專利名稱：一種利用基因拆分控制轉(zhuǎn)基因飄流的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因生物安全技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用基因拆分控制轉(zhuǎn)基因飄流的方法。
背景技術(shù)：
隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起和快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因生物的安全性問題相伴而生，由轉(zhuǎn)基因生物引發(fā)的安全問題，逐漸成為國際社會廣泛關(guān)注的熱點和焦點。在科技界和公眾關(guān)注的轉(zhuǎn)基因作物(GMC)安全性問題中，轉(zhuǎn)基因飄流及其可能引起的環(huán)境后果和對人類健康的影響是問題的焦點之一。雖然基因飄流歷來存在，并非從GMC開始，且是植物物種進化的動力，但遺傳上遠緣的外源基因在導入到一個新的遺傳背景中后會產(chǎn)生何種新的變化，對環(huán)境和食品安全性有何影響，需要根據(jù)基因的種類、基因所提供的表型性狀、以及轉(zhuǎn)基因植物釋放的環(huán)境等因素進行個案分析。這是一個耗時、費力、需要投入的復雜過程，加之轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品要讓公眾接受，最好的辦法是從根本上杜絕基因飄流，保障GMC的環(huán)境和食品安全。目前防止和減少轉(zhuǎn)基因飄流的技術(shù)，主要是采取時空隔離(距離隔離、花期隔離)、摘除花器或限制開花、雄性不育等，這些可稱為減少基因飄流的現(xiàn)有技術(shù)。時空隔離已進行了許多研究，如明確不同作物的最大基因飄流距離，提出相應(yīng)的距離和花期隔離措施。 雄性不育雖可使轉(zhuǎn)基因作物不產(chǎn)生花粉，可有效地用于不需采收種子的植物如林木、牧草、 花卉等，但對生產(chǎn)上應(yīng)用雜交種的作物如雜交水稻而言，該法仍不能避免基因飄流，因為即便用于配制雜交種的父本不產(chǎn)生花粉，但雜種Fl在大面積生產(chǎn)中仍將有花粉飄出。因此總體上說，以上現(xiàn)有技術(shù)只能限制或減少基因飄流，并不能從根本上解決基因飄流的問題。 探索研究用生物學限控措施防止基因飄流的新一代技術(shù)，已成為國際研究的熱點和前沿課題，它不僅是一項為發(fā)展新一代技術(shù)的基礎(chǔ)研究，而且對進一步促進和推動GMC的產(chǎn)業(yè)化具有重要的現(xiàn)實意義?；虿鸱旨夹g(shù)是建立在Intein (蛋白內(nèi)含子)及其介導的蛋白剪接的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，簡單說就是將目的基因拆分成兩個基因片段，分別與Intein兩個剪接域的基因序列結(jié)合，形成融合基因，翻譯后形成的兩個融合蛋白通過Intein介導的蛋白剪接功能，將 Intein從前體蛋白中切除，同時將兩個基因片段編碼的蛋白序列連接起來，形成一個完整的、有功能的蛋白。Intein是一類介導翻譯后蛋白剪接的內(nèi)部蛋白元件，前體蛋白中Intein催化一系列反應(yīng)，將其自身從前體蛋白中移去，并將兩側(cè)稱為Extein的蛋白片段以正常的肽鍵連接起來形成成熟蛋白，這個過程稱為蛋白剪接。蛋白剪接是一個非?？焖俚倪^程， Intein-Extein連接處的3個保守的氨基酸殘基直接參與蛋白的拼接反應(yīng)，包括Intein N 末端的Ser或Cys (基序A的第一個氨基酸)，InteinC末端的Asn或Gln (基序G的最后一個氨基酸)，C-eXtein起始端的Ser、Thr或Cys。Intein首先是在酵母中發(fā)現(xiàn)的。1990 年 Kane 等在研究酵母(Saccharomyces cerevisiae)液泡 H(+) 2ATPase 的 69kD 亞基基因 vmal時，首次發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的自我剪接現(xiàn)象(Kane PM, Yamashiro CT, Wolczyk DF, Neff N,Goebl M, Stevens TH(1990)Protein splicing converts the yeast TFPl gene product to the 69-kD subunit of the vacuolar H(+)-adenosine triphosphatase. Science 250:651-657)。