專利名稱：一種刪除選擇標記基因的百合轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及百合的轉(zhuǎn)基因方法，特別涉及一種刪除選擇標記基因的百合轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
百合是世界著名切花之一，具有很高的觀賞價值，一直深受人們喜愛。雖然每年有大量的百合新品種推向市場，但長期以來其品質(zhì)的改良都是依賴于傳統(tǒng)的遺傳育種方法。 而傳統(tǒng)育種技術(shù)上的局限性，有時會制約品種性狀的改良以及新品種的選育，在一定程度上嚴重制約百合商品化生產(chǎn)，因此尋求新的育種途徑與之相結(jié)合才是解決問題的關(guān)鍵。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過建立可轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，導入外源基因來改良百合品質(zhì)無疑具有重要意義。目前，已報道的百合遺傳轉(zhuǎn)化的目的基因主要有四類報告基因、抗病基因、抗蟲基因、抗逆基因。其中關(guān)于抗逆基因的研究報道較少，目前僅見一篇國內(nèi)報道。陳莉O007) 將耐熱基因Mn-SOD導入麝香百合中，經(jīng)過高溫脅迫處理，得到耐熱性提高的轉(zhuǎn)基因百合， 關(guān)于百合抗旱、耐鹽基因工程的研究還未見成功報道。關(guān)于百合遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有三種農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。其中采用基因槍法進行百合遺傳轉(zhuǎn)化取得了一定的進展，但是關(guān)于基因槍法共轉(zhuǎn)化的研究在百合上還未見成功報道。Cre/loxp系統(tǒng)屬于位點特異性重組系統(tǒng)，目前已有很多研究利用此系統(tǒng)進行植物轉(zhuǎn)基因，并進一步將標記基因刪除。目前，在百合上尚未見應用此系統(tǒng)的研究報道。rd29A是誘導型啟動子中應用最廣泛的啟動子，已被許多學者克隆并應用于轉(zhuǎn)基因植物的研究，目前，還未見應用rd29A啟動子調(diào)控Cre/loxp系統(tǒng)進行標記基因刪除試驗的成功報道。馮彪Q008)認為愈傷誘導過程中會發(fā)生原有種性的改變，同時愈傷繼代2 3次后，很難長時間維持其原有的特性，玻璃化和變異現(xiàn)象非常嚴重。Watad等(1998)以愈傷為外植體進行基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化過程中獲得0. 17%的單基因的轉(zhuǎn)化效率。師守國等O010)在以鱗片為外植體進行百合基因槍轉(zhuǎn)化時，獲得了高達 1.5%的轉(zhuǎn)化效率。Watad等(1998)以愈傷為外植體進行基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化過程中，以瞬時表達率作為衡量轉(zhuǎn)化效率的標準，得出最佳轟擊距離為6em。師守國等Q010)以蘭州百合鱗片作為基因槍轟擊材料，以瞬時表達率作為衡量轉(zhuǎn)化效率的標準，得出最佳轟擊距離為6cm時，獲得最高的轉(zhuǎn)化效率。Arumugam等^)07)應用Cre/loxP系統(tǒng)在芥菜轉(zhuǎn)基因過程中，通過含有Cre和 loxP-npt II的植株雜交后產(chǎn)生F1代無選擇標記的植株。Kopertekh等(Kopertekh L， Schulze K, Frolov A, etal. Cre—mediated seed-specific transgene excision in tobacco [J], Plant Mol Biol, 2010, 72 :597-605.)運用種子特異性啟動子誘導Cre基因表達，Cre基因識別兩個Ioxp位點，從而刪除介于兩個Ioxp位點間的標記基因，獲得無選擇標記的轉(zhuǎn)基因煙草。Moravcikova等Q008)用擬南芥種子特異儲藏蛋白cruciferin C作為Cre/loxP系統(tǒng)自我切除的誘導啟動子，得到了安全轉(zhuǎn)基因煙草植株。他們在研究中還發(fā)現(xiàn)，在煙草Ttl和T1代植株中檢測Cre/loxP自我切除情況時刪除效率有所增加，Ttl代植株的刪除效率僅為10. 2%，經(jīng)過一年的培養(yǎng)后，T1代植株檢測后發(fā)現(xiàn)刪除效率竟然達到了 40%， 這種通過連續(xù)多代雜交或者自交可能實現(xiàn)高效率的刪除。白斌等Q004)的研究得出4°C和10°C低溫條件下均可誘導rd29A表達。石君 (2009)認為rd29A在4°C條件下經(jīng)過不同時間誘導，其表達效率不同，其中以誘導1 表達
