專(zhuān)利名稱(chēng)：梅花遺傳圖譜構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種梅花遺傳圖譜構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)是中國(guó)目前唯一獲得國(guó)際品種登錄權(quán)的植物，雖然近幾十年對(duì)梅花的研究成績(jī)斐然，在種質(zhì)資源(包滿(mǎn)珠，1993 ;劉青林，1996 ;康素紅和劉曉祥，1997 ;張永春 和劉小祥，1999)、繁殖生理(胡金良和徐漢卿，1994 ;徐漢卿和王慶亞，1995 ;趙守邊和劉小祥，1999)等研究領(lǐng)域取得相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展，但是在分子育種方面比
較滯后。遺傳圖譜的構(gòu)建具有重要的應(yīng)用價(jià)值。分離群體是構(gòu)建遺傳圖譜使用的遺傳材料，群體親本的選擇直接影響到構(gòu)建遺傳圖譜的難易程度及圖譜的應(yīng)用范圍。由于農(nóng)作物育種歷史悠久，生長(zhǎng)周期短，構(gòu)建近交系、純系群體相當(dāng)容易，但是果樹(shù)類(lèi)、林木類(lèi)等多年生木本植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，高度雜合等特點(diǎn)，目前在樹(shù)木中多利用擬測(cè)交策略構(gòu)建遺傳圖譜(ffeeden et al.1994 ；Yamamoto et al.2002)。由于梅花分布廣、資源變異豐富，不同生態(tài)區(qū)域的梅花，其遺傳基礎(chǔ)相差較大，加上梅花起源復(fù)雜、有性生殖困難等特性，目前還沒(méi)有獲得一張梅花的遺傳圖譜，嚴(yán)重限制了梅花的分子育種工作的開(kāi)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種梅花遺傳圖譜構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的梅花遺傳圖譜構(gòu)建方法，其包括如下步驟:I)構(gòu)建梅花F1代擬測(cè)交群體；2)提取父母本及其子代基因組DNA ；3)利用限制性?xún)?nèi)切位點(diǎn)相關(guān)的DNA測(cè)序方法對(duì)父母本及其子代基因組進(jìn)行重測(cè)序，獲得符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記；4)根據(jù)所獲得的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，應(yīng)用擬測(cè)交策略構(gòu)建梅花遺傳圖譜。本發(fā)明中，根據(jù)作圖親本選配原則，選擇結(jié)實(shí)率高，子房飽滿(mǎn)的梅花品種為母本，選擇花藥飽滿(mǎn)，散粉量大，花粉生活力高的梅花品種為父本，在保留母本花萼的情況下，用鑷子去雄，采取一次授粉的方法，進(jìn)行人工雜交選育，用收獲的子代構(gòu)建F1代擬測(cè)交群體。其中父本花藥在溫度20 25°C，濕度10 40%下，散粉15 20小時(shí)，收集花粉。收集的花粉可立即授粉，也可以在干燥條件下4°C冷藏備用。優(yōu)選的，以‘粉瓣’為母本，以‘扣子玉蝶’為父本進(jìn)行雜交，構(gòu)建F1代擬測(cè)交群體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)父母本及其子代基因組DNA進(jìn)行酶切，利用Solexa方法對(duì)純化的父母本及其子代的酶切片段進(jìn)行單末端測(cè)序，使用SOAPsnp軟件獲得符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記。在獲得符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的單核苷酸標(biāo)記后，根據(jù)卡平方檢驗(yàn)作圖群體中符合孟德?tīng)柶谕蛛x比為1: 2:1或1:1的標(biāo)記，P <0.01，過(guò)濾掉SNP分子標(biāo)記中偏分離的標(biāo)記，利用JoinMap3.0的軟件，設(shè)置LOD彡3，構(gòu)建梅花高密度遺傳圖譜。本發(fā)明在克服梅花品種結(jié)實(shí)率低、育種周期長(zhǎng)，構(gòu)建F1群體困難的基礎(chǔ)上，利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)父母本及其子代進(jìn)行重測(cè)序，通過(guò)RAD的方法和擬測(cè)交策略相結(jié)合快速構(gòu)建梅花的遺傳圖譜，該方法為快速構(gòu)建木本植物高密度圖譜提供新的思路和方法，促進(jìn)其遺傳圖譜構(gòu)建進(jìn)程。


圖1A為梅花遺傳圖譜I 4連鎖群。圖1B為梅花遺傳圖譜5 8連鎖群。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1構(gòu)建擬測(cè)交群體本實(shí)施例選擇梅花品種‘粉瓣’為母本，主要性狀為:花芽1-2朵著生，主要分布在短花枝和中花枝，花極繁密，花徑2.99cm(2.75-3.31cm)，花蕾粉色，頂端有復(fù)色，花瓣為5-8枚,單瓣淺碗型,粉色，有色暈，子房飽滿(mǎn)，柱頭發(fā)育良好，結(jié)實(shí)率聞；‘扣子玉蝶’為父本，主要性狀:花芽1-2朵著生，主要分布在短花枝和束花枝，花較繁密，花徑