Intein普遍存在于三界生物系統(tǒng)(古細菌、真細菌和真核生物)中，目前已發(fā)現(xiàn)了 200 多個(Thomas C, Evans Jr, Xu MQ, Pradhan S(2005)Protein splicing elements and plants :from transgene containment to protein purification. Annu Rev Plant Biol 56 :375_392)。Intein—般由128-1650個氨基酸殘基所組成，含有高度保守的基序 A、B、F 禾口 G (Noren CJ, Wang J, Perler FB (2000) Dissecting the chemistry of protein splicing and its applications. Angew Chem Int Ed Engl 39(3) :450_466)。根據(jù)Intein是否含有居家核酸內(nèi)切酶(homing endonuclease)結(jié)構(gòu)域，可將其分為大Intein 和小Intein，大Intein含有居家核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域、N端和C端剪接域，其中居家核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域不參與蛋白剪接，推測其功能是通過自導引的機制來促進Intein的轉(zhuǎn)移(Gimble FS,Thorner J(1992)Homing of a DNA endonuclease gene by meiotic gene conversion in Saccharomyces cerevisiae. Nature 357:301-306)。另外，根據(jù) N 端和 C 端剪接域是否為共價連接，可將 Intein 分為 cis-splicing inteins 禾口 trans-splicing inteins (Wu H, Xu MQ, Liu XQ(1998)Protein trans-splicing and functional mini-Inteins of a cyanobacterial DnaB Intein. Biochim Biophys Acta 1387 422~432)。
Synechocystis sp. PCC6803 DnaE Intein (Ssp DnaE Intein)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個天然存在的trans-splicing intein，它存在于編碼復制DNA聚合酶III的催化亞基α的DnaE基因中，有123個氨基酸殘基的Indntein N端)和36個氨基酸殘基的 Icdntein C端)兩個片段組成，In和Ic間插入了 745kb的DNA間隔區(qū)域(Wu H，Hu Z， Liu XQ(1998)Protein trans-splicing by a split Intein encoded in a split DnaE gene of Synechocystis sp. PCC6803. Proc Natl Acad Sci USA 95 :9226_9231)。與入工& 成的Intein相比，DnaE Intein催化的蛋白剪接反應(yīng)有效率高和反應(yīng)條件溫和等特點，且 SsP DnaE Intein片段In和Ic離體條件下不經(jīng)尿素處理也能進行剪接(Yamazaki T, Otomo T, Oda N, et al. (1998)Segmental isotope labeling for protein NMR using peptide splicing. J Am Chem Soc 120:5591-5592)。