專利名稱：一種定量測定rna和dna濃度及其比值的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于定量測定微生物、動植物組織和活體細胞中RNA濃度和DNA濃度及其比值的新方法，特別是使用熒光染料GelRed測定RNA濃度和DNA濃度及其比值的方法。該方法可用于環(huán)境生物樣品的分析測定。
背景技術(shù)：
對生物樣品微量雙鏈DNA進行定量在各種生物學(xué)研究中非常重要，如核酸提取過程中的DNA和RNA定量、逆轉(zhuǎn)錄過程中RNA和cDNA濃度控制、建立cDNA文庫過程中RNA濃度和質(zhì)量控制、用于判斷生物營養(yǎng)健康狀態(tài)的RNA和DNA比值以及藥物研發(fā)過程中對植物組織樣品中DNA定量等。目前，測定生物組織DNA濃度和RNA濃度的方法主要采用光吸收法(紫外分光光度法)和染料法(熒光染料)。其中，紫外分光光度法快速便捷，對儀器沒有特殊要求并且對環(huán)境無污染，使用較廣。如最常用的檢測核酸濃度的方法就是檢測核酸在260nm(A26CI)處的光吸收。但這種方法缺點在于單鏈核苷酸和單核苷酸會對吸光度產(chǎn)生干擾信號，并且核酸樣品中的蛋白等雜質(zhì)也會影響光吸收。另外，光吸收不能區(qū)分DNA和RNA，靈敏度也相對較低(用Icm的比色杯在A26tl值為0. 1時對應(yīng)的雙鏈DNA濃度為5 μ g/ml)。這在一定程度上限制了該方法在高靈敏度樣品測試中的應(yīng)用。染料法即利用某些熒光染料與DNA或RNA結(jié)合后發(fā)出的熒光強度來分析樣品中的 DNA濃度和RNA濃度水平。溴化乙啶(EB)是目前使用最廣泛的核酸凝膠染色試劑，能夠在多數(shù)應(yīng)用中提供可以接受的靈敏度(納克級)，但它是一種高誘變性的化學(xué)物質(zhì)，對分析測試人員和環(huán)境具有致突變的毒害作用。并且EB染色后具有較高的背景熒光信號，對準確定量樣品中DNA濃度具有不利影響。而STOR Green I染料雖然也具有較高的靈敏性，但這種染料在分析測試過程中的穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致與DNA或RNA結(jié)合穩(wěn)定而影響分析結(jié)果。而近年在市場上新出現(xiàn)的染料如Hoechst染料和PicoGreen染料，雖然也具有非常高的靈敏度， 但價格昂貴，造成分析測試的高成本，為一般實驗室難以承受。因此，需要開發(fā)一種對環(huán)境無污染且簡便、高效、靈敏檢測生物樣品中RNA濃度與DNA濃度及其比值的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供的一種定量測定RNA濃度和DNA濃度及其比值的方法，能夠靈敏、快速地同時測定生物組織或細胞中RNA濃度和DNA濃度及其比值。為實現(xiàn)本發(fā)明目的而提供的一種定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，包括以下步驟a)配制DNA標準溶液、RNA標準溶液、GelRed染料溶液，并制備待測樣品溶液；b)將獲得的DNA標準溶液、RNA標準溶液和待測樣品溶液分別與GelRed染料溶液混合；
c)將與GelRed染料溶液混合后的DNA標準溶液、RNA標準溶液、待測樣品溶液分別加入酶標板中；d)分別測定所述酶標板中DNA標準溶液、RNA標準溶液和待測樣品溶液的熒光值；e)根據(jù)所述DNA標準溶液、RNA標準溶液的熒光值制作熒光值-濃度的標準曲線， 所建標準曲線的線性回歸方程為y = ax+b，確定a，b值；f)根據(jù)標準曲線計算所述待測樣品DNA濃度和RNA濃度。本發(fā)明還提供了一種靈敏、快速地測定生物組織或細胞中RNA和DNA比值的方法， 所述方法包括(1)采用本發(fā)明所述的方法測定RNA的濃度和DNA的濃度；(2)確定RNA的濃度和DNA的濃度之間的比值。本發(fā)明測定生物組織與細胞中RNA濃度和DNA濃度及其比值的方法，充分利用 GelRed染料能夠與dSDNA、SSDNA或RNA結(jié)合，同時高靈敏度、低毒性并且穩(wěn)定性的特性，簡便、高效、靈敏地檢測生物樣品RNA與DNA比值。與其它方法相比，該方法廢棄物可直接倒入下水道而不會造成環(huán)境污染，并且對實驗操作人沒有任何毒害作用；染料用量少，簡單經(jīng)濟；方法靈敏度高，可以檢測生物樣品中ng級的RNA和DNA，對樣品的需要量少，從而大大降低了分析成本并提高了分析效率。本發(fā)明的方法為生物學(xué)相關(guān)研究提供了重要的分析技術(shù)，在生物、環(huán)境等領(lǐng)域研究具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明的分析方法還可以用于分析環(huán)境生物體內(nèi)RNA和DNA比值判斷生物體健康狀況和營養(yǎng)條件以及環(huán)境污染對生態(tài)可能造成的影響。下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為測定樣品DNA的標準曲線。圖2為測定樣品RNA的標準曲線。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及具體實施方式
