專利名稱：產(chǎn)纖維素酶菌株、纖維素酶及其生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的方法
產(chǎn)纖維素酶菌株、纖維素酶及其生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及微生物及微生物發(fā)酵領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌屬菌株，纖維素酶以及生產(chǎn)方法。芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)菌株的保藏號為=CGMCC No. 5311，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期2011年9月29日。
背景技術(shù)：
纖維素是細(xì)胞壁的主要成分，是由葡萄糖通過β_(1，4)糖苷鍵連接而成的線狀大分子聚合物。纖維素酶是一種在分解纖維素時(shí)起生物催化作用的酶。纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。不同來源的纖維素酶其結(jié)構(gòu)和功能相差很大。纖維素酶根據(jù)其催化反應(yīng)功能的不同可分為葡聚糖內(nèi)切酶(l，4-g-D-glUcan glucanohydrolase 或 endo-1,4_β-D-glucanase, EC3. 2.I.4),葡聚糖外切酶(1， 4_β -D-glucan cellobilhydrolase或exo_l,4_β -D-glucannase,EC. 3· 2· I. 91)和 β -葡聚糖苷酶(i3-l，4-gluCOSidaSe，EC. 3. 2. 1.21)。內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定型區(qū)，產(chǎn)生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。β -葡萄糖苷酶水解纖維二糖產(chǎn)生兩分子的葡萄糖。纖維素酶反應(yīng)和一般酶反應(yīng)不一樣，其最主要的區(qū)別在于纖維素酶是多組分酶系，且底物結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用代替了酶與底物形成的ES復(fù)合物過程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上，然后在幾種組分的協(xié)同作用下將纖維素分解成葡萄糖。影響產(chǎn)酶量和活力的因素影響纖維素酶產(chǎn)量和活力的因素很多，除菌種外，還有培養(yǎng)溫度、pH、水分、基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間等。這些因素不是孤立的，而是相互聯(lián)系的。目前，國內(nèi)外產(chǎn)纖維素酶菌株容易退化、且發(fā)酵要求條件苛刻，生產(chǎn)成本高，不能大規(guī)模應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)，提供一種產(chǎn)生纖維素酶的芽孢桿菌 (Bacillus sp.)菌株和利用此菌株生產(chǎn)纖維素酶的生產(chǎn)方法。經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化篩選及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制，確立了穩(wěn)定的發(fā)酵方法，生產(chǎn)的纖維素酶制劑具有良好的酶活性。本發(fā)明目的是這樣完成的一種芽孢桿菌(Bacillus sp)，其保藏號為 CGMCCNo. 5311，該菌株具有高產(chǎn)纖維素酶的能力?？捎行У孬@得的纖維素酶。利用權(quán)利要求I所述的芽孢桿菌(Bacillus sp)菌種生產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于將該菌種接種于LB培養(yǎng)基或其他適合其的培養(yǎng)基中，在溫度為10 35°C培養(yǎng)12小時(shí)；將分離純化待測菌株轉(zhuǎn)接到Mastplate平板上的單菌落，再接種到纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基平板上，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱IOh ；待菌落直徑大小約3 6mm時(shí)，用O. 2%的剛果紅溶液染色2h，然后用5% NaCl溶液脫色lh，然后測量水解圈和菌株直徑的大小，計(jì)算水解圈和菌株直徑的比值，利用進(jìn)活化篩選出的實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，獲得本發(fā)明的纖維素酶制劑；所述LB培養(yǎng)基成分如下酵母粉5g,蛋白胨IOg,氯化鈉10g。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，可將菌種直接接種于種子培養(yǎng)基中，然后以I 10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)溫度為10°C 40°C，培養(yǎng)時(shí)間為30 75小時(shí)，培養(yǎng)的PH值可在4. 5
9.5的生產(chǎn)范圍。以下的條件培養(yǎng)溫度最好為15 40°C，PH值在5 8范圍內(nèi)更適合于本發(fā)明的纖維素酶的生產(chǎn)，生產(chǎn)纖維素酶制劑，經(jīng)上述，優(yōu)選羧甲基纖維素鈉作為碳源，用量為O. 3 1.8% ;優(yōu)選蛋白胨、酵母膏作為最佳的氮源，用量在O. I I. 5%。由下述方法獲得纖維素酶制劑利用過濾法或離心法從培養(yǎng)液中分離菌體和培養(yǎng)基物質(zhì)，得到上清液或?yàn)V液，然后對濾液超濾濃縮等方法最后制得纖維素酶制劑。本發(fā)明產(chǎn)纖維素酶的菌株可廣泛用于烤煙醇化、食品加工、飼料加工等行業(yè)，并具
