專利名稱：一種可同時(shí)沉默nkg2d的多種配體的rna干擾載體，及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種構(gòu)建可同時(shí)沉默NKG2D的多種配體的RNA 干擾載體的方法，并將該載體用于治療polyl C聯(lián)合D-GalN誘導(dǎo)的小鼠爆發(fā)性肝炎，可取得明顯療效。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNAi)，是指與靶基因同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，這是生物體在長期進(jìn)化過程中用于控制細(xì)胞內(nèi)特定基因活化以及調(diào)節(jié)基因活化程度的一種機(jī)制。自1998年被發(fā)現(xiàn)以來，RNA干擾技術(shù)被研究人員用來特異性地剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，得到了廣泛的應(yīng)用并取得了迅速的發(fā)展，被《Science》雜志評(píng)為2001年的十大科學(xué)進(jìn)展之一，并名列2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首。小RNA的制備方法主要有5種化學(xué)合成siRNA，體外轉(zhuǎn)錄，RNaseIII消化長片段dsRNA，siRNA表達(dá)載體和siRNA表達(dá)框架。其中，前三種主要都是體外制備siRNAs，而后兩種是從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模板在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs，后者由于不需要直接操作RNA，具有更高的轉(zhuǎn)染效率和高穩(wěn)定性。而這些，都主要集中在編碼一個(gè)短小干擾RNA的技術(shù)層面上。然而，自然情況下，一個(gè)分子通?？梢耘c多個(gè)不同配體分子相互作用。比如，表達(dá)于天然免疫細(xì)胞表面的天然免疫活化受體NKG2D有多種不同的配體分子，在機(jī)體受到壓力誘導(dǎo)，包括病毒感染，DNA損傷等情況下，這些不同的配體分子在其相應(yīng)細(xì)胞上都會(huì)有不同程度地上調(diào)表達(dá)，通過與NKG2D受體相互作用，引起天然免疫細(xì)胞(NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞)的活化，介導(dǎo)早期免疫應(yīng)答。HBV S抗原轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)ConA誘導(dǎo)的急性損傷過度敏感，是由于HBV S抗原轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞上NKG2D的配體Rael和Multl顯著升高，通過與NKG2D相互作用，引起肝臟NK細(xì)胞過度活化所造成的(Yongyan Chen, Zhigang Tian, et al. Increased susceptibility to liver injury in hepatitis B virus transgenic mice involves NKG2D_ligand interaction and natural killer cells. Hepatology, Vol.46, No. 3，2007)。在polyl: C聯(lián)合D-GalN誘導(dǎo)的肝臟爆發(fā)性損傷中，polyl: C模擬雙鏈RNA病毒感染，引起KupfTer細(xì)胞表面Rael分子表達(dá)上調(diào)，通過與NKG2D相互作用，促進(jìn)了 NK細(xì)胞活化，引起了爆發(fā)性的肝臟損傷(Xin Hou, Zhigang Tian, et al. NKG2D-Rael recognition between natural killer cells and Kupffer cells in a novel murine natural killer cell-dependent fulminant hepatitis. Hepatology, Vol.49, No. 3, 2009)。在這些模型中，由于NKG2D配體分子的上調(diào)，促進(jìn)NKG2D依賴的NK細(xì)胞活化，從而介導(dǎo)免疫應(yīng)答和免疫損傷。目前，實(shí)驗(yàn)過程降低這種依賴于NKG2D的免疫損傷，主要是通過抗體阻斷和RNA干擾這兩種手段。然而，抗體阻斷受限于抗體的蛋白質(zhì)本質(zhì)，作用時(shí)間短，因此需要多次給予， 并且代價(jià)昂貴。對(duì)于RNA干擾手段，由于NKG2D表達(dá)于游走性的淋巴細(xì)胞上，因此靶向NKG2D 分子的RNA干擾，隨著淋巴細(xì)胞的遷移而失去作用，效果難以穩(wěn)定。