專利名稱：一種高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物催化領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，簡稱cAMP)是細胞內(nèi)的第二信使，對糖代謝、脂肪代謝、核酸合成、蛋白質(zhì)合成等發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，具有多種生理功能，在臨床上和畜禽業(yè)中有廣泛應(yīng)用。cAMP的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法三種。 目前國內(nèi)外產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)全部采用化學(xué)合成法，以AMP為原料，但生產(chǎn)成本偏高，并造成環(huán)境污染。利用液化短桿菌、小桿菌、棒狀桿菌、節(jié)桿菌等以發(fā)酵法制備cAMP有一定的研究，但面臨重復(fù)性差、產(chǎn)量不穩(wěn)定等問題；直接采用腺苷酸環(huán)化酶酶催化生產(chǎn)cAMP雖然具有可行性，但存在許多限制，如腺苷酸環(huán)化酶含量低、純化困難、穩(wěn)定性差。全細胞催化能避免酶的分離和提純等操作，易于大規(guī)模生產(chǎn)，且由于酶在天然的細胞環(huán)境中，可減少環(huán)境因素對酶的影響，有利于保持酶的穩(wěn)定性；而大腸桿菌培養(yǎng)條件簡單、周期短、背景清晰；因此，利用基因工程手段，克隆高活性的腺苷酸環(huán)化酶基因，構(gòu)建高效表達腺苷酸環(huán)化酶的大腸桿菌工程菌株，以三磷酸腺苷(簡稱ATP)為原料全細胞催化生產(chǎn)cAMP，是一條簡單、快速、高效的途徑。此途徑反應(yīng)體系簡單、條件溫和、周期短、副產(chǎn)物少，而且清潔無污染，能實現(xiàn)cAMP生產(chǎn)過程的節(jié)能、降耗、減排，在低成本、高產(chǎn)率的前提下，同時也符合對環(huán)境友好的要求，具有良好的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述重組大腸桿菌的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為CGMCC No. 4706。該菌株已于2011年3月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。其中，所述的高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌是由來源于節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)CGMCC No. 3584的腺苷酸環(huán)化酶基因構(gòu)建到大腸桿菌中得到，所述的腺苷酸環(huán)化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。上述高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌在生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷中的應(yīng)用。具體來說，是將重組大腸桿菌利用全細胞催化法合成環(huán)磷酸腺苷。其中，所述的全細胞催化法為以重組大腸桿菌CGMCC No. 4706為催化劑，以ATP為前體物質(zhì)，加入金屬離子，利用表面活性劑增加細胞膜的通透性，全細胞催化生產(chǎn)cAMP。其中，所述的重組大腸桿菌CGMCC No. 4706的使用量為按濕菌體10_300g/L，優(yōu)選
310-50g/L。即對于總體積為IL的反應(yīng)液，需加入10-300g濕菌體，優(yōu)選加入10_50g濕菌體。其中，ATP的使用量為l-100g/L，優(yōu)選5_50g/L。其中，所述的金屬離子為鎂離子、錳離子和亞鐵離子中的一種或幾種，優(yōu)選鎂離子。金屬離子的使用量為終濃度2-100mM，優(yōu)選5-100mM。其中，所述的表面活性劑為非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑或陰離子型表面活性劑；優(yōu)選聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)或苯甲基磺酰氟(PMSF)。表面活性劑使用量為0. l_20g/L，優(yōu)選0. Ι-lg/L，即表面活性劑處理生產(chǎn)菌株時，將表面活性劑直接加入反應(yīng)液，對于總體積為IL的反應(yīng)液，加入0. l_20g，優(yōu)選加入0. 1-lg。其中，反應(yīng)在pH7. 5-8. 5的Tris-HCl緩沖液中進行，25_45°C條件下反應(yīng)2_24小時。優(yōu)選在PH7. 5-8. 5的Tris-HCl緩沖液中進行，25_35°C條件下反應(yīng)2_12小時。本發(fā)明針對大腸桿菌腺苷酸環(huán)化酶酶活低的缺陷，從環(huán)磷酸腺苷生產(chǎn)菌株中克隆高活性腺苷酸環(huán)化酶基因，構(gòu)建大量表達腺苷酸環(huán)化酶的重組大腸桿菌菌株，并進行全細胞催化。由于腺苷酸環(huán)化酶能特異性催化ATP生成cAMP，轉(zhuǎn)化率高，且副產(chǎn)物少。而大腸桿菌培養(yǎng)條件簡單、周期短，可大大降低培養(yǎng)成本。采用全細胞催化可以省去酶的分離和提純等操作，并能保持酶在原有生活細胞中所處的狀態(tài)和特定位置，提高其穩(wěn)定性。本發(fā)明的有益效果如下1.從cAMP生產(chǎn)菌株中克隆得到的腺苷酸環(huán)化酶基因，在重組菌全細胞催化過程中表現(xiàn)出良好的催化活性和穩(wěn)定性，對底物ATP的轉(zhuǎn)化率達到90%以上。2.本發(fā)明與酶催化相比，省去了酶的分離純化步驟，操作簡便，利于大規(guī)模生產(chǎn)；酶的穩(wěn)定性更好；底物抑制減弱，產(chǎn)量更高。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 出發(fā)菌株的培養(yǎng)。