實驗證明 Ssp DnaE Intein 在離體、活體條件下均能進行蛋白質(zhì)的剪接反應(yīng)(Evans TC, Martin D, Kolly R, et al. (2000)Protein trans-splicing and cyclization by a naturally split intein from the DnaE gene of Synechocystis species PCC6803. J Biol Chem 275 :9091_9094)，使分開的兩個基因片段表達后的蛋白片段重新組裝成有功能的完整蛋白質(zhì)，如Chin等將抗除草劑基因(EPSPS) 的N端部分(含有一個葉綠體定位信號)與Ssp DnaE intein N-端整合形成EPSPSn-In， 利用根癌農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法整合到煙草核基因組DNA中；EPSPS基因片段的C-端部分 (EPSPSc)和intein C-端融合形成Ic_EPSPSc，通過同源重組的方法將其整合到煙草葉綠體基因中。Western blot分析顯示轉(zhuǎn)基因植物中存在全長的EPSPS，且這些轉(zhuǎn)基因植物和野生型受體煙草相比，對草甘膦的抗性有了提高。該研究用Ssp DnaE intein證明了 intein 介導的轉(zhuǎn)剪接可在煙草葉綠體中發(fā)生，并且無論intein基因片段均在葉綠體中表達還是被分開在葉綠體和核基因組中表達，intein的轉(zhuǎn)剪接都能發(fā)生(Hang GC, Gun-Do Kim, Ivan Marin et al. (2003)Protein trans-splicing in transgenic plant chloroplast reconstruction of herbicide resistance from split genes. PNAS 100:4510-4515)。Yang 等(Yang J, Fox GCJr, Henry-Smith TV(2003)Intein-mediated assembly of a functional beta-glucuronidase in transgenic plants. Proc Natl Acad Sci USA 100 3513-3518)將Ssp DnaE Intein的N端和C端序列分別與拆分的β -葡糖醛酸苷酶(GUS) 基因的N端或C端連接組成融合基因，⑶Sn/In與Ic/⑶Sc質(zhì)粒通過共轉(zhuǎn)化、或分別轉(zhuǎn)化后通過雜交同時被導入擬南芥基因組時，⑶S基因表達了 β -葡糖醛酸苷酶的活性。因此從理論上推測，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)剪接有可能用于阻止轉(zhuǎn)基因作物中的轉(zhuǎn)基因向近緣種的基因飄流。將目的基因拆分成沒有活性的N-端與C-端兩部分，然后分別與 intein的N-端與C-端相融合，在預定的細胞器或組織中表達后，通過intein的自我剪接功能將它們連在一起，形成有功能活性的蛋白質(zhì)(Evans TC, Xu MQ, Sriharsa P(2005) Protein splicing elements and plants :from transgene containment to protein purification. Annu Rev Plant Biol, 56 375-392 ；Muhammad SK, Khalid AM, Malik KA(2005)Intein-mediated protein trans-splicing and transgene containment in plastids. Trends Biotech, 23 (5) =217-219) 研究發(fā)現(xiàn)植物葉綠體中有強烈的蛋白質(zhì)拼接現(xiàn)象，這一發(fā)現(xiàn)為阻斷轉(zhuǎn)基因飄流提供了美好的前景(Dale PJ, Clarke B, Fontes EM(2002)Potential for the environmental impact of transgenic crops. Nature Biotechnology, 20 :567_574)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用基因拆分控制轉(zhuǎn)基因飄流的方法。