效率最高。Wang等人Q005)認為利用誘導Cre/lLoxP系統(tǒng)刪除體系缺乏嚴格的控制，導致轉(zhuǎn)化效率降低。這可能是因為他們沒有找到誘導啟動子表達的最佳條件，進而導致刪除效率低下。^iang等Q009)應用CLV系統(tǒng)，采用β-雌二醇誘導，獲得了安全抗逆轉(zhuǎn)基因番茄， 但是沒有對刪除效率進行報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種刪除選擇標記基因的百合轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明提供的刪除選擇標記基因的百合轉(zhuǎn)基因方法，其為將分別攜帶目標基因和 Cre/loxP的植物表達載體，通過基因槍共轉(zhuǎn)化百合，誘導共轉(zhuǎn)化株系的Cre基因表達，刪除位于兩個同向IoxP位點間的選擇標記基因，分化出再生植物，獲得無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因株系。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的方法包括如下步驟1)將百合鱗片表面滅菌后接種到分化培養(yǎng)基中誘導百合鱗片直接分化出小鱗莖；2)將步驟1)分化的小鱗片基部接種至分化培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)，預培養(yǎng)后進行基因槍轟擊，轟擊后進行恢復培養(yǎng)；3)將恢復培養(yǎng)后的小鱗片基部接種至篩選培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)；4)將獲得的轉(zhuǎn)化苗的小鱗片基部在篩選培養(yǎng)基中進行低溫處理后轉(zhuǎn)入常溫培養(yǎng)， 分化出無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因再生株系。其中，步驟3)中所述的篩選培養(yǎng)基優(yōu)選為含有50 120mg · Γ1卡那霉素和5 IOmg · L—1草丁膦的分化培養(yǎng)基。其中，所述的分化培養(yǎng)基優(yōu)選為含有0. 1 0. 3mg化―1的ΝΑΑ，0. 005 0. Olmg化一1 的TDZ和3wt%的蔗糖的MS固體培養(yǎng)基，最優(yōu)選為為含有0. 2mg · L—1的NAA，0. 005mg · L—1 的TDZ和3wt%的蔗糖的MS固體培養(yǎng)基。其中，步驟2)所述的預培養(yǎng)為黑暗培養(yǎng)優(yōu)選為2 4d，最優(yōu)選為2d，所述的恢復培養(yǎng)優(yōu)選為黑暗培養(yǎng)3 5天，最優(yōu)選為3d，基因槍的轟擊距離優(yōu)選為6 9cm，最優(yōu)選為 9cm0在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的篩選培養(yǎng)為將轟擊后的小鱗片在篩選培養(yǎng)基上進行連續(xù)7次篩選，每隔15 20d更換一次培養(yǎng)基，前3次篩選培養(yǎng)基的卡那霉素濃度為80mg · L—1，后4次篩選培養(yǎng)基的卡那霉素濃度為120mg · L—1。
本發(fā)明中，Cre基因由誘導型啟動子啟動表達，優(yōu)選為rc^9A。本發(fā)明優(yōu)選通過4°C 低溫處理12小時，從而誘導Cre基因表達，達到刪除選擇標記基因的目的，可獲得無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因株系。本發(fā)明的有益效果1)本發(fā)明以百合鱗片作為基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，通過誘導，使鱗片直接誘導分化成苗，避免了愈傷誘導過程中發(fā)生原有種性的改變，同時也避免了多次繼代培養(yǎng)后， 玻璃化和變異非常嚴重的現(xiàn)象?；帽景l(fā)明獲得‘索邦’高效再生培養(yǎng)基配方，在MS基本培養(yǎng)基中添加NAA 0. 2mg-r1, TDZ 0.00511^*171，蔗糖3襯％，瓊脂0.6%，pH = 5. 8，使百合小鱗片基部具有高達97. 80士 1. 91%的分化率。3)本發(fā)明獲得百合小鱗片基部遺傳轉(zhuǎn)化的最適參數(shù)設(shè)置為預培養(yǎng)2d，轟擊距離 9cm，恢復培養(yǎng)3d，為百合基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化提供參考和依據(jù)。4)本發(fā)明獲得基因槍法共轉(zhuǎn)化百合植株，通過4°C低溫誘導1 將標記基因刪除， 最終獲得安全轉(zhuǎn)基因植株，消除人們對轉(zhuǎn)基因植物生物安全性問題的疑慮，這對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展具有重要的科學價值和現(xiàn)實意義。