有重要意義。


下面結(jié)合附圖，進(jìn)一步說明本發(fā)明內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。圖I :菌株48-1系統(tǒng)發(fā)育分析。圖2 :不同碳源對菌株48-1產(chǎn)纖維素酶活的影響。圖3 :不同氮源對菌株48-1產(chǎn)纖維素酶活的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是通過在玉溪烤煙表面分離，純化和篩選，獲得一批產(chǎn)纖維素酶的微生物菌株，從中選出一株編號為48-1的菌株，具有高產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良性狀。經(jīng)16S rDNA鑒定和生理生化鑒定，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的菌株，其保藏號為=CGMCC No. 5311。本發(fā)明在獲得芽孢桿菌屬(Bacillus sp. )48_1菌株的基礎(chǔ)上，提供了該菌株纖維素酶的生產(chǎn)方法，通過利用本發(fā)明的菌株經(jīng)過本發(fā)明確定的具體發(fā)酵方法而獲得。本發(fā)明的產(chǎn)纖維素酶菌株48-1可采用如下方法對其進(jìn)行篩選以及搖瓶發(fā)酵以獲得本發(fā)明的纖維素酶制劑。將本發(fā)明菌種接種于LB培養(yǎng)基或其他適合其的培養(yǎng)基中，10 35°C培養(yǎng)12小時(shí)。其LB培養(yǎng)基成分如下酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g。將分離純化待測菌株轉(zhuǎn)接到Mastplate平板上的單菌落，再接種到纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基平板上，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱10h。待菌落直徑大小約3 6mm時(shí)，用O. 2%的剛果紅溶液染色2h，然后用5% NaCl溶液脫色lh，然后測量水解圈和菌株直徑的大小，計(jì)算水解圈和菌株直徑的比值。一般說來，比值的大小與菌株降解纖維素能力大小有關(guān)。水解圈和菌株直徑的比值越大，該菌株降解纖維素的能力越強(qiáng)，分泌纖維素酶的能力也越強(qiáng)，因此計(jì)算比值是進(jìn)一步篩選菌株的較好依據(jù)。纖維素剛果紅平板透明圈篩選法用于纖維素分解菌酶活力大小的定性試驗(yàn)， 透明圈的大小直接反映了酶濃度的高低。此法決速方便，適合于大量菌株篩選。利用進(jìn)活化篩選出的本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，獲得本發(fā)明的纖維素酶制劑。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，可將菌種直接接種于種子培養(yǎng)基中，然后以I 10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。作為培養(yǎng)基的營養(yǎng)源，可廣泛使用通常用于培養(yǎng)的營養(yǎng)源。只要是可作為碳源同化的碳化合物或者含有該碳化合物的，微生物菌種可以利用的，適合于發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生纖維素酶的碳源即可，例如，可使用葡萄糖、麥芽汁、蔗糖、可用的多糖等。本發(fā)明中優(yōu)選羧甲基纖維素鈉作為碳源，用量為O. 3 I. 8%。作為氮源，只要是可作為氮源同化的氮化合物或者是含有該氮化合物的即可，例如，可用銨鹽、硝酸鹽、大豆粉、酵母膏等，其氮源的選擇和用量，可依據(jù)其他營養(yǎng)源的成分和用量的不同而不同，只要適合本發(fā)明的纖維素酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)及酶的生產(chǎn)即可。在本發(fā)明中，優(yōu)選蛋白胨、酵母膏作為最佳的氮源，用量在O. I I. 5%。對于無機(jī)鹽類，可適當(dāng)添加磷酸氫氨，磷酸二氫鉀等磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、錳鹽等鹽類，培養(yǎng)條件依據(jù)培養(yǎng)基的成分不同而有變化，只要適宜菌體產(chǎn)生本發(fā)明的纖維素酶即可。通常，可選擇以下的條件培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為10°C 40°C，最好為15 40°C，培養(yǎng)時(shí)間為30 75小時(shí)，只要在本發(fā)明的纖維素酶產(chǎn)量達(dá)到最高時(shí)結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)即可。培養(yǎng)的 pH值可在4. 5 9. 5的生產(chǎn)范圍，特別是在5 8范圍內(nèi)更適合于本發(fā)明的纖維素酶的生產(chǎn)。經(jīng)如上述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，生產(chǎn)本發(fā)明的纖維素酶制劑。從如上所得的培養(yǎng)液中提取纖維素酶，可按照通常用于采集細(xì)胞外酶的方法，如硫酸銨鹽析、超濾濃縮、冷凍干燥、色譜分離等，分離精制而成。本發(fā)明可由下述方法獲得纖維素酶制劑利用過濾法或離心法從培養(yǎng)液中分離菌體和培養(yǎng)基物質(zhì)，得到上清液或?yàn)V液， 然后對濾液超濾濃縮等方法最后制得纖維素酶制劑。