專利名稱：一種草地早熟禾的srap分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說，涉及一種草地早熟禾的SRAP分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
草地早熟禾(Poa pretensis)屬于禾本科(Poaceae)早熟禾屬(Poa sp.),是在溫帶地區(qū)應(yīng)用廣泛的冷季型草坪草，具有綠色期長(zhǎng)、坪觀質(zhì)量好的優(yōu)點(diǎn)。但其抗逆性稍弱、生長(zhǎng)速度較快，因此選育優(yōu)良的草地早熟禾品種，可以減少草坪管理中的投入。草坪草基因?qū)胝幵谄鸩诫A段，目前正在著手進(jìn)行實(shí)用基因的分離和單個(gè)基因性狀研究。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，迅速建立起我國(guó)草地早熟禾品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)于種質(zhì)資源的快速鑒別、種質(zhì)資源知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)、分子標(biāo)記育種和優(yōu)異種質(zhì)創(chuàng)新等方面將發(fā)揮重要作用。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequencerelated amplified polymorphism, SRAP)是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li與Quiros提出。SRAP的原理是通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的閱讀框區(qū)域(Open Reading Frames, ORFs)進(jìn)行擴(kuò)增。長(zhǎng)17bp的正向引物，對(duì)外顯子進(jìn)行特異擴(kuò)增，長(zhǎng)18bp的反向引物，則對(duì)內(nèi)含子及啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。由于種內(nèi)或種間的內(nèi)含子、啟動(dòng)子之間間隔長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好、中等產(chǎn)率、可產(chǎn)生共顯性標(biāo)記、便于克隆測(cè)序目標(biāo)片段的特點(diǎn)，目前已被應(yīng)用于品種指紋圖譜的繪制、遺傳連鎖圖的構(gòu)建、比較基因組學(xué)、遺傳多樣性分析和基因定位的研究。通過實(shí)驗(yàn)建立并優(yōu)化適合草地早熟禾的SRAP反應(yīng)體系，為進(jìn)一步建立草地早熟禾的遺傳圖譜、尋找與定位、克隆重要性狀的基因奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種草地早熟禾的SRAP分子標(biāo)記方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供一種草地早熟禾SRAP分子標(biāo)記引物，其為:me6:5/ -TGAGTCCAAACCGGTAA-3'；em5:5/ GACTGCGTACGAATTAAC-3'。本發(fā)明還提供一種草地早熟禾的SRAP分子標(biāo)記方法，其為用前述的引物PCR擴(kuò)增基因組DNA，其中，PCR反應(yīng)體系中，引物濃度為0.1 0.2 μ M，Taq酶濃度為0.02 0.04U/μ L, dNTP濃度為0.2 0.4mM, Mg2+的濃度為L(zhǎng) 5 2.5mM, DNA的濃度為2 4ng/ μ L,優(yōu)選的PCR反應(yīng)體系中，引物濃度為0.ΙμΜ，Taq酶濃度為0.04U/ μ L, dNTP濃度為0.4mM,Mg2+的濃度為2.0mM, DNA的濃度為3ng/ μ L。其中，優(yōu)選PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，35°C復(fù)性lmin，72°C延伸 10min，5 個(gè)循環(huán);94°C變性 lmin，50°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。本發(fā)明還提供含有所述引物的草地早熟禾SRAP分子標(biāo)記試劑盒。
本發(fā)明還提供所述的引物或所述的方法在草地早熟禾的品種鑒定和/或分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明所用的體系進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，所得到的條帶清晰、多態(tài)性好、重復(fù)性高，可以明顯看出不同植株間基因水平的差異，為草地早熟禾的基因水平研究奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明采用的SRAP分子標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單，SRAP標(biāo)記是對(duì)基因的重要組成部分ORFs進(jìn)行擴(kuò)增，基因的多樣性更能反映遺傳資源的多樣性。SRAP的引物序列比較長(zhǎng)，所以易于測(cè)序。SRAP在基因組中分布均勻，它提供的信息比其他分子標(biāo)記更為優(yōu)良，用于草本植物中的圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性評(píng)價(jià)、品種鑒定等可信度高。此外，SRAP正、反向引物可以自由組合，不僅可以節(jié)約成本，同時(shí)也大大提高了引物的使用率，且對(duì)儀器設(shè)備要求不高，在一般的基層科研單位均可開展這方面的工作，其應(yīng)用前景十分廣闊。