詳述本發(fā)明定量測定RNA濃度和DNA濃度及其比值的方法。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施方式
僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。作為一種可實施方式，本發(fā)明實施例提供的一種定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，包括以下步驟a)配制DNA標準溶液、RNA標準溶液、GelRed染料溶液，并制備待測樣品溶液；b)將步驟a)中獲得的DNA標準溶液、RNA標準溶液、待測樣品溶液分別與GelRed 染料溶液混合；c)將與GelRed染料溶液混合后的DNA標準溶液、RNA標準溶液、待測樣品溶液分別加入酶標板中；d)分別測定酶標板中DNA標準溶液、RNA標準溶液和待測樣品溶液的熒光值；e)根據(jù)DNA標準溶液、RNA標準溶液的熒光值制作熒光值-濃度的標準曲線，所建標準曲線的線性回歸方程為y = ax+b，確定a，b值；f)根據(jù)標準曲線計算所述待測樣品DNA濃度和RNA濃度。較佳地，作為一種可實施方式，其中所述的DNA標準溶液是使用0. 的STEB稀釋 DNA標準品至適當濃度，所述的RNA標準溶液是使用0. 1 %的STEB稀釋RNA標準品至適當濃度。較佳地，作為一種可實施方式，其中所述的待測樣品是使用0. 的STEB緩沖液稀釋樣品至適當濃度。較佳地，作為一種可實施方式，其中當所述的待測樣品溶液的熒光值處于所述的標準溶液的熒光值范圍之外時，進一步稀釋所述待測樣品溶液使其熒光值在所述標準溶液的熒光值范圍內(nèi)。較佳地，作為一種可實施方式，其中所述的GelRed染料溶液使用0. 1% STEB緩沖液稀釋GelRed染料5000倍得到的。較佳地，作為一種可實施方式，其中測定所述溶液熒光值時所使用的波長激發(fā)光的波長為250-270nm ；發(fā)射光的波長為570_600nm。較佳地，作為一種可實施方式，其中所述的激發(fā)光波長為260nm ；發(fā)射光的波長為 590nmo較佳地，作為一種可實施方式，其中所述的與GelRed染料溶液的混合包括吸取預(yù)設(shè)體積的樣品或DNA標準溶液或RNA標準溶液和等體積GelRed染料溶液至離心管中，充分混勻。較佳地，作為一種可實施方式，其中所述的酶標板是黑色不透光，96孔不可拆或可拆酶標板。較佳地，作為一種可實施方式，其中所述的待測樣品溶液或DNA標準溶液或RNA標準溶液和GelRed染料溶液混合后加入酶標板中的加樣方法為
權(quán)利要求
1.一種定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a)配制DNA標準溶液、RNA標準溶液、GelRed染料溶液，并制備待測樣品溶液；b)將步驟a)中獲得的DNA標準溶液、RNA標準溶液、待測樣品溶液分別與GelRed染料溶液混合；c)將與GelRed染料溶液混合后的DNA標準溶液、RNA標準溶液、待測樣品溶液分別加入酶標板中；d)分別測定所述酶標板中DNA標準溶液、RNA標準溶液和待測樣品溶液的熒光值；e)根據(jù)所述DNA標準溶液、RNA標準溶液的熒光值制作熒光值-濃度標準曲線，所建標準曲線的線性回歸方程為y = ax+b，確定a，b值；f)根據(jù)標準曲線計算所述待測樣品的DNA濃度和RNA濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，所述的 DNA標準溶液是使用0. 1 %的STEB稀釋DNA標準品至適當濃度，所述的RNA標準溶液是使用0. 1 %的STEB稀釋RNA標準品至適當濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，所述的待測樣品溶液是使用0. 的STEB緩沖液稀釋樣品至適當濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，當所述的待測樣品溶液的熒光值處于所述的標準溶液的熒光值范圍之外時，進一步稀釋所述待測樣品溶液使其熒光值在所述標準溶液的熒光值范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，所述的 GelRed染料溶液是使用0. 