專利名稱：多重pcr-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明建立了一種建立在多重PCR基礎(chǔ)上的對結(jié)核分枝桿菌進行耐利福平 (RIF)、異煙胼(INH)和乙胺丁醇(EMB)藥物的耐藥性快速檢測的反向系列探針雜交方法， 能夠通過檢測與RIF、EMB和INH耐藥相關(guān)的rpo召、h抓、inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)和embB基因堿基突變來判定菌株的藥物敏感性，并同時可對結(jié)核分枝桿菌復合群進行菌種鑒定。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是嚴重危及全球人類健康的公共衛(wèi)生問題，自上個世紀五十年代以來，不斷發(fā)現(xiàn)有效的抗結(jié)核藥物如利福平、異煙胼、乙胺丁醇、鏈霉素等，使結(jié)核病的流行得到了一定的控制，但由于不少國家對結(jié)核病的忽視，減少了財政投入、再加上人口的增長、流動人口的增加、艾滋病毒感染的傳播，特別是耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)和傳播，使結(jié)核病流行下降緩慢，有的國家和地區(qū)還有所回升甚至加劇。中國結(jié)核病患者是世界上最多的國家之一，僅次于印度，位居世界第二，控制結(jié)核病的難點在于控制和治療耐藥特別是耐多藥結(jié)核病[World Health Organisation, Global tuberculosis control: surveillance, planning and financing, 2007. WH0/HTM/TB/2007. 376.]。減少治療的盲目性的最好辦法是基于病人結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性而進行治療?；诩毦囵B(yǎng)基礎(chǔ)上的傳統(tǒng)藥敏實驗法是結(jié)核桿菌耐藥性檢測的黃金方法，結(jié)果最可靠，因為該方法直接反映細菌的藥物敏感性情況，可以觀察菌落形態(tài)和生長情況。但是由于結(jié)核桿菌屬于生長緩慢細菌，傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷和藥敏檢測，從培養(yǎng)出菌落到藥敏試驗至少需要6到8周的時間，遠遠不能滿足臨床治療的需要，容易導致耐藥菌的產(chǎn)生和傳播。BACTEC960液體培養(yǎng)基法也是基于培養(yǎng)的藥敏實驗方法，是表型檢測法的一個革新，雖然縮短了試驗的時間，但跟傳統(tǒng)的藥敏試驗相比，BACTEC960液體培養(yǎng)基法無法看到菌落生長情況，而且需要依賴進口昂貴的儀器和試劑，無法在病例多的發(fā)展中國家大規(guī)模推廣， 所以，從分子診斷入手，尋找新型的結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測技術(shù)，成為結(jié)核桿菌研究的熱點。隨著結(jié)核桿菌產(chǎn)生耐藥的一些分子機制逐漸被揭示，使得建立分子診斷手段成為可能。研究表明，大約95%的結(jié)核分枝桿菌對RFP耐藥與RNA聚合酶β -亞單位編碼基因 (rpoB)的對應大腸桿菌507到533密碼子的81-bp突變熱點區(qū)的突變有關(guān)[Afanas'ev MV, Ikryannikova LN, J Antim Chemo, 2007, 59: 1057-1064.]。而耐 INH 的產(chǎn)生涉及到更多的基因。研究表明INH耐藥與如抓，i/7似調(diào)節(jié)區(qū)，或i/^等基因突變有關(guān)。一些證據(jù)顯示EMB通過直接抑制_似SC編碼的阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶阻止阿拉伯半乳聚糖合成，起到抑制細菌生長的效應[Zhang, SL, Qi H, Qiu DL, Li DX, Zhang J, Du CM, Wang GB, Yang ZR, Sun Q. Biochem Genet. 2007. 45: 281—290·]。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機制，目前已經(jīng)建立了多種用于結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因的分子檢測方法，如DNA直接測序法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP) [ Lee H, Cho SN, Bang HE, Lee JH, Bae GH, Kim SJ, Kim JD, Int J Tuberc Lung Dis. 1998，2(7) :585-589.]、線條探針雜交 DNA 微陣列[Suresh N, Singh UB, Arora J, Pande JN, Seth P, Samantaray JC, Diagnosti Micro Infec Dis, 2006, 56 133-140.],實時定 fi PCR[Torres MJ, Criado A, Palomares JC, Aznar J, J Clin Microbiol, 2000, 38, 3194-3199.]