基于組織因子的腫瘤多肽疫苗在制備預(yù)防和治療乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或肺癌藥物中的應(yīng)用。
[0013]通常，多肽疫苗免疫原性較弱，本發(fā)明通過基因工程手段將包含表位靶點(diǎn)的TF多肽片段與AnsB載體相連，獲得了一種以組織因子為靶抗原表位的腫瘤多肽疫苗。該疫苗通過對TF表位靶點(diǎn)的主動(dòng)免疫獲得對腫瘤的預(yù)防和治療作用。這種主動(dòng)免疫不但能完全阻斷TF在腫瘤表面的效應(yīng)，還避免了多次給藥的麻煩。
[0014]為獲得有酶活性的融合蛋白，本發(fā)明將TF表位靶點(diǎn)多肽片段融合于AnsB的C端而非N端。為增強(qiáng)TF表位的免疫原性，在AnsB和TF之間加入了一個(gè)25肽的破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞輔助表位TTP作為支臂。為保持連接于TTP之后的TF在結(jié)構(gòu)上的柔韌性，在TTP之后又加了一個(gè)3肽的柔性接頭Ser-Gly-Thr，TF接于其后。這些優(yōu)化設(shè)計(jì)有利于AnsB-TF融合蛋白在大腸桿菌的周質(zhì)中形成可溶性表達(dá)且具有催化活性的嵌合酶分子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:基于組織因子的腫瘤多肽疫苗重組質(zhì)粒pET28-ansB-TTP-TF的構(gòu)建過程。
[0016]圖2: SDS-PAGE電泳圖，顯示AnsB-TTP-TF的融合表達(dá)。其中I泳道為marker，2-8泳道為不同時(shí)間點(diǎn)(0，2，4，5，6，7，8小時(shí))AnsB-TTP-TF融合蛋白的表達(dá)情況。 [0017]圖3 =AnsB-TTP-TF融合蛋白沉淀、梯度洗脫后的純化圖譜。
[0018]圖4: ELISA測定結(jié)果圖，顯示AnsB-TTP-TF融合蛋白能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗TF抗體。
[0019]圖5: AnsB-TTP-TF融合蛋白對小鼠黑色素瘤瘤重的抑制效果圖。
[0020]圖6:病理組織切片圖，顯示AnsB-TTP-TF融合蛋白對小鼠黑色素瘤的抑制作用。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例一:載體構(gòu)建
1.1 AnsB-TTP-TF基因的克隆
AnsB-TTP序列來自于本實(shí)驗(yàn)室已有的質(zhì)粒載體。用加端PCR的方法在AnsB-TTP序列后分兩步加入TF基因，就可獲取AnsB-TTP-TF序列:
設(shè)計(jì)共同的上游引物為:
Al:5’ -TAA TAC GAC TCA CTA TA - 3’ (SEQ ID NO:3)
下游引物為:TF-down
第一步下游引物 TF-1:5’ - T GTC AGT AGT GTA GAA GCA TTT GGA TTT CCA GTC ACCGGT ACC AGA AGA GAT TAC AGA C_3’ (SEQ ID NO:4)
第二步下游引物 TF-2:5’ - AAA AAGC TTA ACC GGT TTC GTC AGT CAA GTC GTA TTCAGT GTC AGT AGT GTA GAA GCA T-3’ (SEQ ID NO:5)
上游引物下游含有限制性核酸內(nèi)切酶Afc0I位點(diǎn)，第二步下游引物含有限制性核酸內(nèi)切酶III位點(diǎn)。
[0022]上、下游引物由上海生工生物工程公司合成。
[0023]PCR反應(yīng)體系:
TF cDNA2 μ I
10XPFU PCR buffer10 μ I
上游引物8 μ I
下游引物8 μ I
dNTP8 μ I
PFU DNA PolymeraseI μ I
ddH2063 μ I
總計(jì)100 μ I
設(shè)定PCR反應(yīng)條件:
Group 1: 94 0C 2 min Group 2: 94 0C 30 sec 60 0C 30 sec 72 0C 2 min Group2進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后進(jìn)入Group3 Group3: 72 0C 10 min Group4: 4 0C 10 min
第一步PCR反應(yīng)，加入上游引物Al和第一步下游引物TF-1。
[0024]得到第一步產(chǎn)物AnsB-TTP-TF — STEP-1。然后用得到的第一部產(chǎn)物為模板，加入上游引物Al和各自的第二步下游引物TF-2。進(jìn)行第二步PCR反應(yīng)PCR產(chǎn)物再次進(jìn)行純化回收。就可獲取AnsB-TTP-TF序列: PCR產(chǎn)物的雙酶切:
Buffer Y+ (Takara)5 μ I
AnsB-TTP-TF30 μ I