相比較下，RNAi抑制固有細(xì)胞上NKG2D的配體分子則更具可操作性。然而，NKG2D受體的配體分子是多樣的，包括 Rael，Multl和H60，這些不同的配體分子都能夠和NKG2D高親和力結(jié)合，介導(dǎo)免疫應(yīng)答。因此，多靶點(diǎn)RNA干擾技術(shù)亟待發(fā)展。我們構(gòu)建一個(gè)單一載體，能夠針對(duì)NKG2D不同配體分子同時(shí)編碼多個(gè)小干擾RNA，通過對(duì)滯留性肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞上這些配體分子的基因沉默，來封閉 NKG2D與它們的相互作用，與抗體阻斷相比起來，這種方法不僅封閉效果明顯，而且大大延長了干擾時(shí)相，降低了抗體的昂貴費(fèi)用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種可同時(shí)沉默NKG2D的多種配體的RNA干擾載體及其構(gòu)建方法及應(yīng)用，該方法構(gòu)建了一種可編碼NKG2D的多個(gè)配體分子(Rael，Multl和H60) shRNA的單一載體，該載體可以進(jìn)一步構(gòu)建成具有感染能力的編碼NKG2D多配體shRNA的腺病毒或腺病毒穿梭質(zhì)粒。該載體可同時(shí)沉默不同的靶基因，對(duì)PolyI:C/D-GalN聯(lián)合注射引起的依賴于 NKG2D的爆發(fā)性肝炎有著明顯的治療作用。
本發(fā)明的技術(shù)方案
在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)，其中在載體中含有至少一種配體分子的小干擾RNA結(jié)構(gòu)單元以及任選地性對(duì)照shRNA寡核苷酸編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在載體中包含二種配體分子的小干擾RNA結(jié)構(gòu)單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，在載體中包含三種配體分子的小干擾RNA結(jié)構(gòu)單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述配體為Rael，Multl或H60。在一個(gè)實(shí)施方案中，針對(duì)Rael的小干擾RNA序列為SEQ ID NO 1-3的序列；針對(duì)Multl的小干擾RNA序列為SEQ ID NO :4_6的序列；針對(duì)H60的小干擾 RNA序列為SEQ ID NO :7_9的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，無義干擾RNA序列為SEQ ID NO: 10的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的載體是腺病毒穿梭載體或者腺病毒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腺病毒穿梭載體是pRNAT-Hl. 1/shuttle質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腺病毒載體是pAdeno-X質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小干擾RNA結(jié)構(gòu)單元含有相應(yīng)分子的發(fā)夾結(jié)構(gòu)小干擾RNA的DNA序列、位于該DNA序列上游的HI. 1啟動(dòng)子和位于該DNA序列下游的TTTTTT終止子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的載體所含的發(fā)夾結(jié)構(gòu)小干擾RNA的DNA序列由位于中間的莖環(huán)序列和分別位于該莖環(huán)序列兩側(cè)的有義鏈和與該有義鏈互補(bǔ)的反義鏈構(gòu)成。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供第一方面所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體用于制備預(yù)防和/或治療肝炎的藥物的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肝炎為PolyI :C/D-GalN 聯(lián)合注射引起的依賴于NKG2D的爆發(fā)性肝炎。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體的施用方式為靜脈注射。
在第三方面中，本發(fā)明提供前述NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟
A.在腺病毒穿梭質(zhì)粒中，分別插入Rael，Multl，H60的小干擾RNA結(jié)構(gòu)單元以及陰性對(duì)照shRNA寡核苷酸編碼序列，構(gòu)建NKG2D單配體RNA干擾載體；