挑選本實驗室保藏的cAMP生產(chǎn)菌株即節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. A302)單菌落在牛肉膏斜面培養(yǎng)2天。轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖10g/L，蛋白胨IOg/ L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 3g/L)的500mL搖瓶中，于30°C下250rpm搖床培養(yǎng)20 小時。目前該菌株A302已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為 CGMCC No. 3584，保藏日期為2010年1月18日。關(guān)于節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. )A302的詳細信息，還可參見本申請人于2010年6月4日提交的中國發(fā)明專利申請201010191515. 6。實施例2 重組大腸桿菌的構(gòu)建。以上述節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. A302)基因組為模板，PCR擴增帶有酶切位點的腺苷酸環(huán)化酶基因cya，引物的5’端和3’端分別引入NdeI和EcoRI酶切位點(見橫線部分)，引物序列如下上游引物sAC 5，-TTCCATATGATGAACGATGAGGACCAGCA-3，
下游引物asAC 5，-CCGGAATTCTTAGTCCAGCACAAGCCCCT-3，PCR反應(yīng)條件如下94°C變性5min ；按如下參數(shù)循環(huán)30次94°C變性lmin，53°C退火30s，72°C延伸 80s ；最后 72°C延伸 IOmin0凝膠電泳分離純化約IlOObp的PCR產(chǎn)物，進行膠回收。將膠回收產(chǎn)物連接到 PMD18T-simple,構(gòu)建 PMD18T_cya 重組質(zhì)粒。采用 NdeI 和 EcoRI 雙酶切 PMD18T_cya 重組質(zhì)粒和幾種不同的質(zhì)粒(包括pET28a質(zhì)粒、pET15b質(zhì)粒、pET22b質(zhì)粒等)，并連接酶切產(chǎn)物，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒。結(jié)果顯示質(zhì)粒pET28a明顯優(yōu)于其他質(zhì)粒。采用該重組質(zhì)粒pET28a-Cya轉(zhuǎn)化不同的宿主(包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和畢赤酵母等)，結(jié)果顯示大腸桿菌明顯優(yōu)于其他宿主。采用該重組質(zhì)粒pET28a-Cya轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取單菌落，接種到裝有5mLLB 液體培養(yǎng)基的50mL離心管中，37°C，220rpm下培養(yǎng)8-12小時。將獲得的重組質(zhì)粒通過熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，具體操作如下取1 μ L重組質(zhì)粒，加入到100 μ L大腸桿菌Rosetta 感受態(tài)細胞液中，冰上放置30min后，42°C熱擊90s，立即取出放冰上2min，加入900 μ LLB 液體培養(yǎng)基，37°C，220rpm下培養(yǎng)1小時后，取150 μ L培養(yǎng)液涂布含有氯霉素和卡拉霉素的 LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12小時后所得的單菌落即為重組菌。進行誘導(dǎo)表達之后，經(jīng)過篩選得到一株產(chǎn)酶量最高的菌株Rosetta (pET28a-Cya)， 其保藏編號為CGMCC No. 4706。實施例3 重組大腸桿菌的培養(yǎng)。挑取實施例2中篩選出的重組菌大腸桿菌Rosetta (pET28a-Cya)至含50mg/L卡拉霉素和34mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)過夜。按3% (ν/ν)接種量分別接種到至含乳糖的LB液體培養(yǎng)基中，組成(g. Γ1)如下2g葡萄糖，3g乳糖，10gNaCl，15g 蛋白胨，25g酵母膏。37°C，200rpm培養(yǎng)至3h。然后30°C，200rpm，誘導(dǎo)表達12h。8000rpm, 4°C離心lOmin，收集菌泥，_20°C保存?zhèn)溆?。實施? 利用重組大腸桿菌催化生成cAMP。取250mL 三角燒瓶，配制由 30g/L ATP、50mM MgCl2、30g/L 大腸桿菌 CGMCCNo. 4706 和 0. 25g/L Triton X-100 和 0. 05mol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液組成的反應(yīng)液 30mL，待 ATP完全溶解后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8. 0，于35 °C，200rpm攪拌反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后，用 3. 5%三氯乙酸沉淀。采用HPLC對cAMP進行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含有cAMP 15. 5g/L，轉(zhuǎn)化率達到95. 1%。實施例5 利用重組大腸桿菌催化生成cAMP。取250mL三角燒瓶，配制總體積為50mL的如下反應(yīng)液45g/L ATP、2OmMMgCl2、 50g/L 大腸桿菌 CGMCC No. 4706 和 lg/L Triton X-100 和 0. 05mol/L Tris-HCl (pH 8.2)， 待ATP完全溶解后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8. 