Hind III (Takara )I μ I
Nco I (Takara)I μ I
ddH2014 μ I
總計(jì)50 μ I
37 °C 反應(yīng) 4h。
[0025]酶切反應(yīng)結(jié)束后，其產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，切下1200 bp左右位置處的瓊脂膠，用上海華舜生物工程有限公司的小量膠回收試劑盒進(jìn)行DNA回收，按試劑盒的純化操作手冊上的步驟進(jìn)行。
[0026]的酶切
Buffer Y+10 μ I
BSA10 μ I
pET28ansB-TTP-CETP 質(zhì)粒 40 μ I Hind III (Takara)2 μ I
Nco I (Takara)2 μ I
ddH2036 μ I
總計(jì)100 μ I
37 °C 反應(yīng) 4h。
[0027]酶切后切膠回收大片段載體部分，即得到歷III和Afco I酶切好的pET28載體。
[0028]連接 連接體系為:
10XT4 ligase Buffer2 μ I
AnsB-TTP-TF5 μ I
ρΕΤ285 μ I
T4 ligase (Takara)I μ I
ddH207 μ I
Total20 μ I
4 °C，連接過夜。
[0029]載體構(gòu)建示意圖如附圖1所示。
[0030]實(shí)施例二:轉(zhuǎn)化和篩選
2.1感受態(tài)轉(zhuǎn)化
取上述5 μ I的連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌BL21(DE3)(制備方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》)后，卡那霉素初篩陽性菌再經(jīng)由酶活力測定篩選，陽性克隆提取質(zhì)粒作為模板，以Τ7啟動(dòng)子作為上游引物，以TF-2作為下游引物，表達(dá)載體pET28ansB-TTP-TF，PCR條件同實(shí)施例一 1.1 ;兩種篩選方法皆是陽性的克隆最后由DNA序列測定來確證AnsB-TTP基因的正確插入。
[0031 ] 門冬酰氨酶酶活定性檢測
門冬酰氨酶酶活定性檢測方法選用萘氏法:(硼酸緩沖液=H2BO3 0.682g，Na2B4O7.1OH2O
0.855g,加蒸懼水至100 ml,pH8.4 ;萘氏試劑:KI 10 g,HgI2 13.5 g,加蒸懼水至100 ml,臨用前用25% NaOH等量混合；底物溶液:0.4 M L-天門冬酰氨；終止試劑:15%三氯乙酸(TCA)溶液)。96孔酶標(biāo)板，每孔加入50 μ I ρΗ8.4硼酸緩沖液和50 μ I 0.4 M的L-天門冬酰氨反應(yīng)液，用滅菌后的槍頭吸取20-30 μ I的菌液(或門冬酰氨酶溶液)，然后移于反應(yīng)液中，37°C反應(yīng)20 min，，接著每孔加入50 μ I的萘氏試劑顯色。陰性對照不加菌液(或門冬酰氨酶溶液)。中等活性顯橙色，高活性顯磚紅色。分別以含有質(zhì)粒pET28-ansB和pKA的菌株為陽性和陰性對照。
[0032]挑取陽性重組子的對應(yīng)單菌落于液體LB培養(yǎng)基，37 °C搖床培養(yǎng)7_10 h。培養(yǎng)物甘油管保存(方法參見:J.薩姆布魯克等.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社)，送上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)一步測序驗(yàn)證。
[0033]實(shí)施例三:融合蛋白的表達(dá)和純化 3.1 pET28ansB-TTP-TF 的工程菌擴(kuò)增
將篩選后得到的陽性工程菌分別活化，取一環(huán)菌，30°C振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量接種到新鮮的含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)3.5小時(shí)，加入培養(yǎng)體積1%的0.5 M乳糖溶液誘導(dǎo)，使培養(yǎng)液中乳糖的終濃度達(dá)到5mM，再繼續(xù)28°C培養(yǎng)4 h后，于5000 rpm離心10 min，收集菌體。
[0034]菌體的裂解
裂解緩沖液:10 mM磷酸緩沖液(PB，pH8.0),l mM EDTA。每克菌按5 ml加裂解緩沖液，另加入 80 μ I 溶菌酶(10 mg/ml), 20 μ I DNAase 1(1 mg/ml)，，于 37°C裂解 I h。40C，10000 rpm, 15 min，上清和沉淀分別取樣，共得上清液350 ml。12%SDS_PAGE電泳檢測結(jié)果表明有20%左右的嵌合酶以可溶性方式存在于上清液中，同時(shí)酶活定性檢測顯示上清液活力很聞。
[0035]裂解上清夜的處理