一種利用基因拆分控制轉(zhuǎn)基因飄流的方法，其特征在于，包括如下步驟a、根據(jù)目的基因的高級結(jié)構(gòu)或利用接點掃描系統(tǒng)，確定目的基因的可拆分位點， 利用PCR方法將目的基因分成N端和C端兩部分，并分別與intein的N端和C端連接，形成融合基因片段A和融合基因片段B ；b、分別構(gòu)建融合基因片段A和融合基因片段B的植物表達載體，單獨導入受體植物材料，獲得轉(zhuǎn)基因植株A和轉(zhuǎn)基因植株B ；C、通過抗生素連續(xù)多代篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植株A純合系和轉(zhuǎn)基因植株B純合系；d、將轉(zhuǎn)基因植株A純合系和轉(zhuǎn)基因植株B純合系雜交，獲得同時含有融合基因片段A和融合基因片段B的轉(zhuǎn)基因植株；或者，a’、根據(jù)目的基因的高級結(jié)構(gòu)或利用接點掃描系統(tǒng)，確定目的基因的可拆分位點， 利用PCR方法將目的基因分成N端和C端兩部分，并分別與intein的N端和C端連接，形成融合基因片段A和融合基因片段B ；b’、分別構(gòu)建融合基因片段A和融合基因片段B的植物表達載體，共同導入受體植物材料，獲得同時含有融合基因片段A和融合基因片段B的轉(zhuǎn)基因植株；C’通過抗生素連續(xù)多代篩選，獲得同時含有融合基因片段A和融合基因片段B的轉(zhuǎn)基因植株純合系；或者，a”、根據(jù)目的基因的高級結(jié)構(gòu)或利用接點掃描系統(tǒng)，確定目的基因的可拆分位點， 利用PCR方法將目的基因分成N端和C端兩部分，并分別與intein的N端和C端連接，形成融合基因片段A和融合基因片段B ；b”構(gòu)建融合基因片段A的核轉(zhuǎn)化用植物表達載體，融合基因片段B的葉綠體轉(zhuǎn)化用植物表達載體，并分別導入受體植物材料的核基因組和葉綠體基因組，獲得轉(zhuǎn)基因植株 A’和轉(zhuǎn)基因植株B’ ；C”以轉(zhuǎn)基因植株B’為母本、轉(zhuǎn)基因植株A’為父本雜交，獲得同時含有融合基因片段A和融合基因片段B的轉(zhuǎn)基因植株；d”、通過抗生素連續(xù)多代篩選，獲得同時含有融合基因片段A和融合基因片段B的轉(zhuǎn)基因植株純合系；所述融合基因片段A的植物表達載體包括抗生素抗性基因、啟動子、目的基因N端序列、Ssp DnaE Intein N端剪接域基因序列和終止子。所述融合基因片段B的植物表達載體包括抗生素抗性基因、啟動子、目的基因C端序列、Ssp DnaE Intein C端剪接域基因序列和終止子。所述融合基因片段A的核轉(zhuǎn)化用植物表達載體包括抗生素抗性基因、啟動子、葉綠體導肽、目的基因N端序列、Ssp DnaE Intein N端剪接域基因序列和終止子。所述融合基因片段B的葉綠體轉(zhuǎn)化用植物表達載體包括抗生素抗性基因、葉綠體轉(zhuǎn)化用啟動子、目的基因C端序列、Ssp DnaE Intein C端剪接域基因序列、終止子和受體材料葉綠體基因同源序列。本發(fā)明的有益效果1、當兩個基因片段都導入到核基因組中時，親本A和親本B的花粉雖仍可隨風傳播，但其花粉中只帶有單個基因片段，即使飄流至其它非轉(zhuǎn)基因作物或近緣種，也不會產(chǎn)生有功能的完整目的蛋白。雜種Fl的花粉雖仍可隨風傳播，但飄流頻率可降低到閾值允許范圍內(nèi)；2、當基因拆分技術(shù)與葉綠體轉(zhuǎn)化相結(jié)合時，由于葉綠體為母系遺傳，親本B不會有基因飄流，親本A和雜種Fl的花粉雖仍可隨風傳布，但其花粉中只帶有基因片段A，即使飄流至其它非轉(zhuǎn)基因作物或近緣種，也不會產(chǎn)生有功能的完整目的蛋白， 因而可從根本上避免轉(zhuǎn)基因作物基因飄流可能帶來的環(huán)境風險。


圖1植物表達載體pG2、pEnln、ρIcEc基因表達盒示意圖；圖中，Rbs P-菊花Rubisco小亞基基因的啟動子、CTS-菊花Rubisco小亞基的葉綠體信號肽、Rbs T-菊花Rubisco小亞基基因的終止子、RB-表達盒右邊界、LB-表達盒左邊界、Enln/IcEc-融合基因片段EnIn或IcEc、nptII-篩選標記基因。圖2轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測；圖中，1 6-轉(zhuǎn) EnIn 基因煙草、7-陰性對照、8-pEnIn 質(zhì)粒、9-Marker、10-pICEC 質(zhì)粒、11-陰性對照、12 17-轉(zhuǎn)pICEC基因煙草。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，實施例中未詳細說明的操作步驟請參照 《分子克隆實驗指南》第三版相應(yīng)部分(J.薩姆布魯克D. W.拉塞爾著，科學出版社)或參閱所用試劑盒的說明書，實施例中所述百分濃度如無特別說明均為質(zhì)量百分濃度。實施例1、基因拆分技術(shù)限控轉(zhuǎn)G2-aroA基因煙草的基因飄流(單獨轉(zhuǎn)化)