圖1為18對(duì)不同引物的擴(kuò)增結(jié)果。I 18分別為ml_e4、ml_e6、ml_e7、ml_e8、m2-e8、m3-e7、m3-e8、m4-el、m4-e6、m6-e5、m6-e7、m6-e4、m5-e6、m5-e7、m5-e3、m7-e5、m7-e7和 m8_e7。圖2為PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中M為D2000Marker，l 16為16個(gè)處理的編號(hào)。圖3所示為引物濃度與結(jié)果均值關(guān)系圖。圖4所示為Taq酶與結(jié)果均值關(guān)系圖。圖5所示為dNTPs濃度與結(jié)果均值關(guān)系圖。圖6所示為Mg2+濃度與結(jié)果均值關(guān)系圖 。圖7所示為模板DNA與結(jié)果均值關(guān)系圖。圖8所示為草地早熟禾品種巴潤(rùn)(Baron)和男爵(Baronie)的SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，1、2、3、10是草地早熟禾品種巴潤(rùn)，4 9是草地早熟禾品種男爵。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1草地早熟禾SRAP分子標(biāo)記引物篩選本實(shí)施例所用的材料為草地早熟禾常用品種巴潤(rùn)，可市售獲得。用天根試劑盒(CTAB法)提取新鮮幼嫩葉片的DNA，紫外分光光度計(jì)及1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)其純度和濃度，并稀釋到50ng/ μ L備用。從表I中的64對(duì)SRAP引物中篩選出最適合草地早熟禾的引物對(duì)。PCR反應(yīng)的條件為:引物濃度為0.2 μ M，Taq酶濃度為0.04U/ μ L，dNTP濃度為0.2mM，Mg2+的濃度為2.0mM,DNA的濃度為2ng/ μ L。反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，35°C復(fù)性lmin，72°C延伸10min，5個(gè)循環(huán);94°C變性lmin，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin,于 4°C保存。表I選用的SRAP標(biāo)記正、反向引物序列
權(quán)利要求
1.草地早熟禾SRAP分子標(biāo)記引物，其為: me6:5; -TGAGTCCAAACCGGTAA-3'； em5:5; GACTGCGTACGAATTAAC-3'。
2.草地早熟禾的SRAP分子標(biāo)記方法，其特征在于，用權(quán)利要求1所述的引物PCR擴(kuò)增基因組DNA，PCR反應(yīng)體系中，引物濃度為0.1 0.2 μ Μ, Taq酶濃度為0.02 0.04U/ μ L，dNTP濃度為0.2 0.4mM, Mg2+的濃度為L(zhǎng) 5 2.5mM, DNA的濃度為2 4ng/ μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min；94°C變性 lmin，35°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 10min，5 個(gè)循環(huán);94°C變性 lmin，50°C復(fù)性 lmin,72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系中，引物濃度為0.1 μ M，Taq酶濃度為0.04U/ μ L, dNTP濃度為0.4mM, Mg2+的濃度為2.0mM, DNA的濃度為3ng/ μ L。
5.含有權(quán)利要求1所述引物的草地早熟禾SRAP分子標(biāo)記試劑盒。
6.權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2 4任一項(xiàng)所述的方法在草地早熟禾的品種鑒定和/或分子標(biāo)記輔助育 種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種草地早熟禾的SRAP分子標(biāo)記引物，其為me65′-TGAGTCCAAACCGGTAA-3′；em55′-GACTGCGTACGAATTAAC-3′。本發(fā)明還公開了一種草地早熟禾的SRAP分子標(biāo)記方法，其為用前述的引物PCR擴(kuò)增基因組DNA，PCR反應(yīng)體系中，引物濃度為0.1～0.2μM，Taq酶濃度為0.02～0.04U/μL，dNTP濃度為0.2～0.4mM，Mg2+的濃度為1.5～2.5mM，DNA的濃度為2～4ng/μL。應(yīng)用本發(fā)明所用的體系進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記，所得到的條帶清晰、多態(tài)性好、重復(fù)性高，而且操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用前景十分廣闊。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103184217SQ20111045439
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者尹淑霞, 韓烈保, 花欣 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)