、基因芯片法和溫度介導的異源多態(tài)性分析等技術(shù)。DNA測序，實時定量PCR和基因芯片法等技術(shù)雖然結(jié)果準確、可靠，但都需要較為昂貴的專門儀器和試劑，無法在病例多的發(fā)展中國家大規(guī)模推廣應用；單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析不需要昂貴的儀器，僅僅對PCR產(chǎn)物進行變性和聚丙烯酰胺凝膠電泳，但不能確定耐藥基因突變的部位和性質(zhì)，無法區(qū)分錯義突變和同義突變，并且試驗的可靠性和重復性不強?；赑CR和反向斑點雜交技術(shù)的反向系列探針雜交技術(shù)由于簡便、直接、廉價、快速，并且在一次試驗中可以提供多藥藥物耐受信息，在各種分子診斷方法中脫穎而出，是目前看來最有發(fā)展前景的結(jié)核分枝桿菌耐藥分子檢測手段，目前已成功應用于耐藥基因的快速檢測Bhang SL, Shen JG, Xu PH, Sun Q, Yang ZQ, et al, JAppl Microbiol, 2007, 103(4) 1262-1271.]。此探針陣列可以在一次雜交實驗中同時得到多種基因或位點的突變信息，大大降低了試驗的時間和成本。但國外開發(fā)的一些試劑盒價格依然昂貴，且只能用于基因的突變熱點區(qū)檢測，不能同時檢測結(jié)核分枝桿菌耐INH和EMB的耐藥基因的突變情況[Hillemann D, Weizenegger M, Kubica T, Richter E, Niemann S, J Clin Microbiol. 2005, 43: 3699-3703·]。目前尚未發(fā)現(xiàn)有能夠同時檢測結(jié)核分枝桿菌對RFP、INH和EMB三種藥的耐藥性的技術(shù)在實際中予以應用或者報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于分子生物學的耐藥結(jié)核病的快速檢測方法，特別是一種基于多重PCR的反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，建立一種建立在多重PCR基礎(chǔ)上的對結(jié)核分枝桿菌進行耐利福平(RIF)、異煙胼(INH)和乙胺丁醇(EMB) 藥物的耐藥性快速檢測的反向系列探針雜交方法，能夠通過檢測與RIF、EMB和INH耐藥相關(guān)的rPoB、katG、inM基因調(diào)節(jié)區(qū)和embB基因堿基突變來判定菌株的藥物敏感性，并同時可對結(jié)核分枝桿菌復合群進行菌種(MTC)鑒定，其中包含了 PCR擴增引物序列、雜交探針序列。本發(fā)明的解決方案是基于PCR技術(shù)和反向探針雜交技術(shù)。本發(fā)明的具體內(nèi)容如下
一種多重PCR-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，即是一種基于多重PCR的反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于
A、多重PCR的反應在一個管中完成，且一次性PCR擴增至少四個待檢測DNA片段；
B、反向斑點雜交中所述的低密度探針陣列至少包括19條能夠同時檢測與
RFP、EMB和INH耐藥相關(guān)的rpo凡katG, inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)和embB基因突變熱點區(qū)的堿基突變以及對結(jié)核桿菌復合群進行菌種鑒別診斷的探針；
C、所述的帶有羧基而呈負電的雜交膜，與氨基標記的寡核苷酸探針共價結(jié)合，形成橋式結(jié)構(gòu)；
D、多重PCR中的引物采用鏈霉親和素一堿性磷酸酶結(jié)合的生物素進行標記，通過催化底物BCIP/NBT反應形成有顏色的物質(zhì)來判定雜交的陽性和陰性，反映PCR產(chǎn)物與探針有無突變。本發(fā)明所述多重PCR中的多條引物的Tm值相差< 3°C，擴增產(chǎn)物片段大小相差 50-77堿基對。本發(fā)明所述探針為8條寡核苷酸探針和1條MTC群特異性探針，所述探針長度為 20士3個堿基；將盡可能錯配的堿基位點(突變位點)設(shè)置在探針中部；各探針的Tm值盡量相近，相差應<3°C。本發(fā)明所述的多重寡核苷酸探針陣列的構(gòu)成方法如下用0. 5mol/L Na2CO3/ NaHCO3緩沖液(pH 8.4)溶解探針，稀釋濃度為20 μ M，充分混勻后，冰箱保存?zhèn)溆?。?Biodyne C尼龍膜剪成一定大小，并用鉛筆劃定區(qū)域。先應用16%乙基二甲氨基丙基碳二亞胺(EDAC)浸泡處理尼龍膜IOmin以活化尼龍膜(該溶液可以重復使用)，然后用蒸餾水清洗，晾干。應用微量加樣器點2μ1探針溶液于Biodyne C尼龍膜相應位置上，反應15min， 使氨基標記的探針與尼龍膜的羧基共價結(jié)合；再用0. lmol/L NaOH處理lOmin，蒸餾水清洗，晾干后備用。膜片上各探針的排列見圖2。