4°C時(shí)，進(jìn)行飽和硫酸銨分級沉淀，上清和沉淀分別留樣。12%SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果，探索硫酸銨飽和度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用60%飽和度硫酸銨可以去處大部分雜質(zhì)，再用90%硫酸銨沉淀得到目標(biāo)蛋白粗品。以蛋白粗品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如附圖2所示，隨時(shí)間增加(0-8小時(shí))，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21中產(chǎn)生了越來越多的目標(biāo)蛋白AnsB-TTP-TF (40 kD左右)。
[0036]將90%飽和度硫酸銨沉淀物用100 ml, 10 mM, PH=8.0 Tris-Cl緩沖液重新溶解后，置于預(yù)先處理過的透析袋(透過蛋白質(zhì)分子量最大為40 kDa)中，于10 mM, PH=8.0的Tris-Cl緩沖液對其4°C透析,每8 h換一次透析液,共透析48 h。4°C, 10000 rpm, 20 min離心，以去除沉淀。
[0037]陰離子交換柱層析
由于AnsB-TTP-TF的理論等電點(diǎn)分別為pH 5.22，緩沖液的pH值為7.4，高于理論等電點(diǎn)，因此選用陰離子交換介質(zhì)。將處理后的CelIulose-DEAE 52裝柱(2.6 X 20 cm柱體積50 ml)后用20 mM,PH=7.4的Tris-Cl緩沖液平衡備用。將透析后的溶液用蠕動(dòng)泵加入Cellulose-DEAE 52離子交換柱中，上樣流速為I ml/min，280 nm檢測，收集流出液，取樣，備 15% SDS-PAGE 檢測。0-300 mM NaCl 溶于 20 mM 的 PB (ρΗ7.4)各 250 ml 用于梯度洗脫，洗脫液流速為I ml/min，收集各洗脫峰，將各峰對應(yīng)的收集管中液體合并，并進(jìn)行酶活檢測，棄去無酶活的洗脫峰。
[0038]分子篩層析
G-100柱(2.6X 100 cm)用5 mM，PH=8.0的Tris-Cl緩沖液(即上樣緩沖液)平衡。
[0039]上步得到的含酶活洗脫峰經(jīng)冷凍干燥濃縮后上柱，繼而以5 mM, PH=8.0的Tris-Cl緩沖液洗脫，洗脫液流速lml/min，用自動(dòng)收集儀收集各洗脫峰，將各峰對應(yīng)的收集管中液體合并，并進(jìn)行酶活檢測，棄去無酶活的洗脫峰。
[0040]酶活洗脫峰經(jīng)冷凍干燥濃縮后，即得到純化的嵌合酶。洗脫峰見附圖3所示。將不同洗脫成分分別收集鑒定，確定目標(biāo)蛋白AnsB-TTP-TF。本試驗(yàn)中選用了 Sephadex-G-1OO進(jìn)行分子篩層析，其分離范圍是4000-150000。洗脫液中有酶活的峰有兩個(gè)，推測先出的酶活峰是四聚體(分子量約160000)或多聚體(>160000),后出的酶活峰是單體(分子量約40000)，證明溶液中存在多種聚集狀態(tài)的酶分子。至此，嵌合酶得到了有效的分離純化。
[0041]純化后的重組門冬酰胺酶AnsB-TTP-TF酶活力的定量測定
采用萘氏法測定酶活力，具體操作如下:在96孔酶標(biāo)板中，每孔加入50 μ I硼酸緩沖液，25 μ I AnsB-TTP-TF 溶液(4 Mg/μΙ)或 AnsB 溶液(4 μ g/M-1), 25 μ I L-Asn 溶液(0.4M)，37°C反應(yīng)15 min，加入50 μ I 15%三氯乙酸終止反應(yīng)。吸取上述反應(yīng)液12.5 μ?，加Λ 87.5 μ I雙蒸水和25 μ I萘氏試劑，于OD5tltl測各孔光密度值。[0042]酶活=(OD5tltlX952.4/Χ) X (3+Χ/1000)X在酶活較低時(shí)建議取20以上，酶活高時(shí)建議取5-10。純化后的AnsB-TTP-TF嵌合酶的活力經(jīng)萘氏法檢測可以保持天然酶AnsB 70%以上活力。
[0043]實(shí)施例四:ELISA測定多肽疫苗AnsB-TTP-TF能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗TF抗體
4.1材料
動(dòng)物:C57/BL6純系小鼠，雌性，6 - 8周齡，免疫前平均體重為16.8g，購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0044]實(shí)驗(yàn)藥物:重組蛋白疫苗AnsB-TTP-TF。
[0045]材料及試劑:純化的重組蛋白VEGF-TF。
[0046]方法
4.2.1免疫方案
選用C57BL/6J雌性小鼠，隨機(jī)分組，每組10只，分別為生理鹽水對照組，AnsB載體對照組，AnsB-TTP-TF組。生理鹽水對照組在每只小鼠兩后肢股四頭肌處分多點(diǎn)各注射100μι生理鹽水；多肽疫苗溶與滅菌生理鹽水配成?μ8/μ?，與等體積弗氏佐劑混勻后，每只小鼠腹股溝皮下注射100 μι，即每只動(dòng)物50 Pg。初次給藥選取弗氏完全佐劑，后續(xù)免疫選取弗氏不完全佐劑。