B.設(shè)計(jì)帶酶切粘端的引物，從上述A步驟所構(gòu)建的單配體RNA干擾載體上分別擴(kuò)增其shRNA轉(zhuǎn)錄單位，包括上游啟動(dòng)子，編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)小干擾RNA的DNA序列、下游終止子； 其中shRNAl的下游引物所引入的酶切位點(diǎn)與shRNA2的上游引物所引入的酶切位點(diǎn)為同一種限制性內(nèi)切酶，而shRNA2的下游引物所引入的酶切位點(diǎn)與shRNA3的上游引物所引入的酶切位點(diǎn)為同一種限制性內(nèi)切酶，如此順序下去；C.通過PCR的方法，用以上引物分別擴(kuò)增得到大量的各配體分子的shRNA轉(zhuǎn)錄單位，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切割并回收，進(jìn)一步用DNA連接酶將酶切后的 shRNA轉(zhuǎn)錄單位的PCR產(chǎn)物首尾相連，得到NKG2D多配體shRNA轉(zhuǎn)錄單位大片段；D.用限制性內(nèi)切酶雙酶切消化C步驟所得到的NKG2D多配體shRNA轉(zhuǎn)錄單位大片段，與同樣酶切線性化的腺病毒穿梭質(zhì)粒連接，構(gòu)建NKG2D多配體RNA干擾腺病毒穿梭載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述方法進(jìn)一步包括下述步驟E.用歸巢核酸內(nèi)切酶雙酶切D步驟所得到的NKG2D多配體RNA干擾腺病毒穿梭載體，回收包括NKG2D多配體shRNA轉(zhuǎn)錄單位大片段在內(nèi)的片段；F.用相同的歸巢核酸內(nèi)切酶雙酶切復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體，回收腺病毒骨架片段；G.進(jìn)一步用DNA連接酶將A步驟和B步驟所得到的回收片段連接起來，得到NKG2D 多配體RNA干擾重組腺病毒載體；H.線性化NKG2D多配體RNA干擾重組腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染進(jìn)適合的宿主細(xì)胞，在其中包裝成具有復(fù)制能力的完整腺病毒顆粒。具體地，本發(fā)明構(gòu)建方法的優(yōu)選實(shí)施方案為1、以siRNA表達(dá)載體如pRNAT-Hl. 1/shuttle為骨架，構(gòu)建常見的單個(gè)shRNA表達(dá)載體，包括 pRNAT-shRael，pRNAT-shMultl，pRNAT-shH60，pRNAT-shNeg。所涉及的 RNA 干擾序列分別是Rael 1 :GACCAAUG⑶UACCCACAU(SEQ ID NO 1)2 :AGCCAAGAUCAACCUCAAG(SEQ ID NO 2)3 :CAGCAAGUGCUCUUUGCUA(SEQ ID NO 3)Multl-1 G⑶UAACAG⑶CAGA⑶CU (SEQ ID NO 4)2 :GACUAACACAACCGGAAAG(SEQ ID NO 5)3 :AGCUGACUGCCAGUAACAA(SEQ ID NO 6)H60-1 :CUGAUAACAGCA(iUGCCAU(SEQ ID NO 7)2 :UGCUCA⑶GAAUGGAAAGA(SEQ ID NO 8)3:CCUGGAGAGAAA(iUCAUUC(SEQ ID NO 9)無義RNA干擾序列GAGACCCUAUCC⑶GAUUA(SEQID NO 10)2、設(shè)計(jì)不同引物通過PCR的方法從單個(gè)shRNA表達(dá)載體上擴(kuò)增得到相應(yīng)的 shRNA 轉(zhuǎn)錄單位，包括 HL 1 promoter+Rael shRNA, HI. 1 promoter+Multl shRNA, HI. 1 promoter+H60 shRNA,HI. 1 promoter+Neg shRNA。其中，shRNAl 的下游引物所引入的酶切位點(diǎn)與shRNA2的上游引物所引入的酶切位點(diǎn)為同一種限制性內(nèi)切酶，而shRNA2的下游引物所引入的酶切位點(diǎn)于shRNA3的上游引物所引入的酶切位點(diǎn)為同一種限制性內(nèi)切酶，如此順序下去。其中shRNAl的上游引物與最后一個(gè)小干擾RNA轉(zhuǎn)錄單位shRNAx的下游引物所引入的酶切位點(diǎn)為pRNAT-Hl. 1/shuttle質(zhì)粒自有酶切位點(diǎn)，分別為Bgl II和Nde I，引物序列見表2。
3、通過DNA連接酶將具有相同粘性末端的shRNA轉(zhuǎn)錄單位進(jìn)行連接，得到NKG2D 多配體shRNA轉(zhuǎn)錄單位大片段，并通過Bgl II和Nde I雙酶切后進(jìn)一步連接到同樣酶切線性化的pRNAT-Hl. 1/shuttle質(zhì)粒上，構(gòu)建成NKG2D多配體RNA干擾單一載體pRNAT-shRae l-shMultl-shH60-shNeg。