圖1為本發(fā)明百合鱗片在培養(yǎng)基上直接再生小植株的情況。圖2為本發(fā)明百合小植株增重情況。圖3為本發(fā)明百合小鱗片基部預培養(yǎng)情況。圖4 為載體質(zhì)粒 Hisb-rc^gA-Cre/lox 圖譜。圖5為載體質(zhì)粒pBPC-P5CS-FU9A圖譜。圖6為本發(fā)明百合鱗片基因槍轟擊后在篩選培養(yǎng)基上篩選3次后的情況。圖7為本發(fā)明百合鱗片基因槍轟擊后在篩選培養(yǎng)基上篩選7次后的情況。圖8為本發(fā)明篩選的抗性植株擴繁情況。圖9所示為共轉(zhuǎn)化株系的PCR檢測。A :bar基因PCR檢測；B =Cre基因PCR檢測； M :DL2000 Marker ；1 陽性對照；2 陰性對照；3 :ddH20對照；4_5 抗性植株。圖10所示為共轉(zhuǎn)化植株的bar基因(A)和Cre基因(B)的Southern檢測。A :bar 基因檢測；B :Cre基因檢測；1 陽性對照；2 陰性對照；3 單拷貝轉(zhuǎn)基因植株；4 雙拷貝轉(zhuǎn)基因植株。圖IlA所示為4°C處理12h和24h后標記基因刪除情況PCR檢測。M :DL2000 ； 1 陽性對照；2 轉(zhuǎn)基因未處理對照；3 陰性對照；4 :ddH20對照；5-9 :4°C處理12h ；10-14 :4°C 處理24h。圖IlB所示為4°C處理36h和48h后標記基因刪除情況PCR檢測。M :DL2000 ； 1 陽性對照；2 轉(zhuǎn)基因未處理對照；3 陰性對照；4 :ddH20對照；5-9 :4°C處理36h ；10-14 :4°C 處理4 ι。圖IlC所示為4°C處理60h和72h后標記基因刪除情況PCR檢測。M :DL2000 ； 1 陽性對照；2 轉(zhuǎn)基因未處理對照；3 陰性對照；4 :ddH20對照；5-9 :4°C處理60h ；10-14 :4°C 處理7池。
圖IlD所示為不同處理時間的標記基因刪除效率。圖12所示為4°C處理12h后Cre基因Southern檢測。其中1、4和5泳道Cre基因已經(jīng)被刪除，2和3泳道Cre基因仍然存在，Cre基因刪除效率為60%。圖13所示為本發(fā)明安全轉(zhuǎn)基因植株在不含抗生素的培養(yǎng)基上生長情況。圖14所示為本發(fā)明安全轉(zhuǎn)基因植株在含有抗生素的培養(yǎng)基上生長情況。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1最適分化培養(yǎng)基的確定(1)配制培養(yǎng)基在MS基本培養(yǎng)基中+蔗糖3% +瓊脂0.6%，并添加NAA(0. 1、 0. 2 和 0. 3mg · L-1) +TDZ (0. 002,0. 005 和 0. Olmg · Γ1)不同組合共 9 種培養(yǎng)基，pH = 5. 8， 用IOOml錐形瓶盛裝，每個錐形瓶中培養(yǎng)基的體積大約為30ml ；(2)剝?nèi)〗?、無病斑、光亮的完整百合‘索邦’鱗片，用流水沖洗30min以上，然后在無菌的條件下用75%酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，再用0. 的升汞溶液浸泡10 15min,無菌水沖洗3次，每次5min ；(3)無菌條件下在鋪有濾紙的盤子上用手術(shù)刀切取約1. OcmX 1. 5cm大小的鱗片， 用鑷子將切割的鱗片近軸面向上接種到MS基本培養(yǎng)基中+蔗糖3% +瓊脂0. 6%，添加NAA 0. 2mg · L-1和6-BAO. 5mg · L-1的培養(yǎng)基上，pH = 5. 8，每個錐形瓶中接種3 4個鱗片，培養(yǎng)期間每隔2個月更換一次培養(yǎng)基，待植株分化成苗并長出小鱗莖后待用。(4)剝?nèi)?3)所得百合幼苗的小鱗片并切取基部約3_5mm大小的小鱗片，用鑷子將切割的鱗片基部近軸面向上接種到表1所列的培養(yǎng)基上，每個錐形瓶中接種3 4個，培養(yǎng)期間每隔2個月更換一次培養(yǎng)基統(tǒng)計植株誘導率，結(jié)果如表1所示。表1不同處理對‘索邦’小鱗片基部植株誘導率的影響
權(quán)利要求
1.一種刪除選擇標記基因的百合轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，將分別攜帶目標基因和 