[0047]免疫程序?yàn)镺周、2周和4周各免疫一次，每次免疫時(shí)接種方法及劑量相同。自第2周至第8周的10周內(nèi)每隔2周取血一次，共取血4次，采用眼眶內(nèi)眥取血，每次血量為0.5-0.8 ml，離心取血清，_20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0048]抗體的ELISA檢測
96孔酶標(biāo)板，每孔中加入100 μ? VEGF-TF溶液(溶于包被稀釋液，I Pg/^1)，4°C包被過夜。棄去包被液，加入5% BSA(pH 7.4 PBS配制)封閉液，4°C滿孔封閉過夜。棄去封閉液，每孔加入5%BSA封閉液稀釋的、稀釋倍數(shù)為1:100的小鼠血清100 μ1，37?孵育I h。棄去血清，每孔用PBST滿孔洗滌，每次3 min,共洗滌6次。洗滌后，每孔加入用5% BSA封閉液稀釋、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 二抗(武漢博士德公司產(chǎn)品)100 μ?，稀釋倍數(shù)為1:20000，37°C孵育I h。棄去二抗液，每孔用PBST滿孔洗滌，每次3 min，共洗滌6次。洗滌后，每孔加入100 μ?底物液(由底物液A和B等體積配置)。37V反應(yīng)30 min,加入2 mo I/L H2SOj*止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定每孔的A45tol。
[0049]ELISA檢測結(jié)果判斷:標(biāo)本A45tlnm≥0.1，而且標(biāo)本A45tol至少為陰性對照A45tol兩倍數(shù)值的為陽性，否則為陰性。陰性對照A45tlnm低于0.05作0.05計(jì)算，高于0.05按實(shí)際A45tol計(jì)算。
[0050]檢測結(jié)果如圖4所示，小鼠給予AnsB-TTP-TF后，與生理鹽水組和AnsB對照組相t匕，從第二周就可以在血中檢測到抗體，且抗體水平較高。與此相比，對照組ELISA結(jié)果始終為陰性，沒有檢測到特異性的抗TF抗體。這說明TF多肽疫苗免疫后可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生常時(shí)間的高水平的抗體。
[0051]實(shí)施例五:重組TF亞單位抗原表位核酸疫苗抗腫瘤作用研究
5.1腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及移植性腫瘤模型制備
5.1.1材料
B16-F10購自中科院細(xì)胞所，RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基購自JIBCOL公司，C57/BL6小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。
[0052]細(xì)胞培養(yǎng)與移植
B16-F10是C57/BL6背景的高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤株，也是貼壁生長的細(xì)胞，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將其接種于培養(yǎng)瓶中。5%C02條件下培養(yǎng)，細(xì)胞長成連續(xù)單層時(shí)，小心傾去培養(yǎng)基，用D-HANKS溶液輕輕蕩洗后，傾去D-HANKS溶液，加入0.125%胰酶消化。傾去胰酶，立刻加入10%小牛血清的1640培養(yǎng)基終止消化，用生理鹽水輕輕洗凈殘存培養(yǎng)基，用吸管仔細(xì)吹打，完全分散細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按5 X IO7個(gè)/只接種于小鼠背部皮下。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程從開始消化到接種入C57/BL6小鼠體內(nèi)，得到荷瘤鼠。為保證細(xì)胞活力，從消化細(xì)胞到接種入體內(nèi)，不要超過15 min。10天后，荷瘤鼠的瘤重達(dá)到I g左右，處死動(dòng)物，無菌條件下取瘤塊，除去壞死組織，將數(shù)個(gè)瘤塊混合，剪成小塊，用玻璃組織勻漿器研磨，磨勻后放入無菌容器內(nèi)，加生理鹽水調(diào)整成1:3-1:4的瘤細(xì)胞懸液。容器置冰塊上，用空針筒抽吸，混勻后，接種于C57/BL6小鼠右側(cè)腋下，每只動(dòng)物接種0.2 ml整個(gè)試驗(yàn)在20min內(nèi)完成。
[0053]腫瘤接種后10天后處死動(dòng)物，分離腫瘤組織塊稱重，統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。
[0054]重組TF疫苗抗B16-F10黑色素瘤作用研究