本發(fā)明的芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)菌株可有效地生產(chǎn)本發(fā)明的纖維素酶。實(shí)施例I :產(chǎn)纖維素酶菌株48-1菌株生理生化特征從玉溪烤煙表面分離，純化和篩選，獲得一株編號為48-1高產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌菌株。該菌株已在“中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”(中國北京)保藏，保藏號為CGMCC No. 5311。菌株48-1的菌落呈菌落圓形、白色，凸起，菌落大小5. 0-6. Omm,有光澤，菌落不透明，質(zhì)地有粘性。該菌株可在10 35°C，pH范圍是4. 5 9. 5范圍內(nèi)均可生長。細(xì)菌的 16S rDNA序列經(jīng)提交NCBI數(shù)據(jù)庫，在GenBank中進(jìn)行同源序列比對搜索(BLAST)，并下載相關(guān)類群微生物模式菌株的16S rDNA序列。利用ClustalX軟件對16S rDNA序列與模式菌株的16SrDNA序列進(jìn)行比對，然后用MEGA4. O軟件根據(jù)Neighbor-Joinin法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行1000次Bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，其系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖I。本發(fā)明的高產(chǎn)纖維素酶菌株48-1的生理生化特征如表I所示。其生理生化特征使用杭州天和微生物試劑有限公司的細(xì)菌微量生化反應(yīng)管分析細(xì)菌的尿素、半乳糖、硫化氫還原、阿拉伯糖、明膠、硝酸鹽還原、葡萄糖、木糖、纖維二糖和甘露醇的生理生化特征。結(jié)合生理生化特征,將48-1菌株鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的菌株。實(shí)施例2 產(chǎn)纖維素酶菌株48-1的篩選及發(fā)酵條件將分離到的菌株接種于含有1%的羧甲基纖維素鈉(CMC)的LB培養(yǎng)基上，其成分為酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，0 35°C培養(yǎng)12小時(shí)，待菌落直徑大小約3 6mm 時(shí)，用O. 2%的剛果紅溶液染色2h，然后用5% NaCl溶液脫色lh，然后測量水解圈和菌株直徑的大小，計(jì)算水解圈和菌株直徑的比值。一般說來，比值的大小與菌株降解纖維素能力大小有關(guān)。水解圈和菌株直徑的比值越大，該菌株降解纖維素的能力越強(qiáng)，分泌纖維素酶的能力也越強(qiáng)，產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩采用酶活的測定方法進(jìn)行，酶活力的測定參考Miller G. L 的DNS法，這種方法可以確知待篩選菌株產(chǎn)纖維素酶活力單位。酶活力單位的定義在pH 7. 0、37°C下，單位時(shí)間內(nèi)催化纖維素生成Iyg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。將初篩有降解纖維素活力的菌落用接種針轉(zhuǎn)接到液體LB培養(yǎng)基和液體(CMC+LB)培養(yǎng)基中，置 37°C、150rpm條件下培養(yǎng)10h，然后按I %的接種量將培養(yǎng)液接入新鮮的液體LB培養(yǎng)基中， 370C、150rpm條件下培養(yǎng)60h。采用DNS法檢測菌株醇化液中的纖維素酶活力，并區(qū)別在液體LB培養(yǎng)基和液體(CMC+LB)培養(yǎng)基中同一菌株降解纖維素能力有無差別。結(jié)果表明菌株 48-1產(chǎn)纖維素酶的活力最高。實(shí)施例3 高產(chǎn)纖維素酶菌株48-1產(chǎn)酶條件優(yōu)化碳源對產(chǎn)酶的影響基礎(chǔ)培養(yǎng)基A :酵母粉O. 2g/L，氯化鉀O. 5g/L，磷酸氫二鉀lg/L，硝酸鈉lg/L， 硫酸鎂0.4g/L，硫酸亞鐵0.01g/L。分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、甘油、果糖和 CMC-Na(終濃度lg/L)，pH 7. O。用接種針從48_1菌株斜面挑起少許菌苔分別接入液體LB 培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2 3d。再按I %的接種量接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基A中，37°C振蕩培養(yǎng) 2d。采用DNS法檢測各發(fā)酵液中的纖維素酶活力。結(jié)果表明在各種碳源中，葡萄糖酶活最高，麥芽糖次之，蔗糖、淀粉和甘油產(chǎn)酶量相對較低(圖2)。氮源對產(chǎn)酶的影響基礎(chǔ)培養(yǎng)基B :葡萄糖lg/L，酵母粉O. 2g/L，磷酸氫二鉀lg/L，硫酸鎂O. 4g/L，氯化鉀O. 5g/L，硫酸亞鐵O. 01g/L。分別加入硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、酵母粉、尿素、檸檬酸銨、氯化銨(終濃度lg/L)，pH 7. O。用接種針將48-1接入液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2 3d。按1%的接種量接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基B中，37°C振蕩培養(yǎng)2d。采用DNS法檢測各發(fā)酵液中的纖維素酶活力。