1% STEB緩沖液稀釋GelRed染料5000倍得到的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，測定所述溶液熒光值時所使用的波長激發(fā)光的波長為250-270nm ；發(fā)射光的波長為570-600nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，所述激發(fā)光的波長為260nm ；發(fā)射光的波長為590nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，所述的與GelRed染料溶液的混合包括吸取預(yù)設(shè)體積的樣品或DNA標準溶液或RNA標準溶液和等體積GelRed染料溶液至離心管中，充分混勻。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，所述的酶標板是黑色不透光，96孔不可拆或可拆酶標板。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，所述的待測樣品溶液或DNA標準溶液或RNA標準溶液和GelRed染料溶液混合后加入酶標板中的加樣方式為
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，所述的測定DNA標準溶液、RNA標準溶液和待測樣品溶液的熒光值的步驟是按下述步驟進行的1)讀取酶標板上每個孔的熒光值并記為Fl；2)向每個孔中加入10μ 1的RNase A工作液，然后繼續(xù)振蕩20-30min ；3)再次讀取酶標板上每個孔的熒光信號值，記為F2； 則DNA的熒光值Fdna = F2 RNA 的熒光值 Fkna = F1-F2以DNA標準溶液，RNA標準溶液的濃度為橫坐標，所測得的熒光值為縱坐標，繪制標準曲線，DNA線性回歸方程、RNA線性回歸方程分別為 DNA 含量=[(FDNA-b) /a] X 稀釋因子 X 1. 5， 其中a為線性回歸方程的斜率，b為線性回歸方程的截距； RNA 含量=[(FENA-b) /a] X 稀釋因子 X 1. 5 其中a為線性回歸方程的斜率，b為線性回歸方程的截距。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，在讀取熒光值F2之后，再向每個孔中加入10 μ 1的DNase I工作液，在37度條件下溫浴1-1. 5 小時；然后在室溫下放置20-30min至室溫；再次讀取熒光信號值，記為F3 ； 則DNA 的熒光值 Fdna = F2-F3 RNA 的熒光值 Fkna = F1-F2以DNA標準溶液，RNA標準溶液的濃度為橫坐標，所測得的熒光值為縱坐標，繪制標準曲線，DNA線性方程、RNA線性回歸方程分別為DNA含量=[(FDNA-b)/a] X稀釋因子X 1.5，其中a為線性回歸方程的斜率，b為線性回歸方程的截距；RNA含量=[(Fm-b)/a] X稀釋因子X 1.5，其中a為線性回歸方程的斜率，b為線性回歸方程的截距。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于， 所述的DNA標準曲線y = 14242x+630. 06,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9994 ；RNA標準曲線y = 3562. 9x+518. 75，相關(guān)系數(shù) R2 = 0. 9998。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項權(quán)利要求所述的定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，其特征在于，所述方法的線性范圍DNA的線性范圍在0. 015-2. 2μ g/ml之間，RNA的線性范圍在0. 04-3. 66 μ g/ml之間。
15.一種測定RNA和DNA比值的方法，所述方法包括(1)采用權(quán)利要求1-14中任一項所述的方法測定RNA的濃度和DNA的濃度；(2)確定RNA的濃度和DNA的濃度之間的比值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量測定微生物、動植物組織和活體細胞中RNA和DNA濃度及其比值的新方法，特別是使用GelRed染料測定RNA濃度和DNA濃度及其比值的方法。該方法可用于環(huán)境生物樣品的分析測定。本發(fā)明在保證高靈敏度的前提下，提高了分析過程中的生物安全性并降低了廢棄物對環(huán)境可能造成的污染。同時本發(fā)明方法降低了對樣品的需求量，提高了檢測實用效率，為開展生物學(xué)研究和環(huán)境生物健康調(diào)查提供了可靠分析技術(shù)手段。
文檔編號C12Q1/68GK102559879SQ201110435760
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者安立會, 宋雙雙, 張雷, 趙興茹, 鄭丙輝, 陳浩 申請人:中國環(huán)境科學(xué)研究院