雄性 C57/BL6 小鼠 70 只，體重 14-16 g，隨機(jī)分為 3 組:1.NS( im，100 “1/只)，2.AnsB(sc，50 yg/R)，3.AnsB-TTP-TF 組(sc，50 yg/只)。
[0055]各組動(dòng)物按預(yù)定免疫方案免疫八周，接種B16-F10腫瘤，14天后處死，稱取瘤重，放入10%甲醛固定7天后，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察腫瘤浸潤侵襲以及血管生成等情況。
[0056]處死動(dòng)物，分離腫瘤時(shí)同樣發(fā)現(xiàn):與對照組相比，AnsB-TTP-TF組的腫瘤邊緣清楚，包膜完整，而對照組未見到完整包膜。腫瘤重量統(tǒng)計(jì)表明，AnsB-TTP-TF免疫后，可以降低B16F10腫瘤的瘤重，抑瘤率為42.5%。如圖5所示。
[0057]B16-F10病理切片結(jié)果:在黑色素B16F10細(xì)胞移植瘤模型中，NS和AnsB-TTP-TF組:皮下組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞呈巢團(tuán)狀，瘤體內(nèi)有少許出血壞死,瘤體內(nèi)血管生長旺盛，腫瘤細(xì)胞生長活躍，并明顯向 肌肉內(nèi)及周邊脂肪組織內(nèi)浸潤，腫瘤與肌肉分界不清。AnsB-TTP-TF組:皮下組織內(nèi)瘤體中央及周邊腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯出血壞死,個(gè)別瘤體內(nèi)腫瘤細(xì)胞大量壞死，僅殘留血管。腫瘤與肌肉分界清楚，未見腫瘤細(xì)胞明顯浸潤肌肉組織。如圖6所示。
【權(quán)利要求】
1.一種基于組織因子的腫瘤多肽疫苗，其活性成分為將人源TF基因中的包含表位靶點(diǎn)的DNA序列片段表達(dá)后形成的AnsB-TF表位靶點(diǎn)融合蛋白，其中包含的TF表位靶點(diǎn)多肽片段為位于TF蛋白表面的易引起免疫反應(yīng)的多肽片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤多肽疫苗，其特征在于:所述TF表位靶點(diǎn)多肽片段的序列為:GDWKSKCFYTTDTECDLTDE (SEQ ID NO:1)0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫瘤多肽疫苗，其特征在于:所述疫苗在AnsB的C端加入一個(gè)25肽的破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞輔助表位TTP作為支臂，在TTP之后又加了一個(gè)3肽的柔性接頭Ser-Gly-Thr，TF表位靶點(diǎn)多肽片段接于柔性接頭后，形成AnsB-TTP -TF的結(jié)構(gòu)，其序列見 SEQ ID NO:2o
4.權(quán)利要求1、2或3所述的基于組織因子的腫瘤多肽疫苗的制備方法，其步驟包括:將人源包含TF表位靶點(diǎn)的DNA序列片段插入AnsB下游，獲得相應(yīng)的重組基因工程菌；重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后在大腸桿菌中表達(dá)出AnsB-TF表位靶點(diǎn)融合蛋白，經(jīng)純化后得到基于組織因子的腫瘤多肽疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腫瘤多肽疫苗的制備方法，其特征在于:其步驟包括: (1)用加端PCR的方法在AnsB-TTP序列后加入人源TF基因中的包含表位靶點(diǎn)的DNA序列，獲得AnsB-TTP-TF序列； (2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28-ansB-TTP-TF ； (3)將重組質(zhì)粒pET28-ansB-TTP-TF轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌中，經(jīng)篩選后的陽性菌活化培養(yǎng)；` (4)裂解菌體后分離提純，得到AnsB-TF表位靶點(diǎn)融合蛋白。
6.權(quán)利要求1、2或3所述的基于組織因子的腫瘤多肽疫苗在制備預(yù)防和治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1、2或3所述的基于組織因子的腫瘤多肽疫苗在制備預(yù)防和治療乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或肺癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK103520712SQ201310406005
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】劉文濤, 吳雪豐, 徐禮友, 楊政 申請人:南京海智生物工程有限公司