4、通過PI-Sce I、I_ceu I雙酶切上述步驟獲得的NKG2D多配體RNA干擾腺病毒穿梭載體 pRNAT-shRael-shMultl-shH60-shNeg，將切下的 shRael-shMultl-shH60_shNeg 片段整合到復(fù)制缺陷型腺病毒載體pAdeno-X上，構(gòu)建成NKG2D多配體RNA干擾腺病毒載體 pAdeno-shRael-shMultl-shH60-shNeg。具體地，用 PHce I 和 I-Ceu I 雙酶切 D 步驟所得到的NKG2D多配體RNA干擾腺病毒穿梭載體，回收包括NKG2D多配體shRNA轉(zhuǎn)錄單位大片段在內(nèi)的片段，與同樣酶切線性化的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體(pAdeno-X)連接，得到 NKG2D多配體RNA干擾重組腺病毒載體pAdeno-shRael-shMultl-shH60-shNeg，并進(jìn)一步通過脂質(zhì)體lipofectamine 2000將I^ac I酶線性化的NKG2D多配體RNA干擾重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)猴胚腎細(xì)胞系293細(xì)胞，在其中包裝成具有復(fù)制能力的完整腺病毒顆粒。
本發(fā)明提供的NKG2D多配體RNA干擾單一載體的特點(diǎn)
1.同時(shí)表達(dá)NKG2D三個(gè)不同的配體分子的小干擾RNA，通過高壓注射的方式，能夠有效地下調(diào)肝臟局部環(huán)境，尤其是肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞上這三個(gè)配體分子的表達(dá)，從而對(duì)于NKG2D 分子與這三種配體分子的相互作用都有干預(yù)效果，大大地降低了 polyI:C聯(lián)合D-GalN注射引起的依賴于NKG2D分子的肝臟炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明，在polyl C聯(lián)合半乳糖胺D-GalN誘導(dǎo)小鼠爆發(fā)性肝炎模型中，用本發(fā)明所構(gòu)建的NKG2D多配體RNA干擾單一載體提前3天對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)處理，可以有效地抑制小鼠肝臟損傷。與NKG2D雙配體RNA干擾載體，以及NKG2D 單配體RNA干擾載體相比，多配體RNA干擾載體效果更為明顯。這表明NKG2D的多個(gè)不同的配體都不同程度地參與了該受體所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因此，該載體對(duì)于肝臟炎癥反應(yīng)的保護(hù)效果更為突出。
2.能夠以腺病毒成熟顆粒的方式，通過非高壓注射的普通靜脈注射方式，高效地感染肝細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，同時(shí)干擾小鼠NKG2D三種配體分子的重組腺病毒，在提前10天對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)處理后，仍然可以高效低抑制polyI:C聯(lián)合D-GalN注射引起的爆發(fā)性肝損傷。
本發(fā)明的目的
針對(duì)NK細(xì)胞活化性受體NKG2D有多個(gè)不同配體的情況，提供一種單一載體編碼多個(gè)shRNA表達(dá)的構(gòu)建方法，實(shí)現(xiàn)一個(gè)載體能夠同時(shí)編碼NKG2D多個(gè)配體的shRNA，以增強(qiáng) RNA干擾技術(shù)對(duì)NKG2D分子與其多個(gè)不同配體相互結(jié)合與作用的阻斷效果，并且能夠?qū)崿F(xiàn)將該載體進(jìn)一步重組到腺病毒載體上，優(yōu)化了 RNA干擾的應(yīng)用手段并擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍， 克服了抗體阻斷的時(shí)效短，代價(jià)昂貴的不足。
本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
1.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)一個(gè)單一載體對(duì)NKG2D多個(gè)不同配體分子同時(shí)進(jìn)行RNA干擾；
2.本發(fā)明通過單一載體實(shí)現(xiàn)對(duì)固有細(xì)胞表面分子的RNA干擾，而非淋巴細(xì)胞表面分子，延長干擾時(shí)相；