1)轉(zhuǎn)基因煙草的獲得根據(jù)G2-aroA基因的可拆分位點F295/T296，利用PCR方法將G2_aroA基因分成N 端和C端兩部分，并分別與Ssp DnaE intein的N端和C端連接，形成融合基因片段EnIn和 IcEc。將融合基因片段EnIn和IcEc分別轉(zhuǎn)入植物表達載體pG2，構(gòu)建成EnIn和IeEe融合基因片段的植物表達載體PEnIn和ρΙ。Ε。。構(gòu)建的植物表達載體基因表達框如圖1所示，外源基因前面帶有Rubisco小亞基的葉綠體導肽，并由Rubisco小亞基啟動子驅(qū)動，3’末端為 Rubisco小亞基的終止子，篩選標記基因為nptll。農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草，獲得單獨含有 EnIn和單獨含有I品的轉(zhuǎn)基因煙草，PCR檢測(圖2)證明基因已整合到煙草基因組中(PCR 引物根據(jù) GeneBank 上公布的 G2-aroA 基因、Ssp DnaE Intein N 端和 Ssp DnaE Intein C 端核苷酸序列設(shè)計，檢測EnIn融合基因片段的引物為R1、Li，其序列如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2所示，檢測IeEe融合基因片段的引物為R2、L2，其序列如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4 所示)。2)轉(zhuǎn)基因煙草拷貝數(shù)分析將單獨含有EnIn基因片段、單獨含有IcEc基因片段的轉(zhuǎn)基因煙草T1代種子經(jīng) NaClO消毒滅菌后，接種到含有100mg/L卡那霉素的MStl培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察幼苗的生長情況，生長正常的幼苗為卡那抗性苗，萌發(fā)后即黃化死亡的幼苗為非卡那抗性苗。20天后統(tǒng)計卡那抗性苗和非卡那抗性苗的數(shù)量。統(tǒng)計數(shù)據(jù)如表1所示。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，含有EnIn 片段的轉(zhuǎn)基因煙草中有4株、含有IcEc片段的轉(zhuǎn)基因煙草中有6株符合3 1的分離比， 推測這些轉(zhuǎn)基因煙草中的基因是以單拷貝的形式插入的(表1)。SYBR Green實時熒光定量PCR的方法是測定外源基因拷貝數(shù)的一種好方法。本研究通過繪制rnr2 (煙草核基因組上已知的單拷貝內(nèi)源基因)和nptll (轉(zhuǎn)基因煙草中含有的篩選標記基因的)的標準曲線，并根據(jù)標準曲線確定了樣品中rnr2和nptll的含量，再利用兩者之間的比例關(guān)系乘以內(nèi)源性rnr2基因的拷貝數(shù)來確定外源基因nptll的整合拷貝數(shù)。通過分析發(fā)現(xiàn)EnIn基因片段(編號為N-33)和IcEc (編號為C-11)基因片段均為單拷貝，與在與在培養(yǎng)基上獲得的結(jié)果相吻合。表1不同類型轉(zhuǎn)基因煙草Tl代種子在含100mg/L卡那霉素培養(yǎng)基上的抗感分離
情況
權(quán)利要求
1.一種利用基因拆分控制轉(zhuǎn)基因飄流的方法，其特征在于，包括如下步驟a、根據(jù)目的基因的高級結(jié)構(gòu)或利用接點掃描系統(tǒng)，確定目的基因的可拆分位點，利用 PCR方法將目的基因分成N端和C端兩部分，并分別與intein的N端和C端連接，形成融合基因片段A和融合基因片段B;b、分別構(gòu)建融合基因片段A和融合基因片段B的植物表達載體，單獨導入受體植物材料，獲得轉(zhuǎn)基因植株A和轉(zhuǎn)基因植株B ；c、通過抗生素連續(xù)多代篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植株A純合系和轉(zhuǎn)基因植株B純合系；d、將轉(zhuǎn)基因植株A純合系和轉(zhuǎn)基因植株B純合系雜交，獲得同時含有融合基因片段A 