尼龍膜的左邊一般點野生型探針，右邊點相應位點的突變型探針。本發(fā)明所述的多重PCR擴增是指在1個擴增體系中擴增抓、i/ 似基因調(diào)節(jié)區(qū)和enibB基因4種片段，使一次PCR反應產(chǎn)生四個耐藥基因片段。每個反應體系取細菌基因組DNA 1μ 1 (約20ng)，于50 μ 1反應體系(50 μ L反應反應體系中含有0. 2mmol/ L dNTPs, DNA 模板 100 ng,引物 0. 2mmol/L, Taq 酶 1. 5U, 1/10 體積的 10XPCR 緩沖液， 1. 5mmol/L MgCl2)。擴增程序95°C，5 min ； 95 "C, 1 min，56 °C，1 min，和 72 °C，1 min, 共40個循環(huán)；最后在72°C下10 min延伸。本發(fā)明所述反向斑點雜交的方法如下取生物素標記的PCR擴增產(chǎn)物40 μ L加入 IX SSPE 200yL于0. 5mL的EP管中，95°C 15 min進行變性后，迅速放入冰中防止PCR產(chǎn)物復性，然后取經(jīng)變性的PCR產(chǎn)物，加入預先放置好并預熱尼龍膜片和3mL雜交液(5 X SSPE ；0.5% SDQ離心管，57°C雜交30 min。取出膜條，移至裝有洗液(1 X SSPE ；0. 5% SDS) 并且已經(jīng)經(jīng)57°C預熱的離心管，57°C每次15min洗滌兩次。其余操作過程在室溫下進行 3mL連接液(內(nèi)含鏈霉親和素一堿性磷酸酶)中孵育15min，然后用洗液室溫洗滌2次，每次10 min。再用底物緩沖液(PBS)洗滌一次，然后加入3mL底物反應液BCIP /NBT，室溫下輕搖30 min，將膜片用水洗滌，干燥，即可見藍色斑點顯現(xiàn)。本發(fā)明所述的多重PCR的反應在一個管中完成，且一次性PCR擴增為四個待檢測 DNA片段。本發(fā)明所述的反向斑點雜交中所述的低密度探針陣列包括19條能夠同時檢測與 RIF、EMB和INH耐藥相關(guān)的r/7o隊katG, inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)和基因突變熱點區(qū)的堿基突變以及對結(jié)核桿菌復合群進行菌種鑒別診斷的探針。本發(fā)明把多重PCR和反向雜交結(jié)合起來，一次性PCR擴增四個待檢測DNA片段， 通過設(shè)計一個新型的低密度探針陣列，應用于結(jié)核桿菌的快速耐藥檢測，這樣可以一次試驗中檢測多個耐藥基因的突變情況。本發(fā)明所有雜交膜為Biodyne C型尼龍膜，由美國 Pall BioSupport公司生產(chǎn)，該尼龍膜因帶有羧基而呈負電，可與氨基標記的寡核苷酸探針共價結(jié)合，形成橋式結(jié)構(gòu)，可以大大提高雜交率。而引物用生物素進行標記，可以用鏈霉親和素一堿性磷酸酶結(jié)合，通過催化底物BCIP/NBT反應形成有顏色的物質(zhì)來判定雜交的陽性和陰性，進而反映PCR產(chǎn)物與探針有無突變。本發(fā)明基于PCR和反 向斑點雜交技術(shù)的反向系列探針雜交技術(shù)，具有簡便、直接、 廉價、快速的特點，能在一次試驗中可以提供多藥藥物耐受信息，特別是能夠同時檢測結(jié)核分枝桿菌對RIF、INH和EMB三種藥的耐藥性，降低了試驗的時間和成本，結(jié)果準確、可靠，且無需昂貴的專門儀器和試劑，有利于大規(guī)模推廣應用。本發(fā)明所述材料與方法包括下列內(nèi)容 1.引物和寡核苷酸探針的設(shè)計與制備
從GenBank搜索結(jié)核桿菌r/7M，hiGi/ 似基因調(diào)節(jié)區(qū)和embB基因，并且確定上述耐藥基因突變熱點區(qū)，根據(jù)其旁邊的保守區(qū)域分別應用I^rimer Premier 5.0和Oligo 6.0 軟件設(shè)計四對特異性引物，為了可以進行多重PCR，四條引物的Tm值相近，擴增產(chǎn)物片段大小相差50-77堿基對以利于電泳分離(表1)，反向引物均應用生物素標記。根據(jù)耐藥基因突變熱點，應用I^rimer Premier 5. 0等生物軟件共設(shè)計18條寡核苷酸探針。此外，根據(jù)rpoB序列設(shè)計1條MTC群特異性探針。探針設(shè)計原則是探針長度為20堿基左右；將盡可能錯配的堿基位點(突變位點)設(shè)置在探針中部；各探針的Tm值盡量相近，相差3°C左右。各探針具體信息表2所示。所有探針5’端進行氨基修飾。引物和探針均由hvitrogen上海公司合成。表1 PCR擴增耐藥基因rpoB, katG, inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)和embB基因的引物
權(quán)利要求