2.32cm(1.6-2.68cm)，花蕾頂端有復(fù)色，花瓣為14-16枚，重瓣淺碗型，白色，花藥飽滿(mǎn)，散粉量大，花粉的生活力高。在父本初花期與盛花期時(shí)，選取中等長(zhǎng)勢(shì)的枝條上且無(wú)病蟲(chóng)害及生理缺陷的枝條上大蕾與中蕾期的花蕾， 用消毒后的醫(yī)用鑷子剝離花藥平鋪在硫酸紙上，室溫(20-25°C )濕度(40%以下)，自然散粉15-20小時(shí)，4°C保存?zhèn)溆?。在母本初花期，選擇生長(zhǎng)健壯的中短花枝，適當(dāng)修剪，先去除已開(kāi)的花朵和過(guò)小花蕾，在保留花萼的情況下，用醫(yī)用鑷子小心地將梅花的花瓣，雄蕊去除，去雄完成后，在10-16時(shí)，柱頭上具有發(fā)亮的粘液時(shí)，用毛筆蘸取花粉，輕輕的涂于柱頭，完成授粉，計(jì)數(shù)并掛牌，用硫酸紙做成紙袋，馬上套袋，僅進(jìn)行一次授粉，一次套袋，共雜交2120朵花。授粉完成后7天，待柱頭干燥變黑，子房膨大，去掉紙袋；在雜交果實(shí)發(fā)育85天時(shí)，為防止采前落果，進(jìn)行收前套網(wǎng)；果實(shí)發(fā)育115天時(shí)，人工采收，共采收561粒雜交種子，采收后通風(fēng)陰涼處，放置15-20天，讓雜交種子在果實(shí)中充分成熟。將收獲的果實(shí)去除果肉后，將種子取出，洗凈，晾干，置于4°C冷庫(kù)中砂藏催芽；待種子剛露白，可進(jìn)行播種。種子催芽后，在溫室中將露白的342粒種子，播種于直徑為12cmX12cm的花盆中，待其生長(zhǎng)到20-30cm時(shí)將310棵雜種苗移栽到大田中，每周灌水一次，注意期間的病蟲(chóng)害防護(hù)。根據(jù)作圖親本選配原則，選擇具有優(yōu)良性狀、生長(zhǎng)健壯的品種為雜交親本，選擇結(jié)實(shí)率高，子房飽滿(mǎn)，柱頭發(fā)育良好的梅花品種為母本，花藥飽滿(mǎn)，散粉量大，花粉的生活力高的梅花品種為父本，采用保留梅花花萼的情況下，用鑷子去雄，僅進(jìn)行一次授粉的方法，進(jìn)行人工雜交選育，與傳統(tǒng)方法相比，改進(jìn)之處見(jiàn)表I。表1:本發(fā)明與傳統(tǒng)雜交相比創(chuàng)新之處
權(quán)利要求
1.一種梅花遺傳圖譜構(gòu)建方法，其包括如下步驟: 1)構(gòu)建梅花F1代擬測(cè)交群體； 2)提取父母本及其子代基因組DNA； 3)利用限制性?xún)?nèi)切位點(diǎn)相關(guān)的DNA測(cè)序方法對(duì)父母本及其子代基因組進(jìn)行重測(cè)序，獲得符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記； 4)根據(jù)所獲得的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，應(yīng)用擬測(cè)交策略構(gòu)建梅花遺傳圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，根據(jù)作圖親本選配原則，選擇結(jié)實(shí)率高，子房飽滿(mǎn)的梅花品種為母本，選擇花藥飽滿(mǎn)，散粉量大，花粉生活力高的梅花品種為父本，在保留母本花萼的情況下，用鑷子去雄，采取一次授粉的方法，進(jìn)行人工雜交選育，用收獲的子代構(gòu)建F1代擬測(cè)交群體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，其中父本花藥在溫度20 25°C，濕度10 40%下，散粉15 20小時(shí)，收集花粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，以‘粉瓣’為母本，以‘扣子玉蝶’為父本進(jìn)行雜交，構(gòu)建F1代擬測(cè)交群體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，利用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)父母本及其子代基因組DNA進(jìn)行酶切，利用Solexa方法對(duì)純化的父母本及其子代的酶切片段進(jìn)行單末端測(cè)序，使用SOAPsnp軟件獲得符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，利用卡平方檢驗(yàn)作圖群體是否符合孟德?tīng)柶谕蛛x比為1: 2:1或1:1的標(biāo)記，P < 0.01，過(guò)濾掉SNP分子標(biāo)記中偏分離的標(biāo)記，利用JoinMap3.0的軟件，設(shè)置LOD值> 3，構(gòu)建梅花高密度遺傳圖譜。
全文摘要
本發(fā)明提供一種梅花遺傳圖譜構(gòu)建方法，其包括如下步驟1)構(gòu)建梅花F1代擬測(cè)交群體；2)提取父母本及其子代基因組DNA；3)利用限制性?xún)?nèi)切位點(diǎn)相關(guān)的DNA測(cè)序方法對(duì)父母本及其子代基因組進(jìn)行重測(cè)序，獲得符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記；4)根據(jù)所獲得的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，應(yīng)用擬測(cè)交策略構(gòu)建梅花遺傳圖譜。本發(fā)明在克服梅花品種雜交結(jié)實(shí)率低、育種周期長(zhǎng)，構(gòu)建F1群體困難的基礎(chǔ)上，利用RAD的方法和擬測(cè)交策略相結(jié)合的方法快速構(gòu)建梅花的遺傳圖譜程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103184277SQ201110454348
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者張啟翔, 孫麗丹, 徐宗大, 張 杰, 陳晶鑫 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)