結(jié)果表明在參試的7種氮源中，無機(jī)氮源效果優(yōu)于有機(jī)氮源，而無機(jī)氮源中以硫酸銨效果最佳(圖3)。經(jīng)碳源、氮源、pH、溫度、時(shí)間優(yōu)化，表明48-1菌株的優(yōu)化產(chǎn)酶條件為培養(yǎng)基組成酵母粉0. 2g/L，葡萄糖lg/L，硫酸銨2g/L，磷酸氫二鉀lg/L，硫酸鎂0. 4g/L，氯化鉀 0. 5g/L，硫酸亞鐵0. 01g/L，pH 9.0。培養(yǎng)溫度25°C。培養(yǎng)時(shí)間48h。在優(yōu)化條件下48_1 菌株的酶活力比優(yōu)化前提高了 4. 7倍。在優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)高濃度的碳源(大于0. 1% )不利于48-1菌株產(chǎn)酶，這可能與纖維素酶受葡萄糖反饋抑制和菌株長期生長于碳源營養(yǎng)相對貧乏的環(huán)境，形成獨(dú)特的生長代謝類型有關(guān)。表I :菌株48-1的生理生化特征表I
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)纖維素酶菌株，其菌株是芽孢桿菌(Bacillus sp),保藏號為 CGMCCNo. 5311，該菌株具有產(chǎn)纖維素酶的能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的產(chǎn)纖維素酶菌株，其特征在于芽孢桿菌(Bacillussp)可有效地獲得高產(chǎn)的纖維素酶。
3.利用權(quán)利要求I所述的芽孢桿菌(Bacillussp)菌種生產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于將該菌種接種于LB培養(yǎng)基或其他適合其的培養(yǎng)基中，在溫度為10 35°C培養(yǎng)12小時(shí)；將分離純化待測菌株轉(zhuǎn)接到Mastplate平板上的單菌落，再接種到纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基平板上，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱IOh ；待菌落直徑大小約3 6mm時(shí)，用O. 2%的剛果紅溶液染色2h，然后用5% NaCl溶液脫色lh，然后測量水解圈和菌株直徑的大小，計(jì)算水解圈和菌株直徑的比值，利用進(jìn)活化篩選出的實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，獲得本發(fā)明的纖維素酶制劑；所述LB培養(yǎng)基成分如下酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的芽孢桿菌(Bacillussp)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，可將菌種直接接種于種子培養(yǎng)基中，然后以I 10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的芽孢桿菌屬(Bacillussp)的發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于選擇培養(yǎng)溫度為10°c 40°C，培養(yǎng)時(shí)間為30 75小時(shí)，培養(yǎng)的PH值可在4. 5 9. 5的生產(chǎn)范圍。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的芽孢桿菌屬(Bacillussp)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于以下的條件培養(yǎng)溫度最好為15 40°C，PH值在5 8范圍內(nèi)更適合于本發(fā)明的纖維素酶的生產(chǎn)，生產(chǎn)纖維素酶制劑，經(jīng)上述。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的芽孢桿菌屬(Bacillussp)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于優(yōu)選羧甲基纖維素鈉作為碳源，用量為O. 3 I. 8% ;優(yōu)選蛋白胨、酵母膏作為最佳的氮源，用量在O. I I. 5%。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的芽孢桿菌屬(Bacillussp)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于由下述方法獲得纖維素酶制劑利用過濾法或離心法從培養(yǎng)液中分離菌體和培養(yǎng)基物質(zhì)，得到上清液或?yàn)V液，然后對濾液超濾濃縮等方法最后制得纖維素酶制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)生纖維素酶的芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)菌株和利用此菌株生產(chǎn)纖維素酶的生產(chǎn)方法。經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化篩選及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制，確立了穩(wěn)定的發(fā)酵方法，生產(chǎn)的纖維素酶制劑具有良好的酶活性?？蓮V泛用于烤煙醇化、食品加工、飼料加工等行業(yè)，并具有重要意義。
文檔編號C12N9/42GK102586133SQ20111043556
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者劉永亮, 唐興宏, 季秀玲, 王毅, 馬永凱, 魏云林 申請人:紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司