和融合基因片段B的轉(zhuǎn)基因植株；或者，a’、根據(jù)目的基因的高級結(jié)構(gòu)或利用接點掃描系統(tǒng)，確定目的基因的可拆分位點，利用 PCR方法將目的基因分成N端和C端兩部分，并分別與intein的N端和C端連接，形成融合基因片段A和融合基因片段B;b’、分別構(gòu)建融合基因片段A和融合基因片段B的植物表達載體，共同導入受體植物材料，獲得同時含有融合基因片段A和融合基因片段B的轉(zhuǎn)基因植株；c’通過抗生素連續(xù)多代篩選，獲得同時含有融合基因片段A和融合基因片段B的轉(zhuǎn)基因植株純合系； 或者，a”、根據(jù)目的基因的高級結(jié)構(gòu)或利用接點掃描系統(tǒng)，確定目的基因的可拆分位點，利用 PCR方法將目的基因分成N端和C端兩部分，并分別與intein的N端和C端連接，形成融合基因片段A和融合基因片段B;b”構(gòu)建融合基因片段A的核轉(zhuǎn)化用植物表達載體，融合基因片段B的葉綠體轉(zhuǎn)化用植物表達載體，并分別導入受體植物材料的核基因組和葉綠體基因組，獲得轉(zhuǎn)基因植株A’和轉(zhuǎn)基因植株B’ ；C”以轉(zhuǎn)基因植株B’為母本、轉(zhuǎn)基因植株A’為父本雜交，獲得同時含有融合基因片段A 和融合基因片段B的轉(zhuǎn)基因植株；d”、通過抗生素連續(xù)多代篩選，獲得同時含有融合基因片段A和融合基因片段B的轉(zhuǎn)基因植株純合系；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用基因拆分控制轉(zhuǎn)基因飄流的方法，其特征在于，所述融合基因片段A的植物表達載體包括抗生素抗性基因、啟動子、目的基因N端序列、Ssp DnaE Intein N端剪接域基因序列和終止子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用基因拆分控制轉(zhuǎn)基因飄流的方法，其特征在于，所述融合基因片段B的植物表達載體包括抗生素抗性基因、啟動子、目的基因C端序列、Ssp DnaE Intein C端剪接域基因序列和終止子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用基因拆分控制轉(zhuǎn)基因飄流的方法，其特征在于，所述融合基因片段A的核轉(zhuǎn)化用植物表達載體包括抗生素抗性基因、啟動子、葉綠體導肽、目的基因N端序列、Ssp DnaE Intein N端剪接域基因序列和終止子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用基因拆分控制轉(zhuǎn)基因飄流的方法，其特征在于，所述融合基因片段B的葉綠體轉(zhuǎn)化用植物表達載體包括抗生素抗性基因、葉綠體轉(zhuǎn)化用啟動子、目的基因C端序列、Ssp DnaE Intein C端剪接域基因序列、終止子和受體材料葉綠體基因同源序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于轉(zhuǎn)基因生物安全技術(shù)領(lǐng)域的一種利用基因拆分控制轉(zhuǎn)基因飄流的方法。該方法將完整的目的基因拆分成N端和C端兩部分，分別與Intein的N端和C端剪接域的基因序列連接，形成融合基因A和融合基因B，將融合基因A和融合基因B通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和雜交技術(shù)手段，導入受體植物核基因組或者將融合基因A導入核基因組而融合基因B導入葉綠體基因組獲得基因拆分的轉(zhuǎn)基因植物，兩個融合基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)表達后，通過Intein的蛋白剪接功能，將兩個無活性的蛋白片段在葉綠體或核基因組中重新組裝成有活性的完整蛋白。本發(fā)明的方法能降低基因漂流所帶來的環(huán)境風險。
文檔編號C12N15/82GK102220356SQ201110084398
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者唐巧玲, 王志興, 王旭靜 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所