3.本發(fā)明通過對(duì)NKG2D多個(gè)不同配體分子的同時(shí)干擾，明顯降低polyI:C聯(lián)合半乳糖胺D-GalN誘導(dǎo)小鼠爆發(fā)性肝炎，對(duì)臨床基因治療的RNA干擾有著指導(dǎo)意義，發(fā)展了 RNA 干擾臨床治療的手段；4.本發(fā)明所構(gòu)建的NKG2D多配體分子RNA干擾重組腺病毒，與現(xiàn)有很多多靶點(diǎn) RNA干擾載體比起來，具有更高效的感染能力，并具有臨床應(yīng)用的潛力。


圖1至圖3為單配體RNA干擾載體，包括pRNAT_Hl. 1-shRael, pRNAT-Hl. 1-shMultl, pRNAT-Hl. l_shH60，pRNAT-shNeg 質(zhì)粒構(gòu)建過程，其中圖1表示Clontech在線siRNA設(shè)計(jì)工具所選擇的基因RNA干擾序列(Rael和H60 均根據(jù)其不同亞型的共同mRNA片段來選擇)；圖2表示體外合成并退火得到含有編碼BamH I和HindIII酶切位點(diǎn)的編碼shRNA 的 DNAs ；圖3表示pRNAT-Hl. I/Shuttle質(zhì)粒用BamH I、HindIII雙酶切消化，回收大片段， 并將圖2得到的退火寡核苷酸雙鏈插入pRNAT-Hl. 1/Shuttle質(zhì)粒；圖 4 至圖 5 為多配體 RNA 干擾載體 pRNAT-shRael-shMultl-shH60_shNeg 構(gòu)建過程，其中圖4表示pRNAT-Hl. 1/Shuttle質(zhì)粒用Bgl II、Nde I雙酶切消化，回收大片段；圖5表示通過不同上下游引物從單配體RNA干擾載體上擴(kuò)增shRNA轉(zhuǎn)錄單位，其中p3+p2擴(kuò)增第一個(gè)shRNA片段，pl+p2擴(kuò)增中間的shRNA片段，pl+p4擴(kuò)增最后一個(gè)shRNA 片段，通過相同酶切位點(diǎn)串聯(lián)各shRNA片段(PRNAT-shRael-shMultl-shH60-shNeg為例)；圖6用Bgl II、Nde I雙酶切消化圖5得到的長shRNA片段，形成粘性末端，插入圖4得到的大片段中，形成環(huán)型質(zhì)粒pRNAT-shI ael-shMultl-shH60-shNeg，即NKG2D多配體 RNA干擾載體；圖7用PI-Sce I、I-ceu I雙酶切消化圖6所得質(zhì)粒 pRNAT-shRael-shMultl-shH60-shNeg以及復(fù)制缺陷型腺病毒載體pAdeno-X，分別回收小片段和大片段，連接二者形成環(huán)型質(zhì)粒pAdeno-shRael-shMultl-shH60-shNeg，即NKG2D多配體RNA干擾重組腺病毒載體；圖8表示本發(fā)明所涉及的NKG2D多配體、雙配體、單配體RNA干擾載體以及無義干擾對(duì)照載體；圖9表示本發(fā)明所構(gòu)建的NKG2D多配體、雙配體、單配體RNA干擾載體對(duì)其涉及的靶分子的基因沉默作用；圖10表示NKG2D多配體RNA干擾腺病毒穿梭載體有效地抑制小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平；圖11表示NKG2D多配體RNA干擾腺病毒有效地抑制小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 構(gòu)建一種可同時(shí)沉默NKG2D的多種配體的RNA干擾載體結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明構(gòu)建NKG2D多配體RNA干擾單一載體的構(gòu)建方法作進(jìn)一步說明如下
實(shí)驗(yàn)材料
權(quán)利要求
1.NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)，其中在載體中含有至少一種配體分子的小干擾RNA結(jié)構(gòu)單元以及任選地陰性對(duì)照shRNA寡核苷酸編碼序列。
2.權(quán)利要求1所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)，其中所述在載體中包含二種配體分子或三種配體分子的小干擾RNA結(jié)構(gòu)單元。
3.權(quán)利要求1或2所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)，其中所述配體為 Rael, Multl 或腳。