1.一種多重PCR-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于A、多重PCR的反應在一個管中完成，且一次性PCR擴增至少四個待檢測DNA片段；B、反向斑點雜交中所述的低密度探針陣列至少包括19條能夠同時檢測與RIF、EMB和 INH耐藥相關(guān)的凡如抓，//7似基因調(diào)節(jié)區(qū)和embB基因突變熱點區(qū)的堿基突變以及對結(jié)核桿菌復合群進行菌種鑒別診斷的探針；C、所述的帶有羧基而呈負電的雜交膜，與氨基標記的寡核苷酸探針共價結(jié)合，形成橋式結(jié)構(gòu)；D、多重PCR中的引物采用鏈霉親和素一堿性磷酸酶結(jié)合的生物素進行標記，通過催化底物BCIP/NBT反應形成有顏色的物質(zhì)來判定雜交的陽性和陰性，反映PCR產(chǎn)物與探針有無突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于所述多重PCR中的多條引物的Tm值相差< 3°C，擴增產(chǎn)物片段大小相差50-77堿基對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于所述探針為18條寡核苷酸探針和1條MTC群特異性探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多重PCR的反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于所述探針長度為20士3個堿基；將盡可能錯配的堿基位點即突變位點設(shè)置在探針中部；各探針的Tm值盡量相近，相差應< 3°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于所述的多重寡核苷酸探針陣列的構(gòu)成方法如下用0. 5mol/L Na2C03/NaHC0dl沖液溶解探針，稀釋濃度為20 μ M，充分混勻后，冰箱保存?zhèn)溆?，緩沖液的PH為8. 4;把Biodyne C尼龍膜剪成一定大小，并用鉛筆劃定區(qū)域；先應用16%乙基二甲氨基丙基碳二亞胺浸泡處理尼龍膜IOmin以活化尼龍膜，然后用蒸餾水清洗，晾干；應用微量加樣器點2 μ L探針溶液于Biodyne C尼龍膜相應位置上，反應15min，使氨基標記的探針與尼龍膜的羧基共價結(jié)合；再用0. lmol/L NaoH處理lOmin，蒸餾水清洗，晾干后備用；尼龍膜的左邊一般點野生型探針，右邊點相應位點的突變型探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于每個反應體系取細菌基因組DNA 1 yL于50 μ L反應體系；50 μ L反應反應體系中含有 0. 2mmol/L dNTPs，DNA 模板 100 ng，引物 0. 2 mmol/L，7 《酶 1. 5U，1/10 體積的 10XPCR 緩沖液，1. 5mmol/L MgCl2 ；擴增程序95 "C, 5 min ；95 °C，1 min，56 °C，1 min，和 72°C，1 min，共 40 個循環(huán)；最后在72°C下10 min延伸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于所述反向斑點雜交的方法如下取生物素標記的PCR擴增產(chǎn)物40 μ L加入IX SSPE 200 μ L于0. 5mL的EP管中，95°C·15 min進行變性后，迅速放入冰中防止PCR產(chǎn)物復性，然后取經(jīng)變性的PCR產(chǎn)物，加入預先放置好并預熱尼龍膜片和:3ml雜交液離心管，57°C雜交30 min；取出膜條，移至裝有洗液并且已經(jīng)經(jīng)57°C預熱的離心管，57°C每次15 min洗滌兩次；其余操作過程在室溫下進行3mL連接液中孵育15min，然后用洗液室溫洗滌2次，每次 10 min ；再用底物緩沖液洗滌一次，然后加入3mL底物反應液BCIP /NBT，室溫下輕搖30 min, 將膜片用水洗滌，干燥，即可見藍色斑點顯現(xiàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于所述的多重PCR的反應在一個管中完成，且一次性PCR擴增為四個待檢測DNA片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于所述的反向斑點雜交中所述的低密度探針陣列包括19條能夠同時檢測與RIF、EMB和INH耐藥相關(guān)的rpo凡katG, inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)和embB基因突變熱點區(qū)的堿基突變以及對結(jié)核桿菌復合群進行菌種鑒別診斷的探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種多重PCR-反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，即是一種基于多重PCR的反向斑點雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，包括了引物的設(shè)計、探針的設(shè)計、雜交試驗、結(jié)果判定，能夠同時檢測結(jié)核分枝桿菌對RIF、INH和EMB三種藥的耐藥性，大大縮短了檢測的時間，結(jié)果可靠。
文檔編號C12Q1/04GK102312001SQ20111027135
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者孫群, 張舒林, 楊志榮, 湯科, 羅濤, 趙于丁, 郭建華 申請人:四川大學