2，于25°C，200rpm攪拌反應(yīng)。反應(yīng)過程中每隔2h用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.2，反應(yīng)持續(xù)121!。反應(yīng)結(jié)束后，用3. 5%三氯乙酸沉淀。采用 HPLC對cAMP進行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含有cAMP 22. 8g/L，轉(zhuǎn)化率達到93. 1 %。實施例6 利用重組大腸桿菌催化生成cAMP。取250mL三角燒瓶，配制總體積為20mL的如下反應(yīng)液5g/L ATP、5mMMgCl2、10g/L 大腸桿菌 CGMCC No. 4706 和 0. lg/L PMSF 和 0. 05mol/L Tris-HCl (pH7. 5)，待 ATP 完全溶解后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 5，于40°C，200rpm攪拌反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，用3. 5%三氯乙酸沉淀。采用HPLC對cAMP進行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含有cAMP 2. 6g/L，轉(zhuǎn)化率達到95. 6%.實施例7 利用重組大腸桿菌催化生成cAMP。取250mL三角燒瓶，配制總體積為30mL的如下反應(yīng)液25g/L ATP、IOOmMMgCl2、 40g/L大腸桿菌CGMCC No. 4706和 0. 5g/L Triton X-100和 0. 05mol/L Tris-HCl (pH 7.8)， 待ATP完全溶解后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 8，于30°C，200rpm攪拌反應(yīng)。反應(yīng)4h后，添加25g/LATP，待ATP完全溶解后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 8，于30°C，200rpm繼續(xù)攪拌反應(yīng) 6h。待總時長為IOh的反應(yīng)完全結(jié)束后，用3. 5%三氯乙酸沉淀。采用HPLC對cAMP進行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含有cAMP24. 5g/L，轉(zhuǎn)化率達到90. 1%。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為 CGMCC No. 4706。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌，其特征在于它是由來源于節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)CGMCC No. 3584的腺苷酸環(huán)化酶基因構(gòu)建到大腸桿菌中得到， 所述的腺苷酸環(huán)化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
3.權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌在生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，將重組大腸桿菌利用全細胞催化法合成環(huán)磷酸腺苷。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的全細胞催化法為以重組大腸桿菌 CGMCC No. 4706為催化劑，以ATP為前體物質(zhì)，加入金屬離子，利用表面活性劑增加細胞膜的通透性，全細胞催化生產(chǎn)cAMP。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的重組大腸桿菌CGMCCNo. 4706的使用量為按濕菌體10-300g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，ATP的使用量為l-100g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的金屬離子為鎂離子、錳離子和亞鐵離子中的一種或幾種；金屬離子的使用量為終濃度2-100mM。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的表面活性劑為非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑或陰離子型表面活性劑；表面活性劑使用量為0. l-20g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，反應(yīng)在pH7.5-8. 5的Tris-HCl緩沖液中進行，25-45°C條件下反應(yīng)2-24小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為CGMCC No.4706。本發(fā)明還公開了上述高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的重組大腸桿菌在生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷中的應(yīng)用。本發(fā)明從cAMP生產(chǎn)菌株中克隆得到的腺苷酸環(huán)化酶基因，在重組菌全細胞催化過程中表現(xiàn)出良好的催化活性和穩(wěn)定性，對底物ATP的轉(zhuǎn)化率達到90％以上，反應(yīng)體系簡單、條件溫和、周期短、副產(chǎn)物少，而且清潔無污染，是一條簡單、快速、高效的生產(chǎn)途徑。
文檔編號C12R1/19GK102433292SQ20111042737
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者何穎, 吳菁嵐, 應(yīng)漢杰, 柏建新, 謝婧婧, 陳勇, 陳曉春 申請人:南京工業(yè)大學(xué)