4.權(quán)利要求3中所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)，其中針對(duì)Rael的小干擾RNA序列為SEQ ID NO :1_3的序列；針對(duì)Multl的小干擾RNA序列為SEQ ID NO :4_6 的序列；針對(duì)H60的小干擾RNA序列為SEQ ID NO :7_9的序列。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的載體是腺病毒穿梭載體或者腺病毒載體。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)，所述小干擾RNA結(jié)構(gòu)單元含有相應(yīng)分子的發(fā)夾結(jié)構(gòu)小干擾RNA的DNA序列、位于該DNA序列上游的HI. 1啟動(dòng)子和位于該DNA序列下游的TTTTTT終止子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于所述的載體所含的發(fā)夾結(jié)構(gòu)小干擾RNA的DNA序列由位于中間的莖環(huán)序列和分別位于該莖環(huán)序列兩側(cè)的有義鏈和與該有義鏈互補(bǔ)的反義鏈構(gòu)成。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體用于制備預(yù)防和/或治療肝炎的藥物的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，所述方法包括以下步驟A.在腺病毒穿梭質(zhì)粒中，分別插入Rael，Multl，H60的小干擾RNA結(jié)構(gòu)單元以及陰性對(duì)照shRNA寡核苷酸編碼序列，構(gòu)建NKG2D單配體RNA干擾載體；B.設(shè)計(jì)帶酶切粘端的引物，從上述A步驟所構(gòu)建的單配體RNA干擾載體上分別擴(kuò)增其 shRNA轉(zhuǎn)錄單位，包括上游啟動(dòng)子，編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)小干擾RNA的DNA序列、下游終止子；其中 shRNAl的下游引物所引入的酶切位點(diǎn)與shRNA2的上游引物所引入的酶切位點(diǎn)為同一種限制性內(nèi)切酶，而shRNA2的下游引物所引入的酶切位點(diǎn)與shRNA3的上游引物所引入的酶切位點(diǎn)為同一種限制性內(nèi)切酶，如此順序下去；C.通過PCR的方法，用以上引物分別擴(kuò)增得到大量的各配體分子的shRNA轉(zhuǎn)錄單位， 用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切割并回收，進(jìn)一步用DNA連接酶將酶切后的shRNA 轉(zhuǎn)錄單位的PCR產(chǎn)物首尾相連，得到NKG2D多配體shRNA轉(zhuǎn)錄單位大片段；D.用限制性酶切酶酶切消化C步驟所得到的NKG2D多配體shRNA轉(zhuǎn)錄單位大片段，與同樣酶切線性化的腺病毒穿梭質(zhì)粒連接，構(gòu)建NKG2D多配體RNA干擾腺病毒穿梭載體。
10.權(quán)利要求9所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中進(jìn)一步包括下述步驟；E.用歸巢核酸內(nèi)切酶雙酶切D步驟所得到的NKG2D多配體RNA干擾腺病毒穿梭載體， 回收包括NKG2D多配體shRNA轉(zhuǎn)錄單位大片段在內(nèi)的片段；F.用相同的歸巢核酸內(nèi)切酶雙酶切復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體，回收腺病毒骨架片段；G.進(jìn)一步用DNA連接酶將A步驟和B步驟所得到的回收片段連接起來，得到NKG2D多配體RNA干擾重組腺病毒載體；H.線性化NKG2D多配體RNA干擾重組腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染進(jìn)適合的宿主細(xì)胞，在其中包裝成具有復(fù)制能力的完整腺病毒顆粒。
全文摘要
本發(fā)明公開一種構(gòu)建可同時(shí)沉默NKG2D的多種配體的RNA干擾載體的方法及其應(yīng)用，該方法構(gòu)建了一種可編碼NKG2D的多個(gè)配體分子(Rae1，Mult1和H60)shRNA的單一載體，該載體可以進(jìn)一步構(gòu)建成具有感染能力的編碼NKG2D多配體shRNA的腺病毒載體。該載體可同時(shí)沉默不同的靶基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。作為該載體的應(yīng)用，該載體能夠下調(diào)肝臟局部微環(huán)境，包括肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面Rae1，Mult1和H60的表達(dá)水平，并且對(duì)于NKG2D依賴的爆發(fā)性肝炎有明顯的預(yù)防治療作用。本發(fā)明發(fā)展了多靶點(diǎn)RNA干擾技術(shù)，對(duì)多靶點(diǎn)的基因治療具有重要的實(shí)際意義。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102505022SQ201110454080
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者孫汭, 田志剛, 魏海明, 黃玫 申請(qǐng)人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)