Cre/loxP的植物表達載體，通過基因槍共轉(zhuǎn)化百合，誘導共轉(zhuǎn)化株系的Cre基因表達，刪除位于兩個同向IoxP位點間的選擇標記基因，分化出再生植物，獲得無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因株系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的百合轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，包括如下步驟1)將百合鱗片表面滅菌后接種到分化培養(yǎng)基中誘導百合鱗片直接分化出小鱗莖；2)將步驟1)分化的小鱗片基部接種至分化培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)，預培養(yǎng)后進行基因槍轟擊，轟擊后進行恢復培養(yǎng)；3)將恢復培養(yǎng)后的小鱗片基部接種至篩選培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)；4)將獲得的轉(zhuǎn)化苗的小鱗片基部在篩選培養(yǎng)基中進行低溫誘導后轉(zhuǎn)入常溫培養(yǎng)，分化出無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因再生株系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的百合轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟幻中所述的篩選培養(yǎng)基為含有50 120mg · L—1卡那霉素和5 IOmg · L—1草丁膦的分化培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的百合轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述的分化培養(yǎng)基為含有 0. 1 0. 3mg · Γ1的NAA，0. 005 0. Olmg · Γ1的TDZ和3wt%的蔗糖的MS固體培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的百合轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述的分化培養(yǎng)基為含有 0. 2mg ·廠1的NAA, 0. 005mg · Γ1的TDZ和蔗糖的MS固體培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的百合轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟2)所述的預培養(yǎng)為黑暗培養(yǎng)2 4d，所述的恢復培養(yǎng)為黑暗培養(yǎng)3 5d，基因槍的轟擊距離為6 9cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的百合轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟幻所述的預培養(yǎng)時間為 2d，所述的恢復培養(yǎng)時間為3d，基因槍的轟擊距離為9cm。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的百合轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述的篩選培養(yǎng)為將轟擊后的小鱗片在篩選培養(yǎng)基上進行連續(xù)7次篩選，每隔15 20d更換一次培養(yǎng)基，前3次篩選培養(yǎng)基的卡那霉素濃度為80mg · L—1，后4次篩選培養(yǎng)基的卡那霉素濃度為120mg · L—1。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的百合轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟4)中所述的低溫誘導為 4°C處理12小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的百合轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，誘導Cre基因表達的啟動子為rc^9A，所述的目標基因為P5CS-F129A。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種刪除選擇標記基因的百合轉(zhuǎn)基因方法，其為將分別攜帶目標基因和Cre/loxP的植物表達載體，通過基因槍共轉(zhuǎn)化百合，誘導共轉(zhuǎn)化株系的Cre基因表達，刪除位于兩個同向loxP位點間的選擇標記基因，分化出再生植物，獲得無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因株系。本發(fā)明獲得基因槍法共轉(zhuǎn)化百合植株，通過4℃低溫誘導12h將標記基因刪除，最終獲得安全轉(zhuǎn)基因植株，消除人們對轉(zhuǎn)基因植物生物安全性問題的疑慮。
文檔編號C12N15/82GK102559741SQ20111043588
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者何恒斌, 劉燕, 張秀海, 張銘芳, 李雙, 杜運鵬, 袁霖, 賈桂霞 申請人:北京林業(yè)大學