專利名稱：一種新的豬繁殖與呼吸綜合征病毒orf5修飾基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP5蛋白(又稱E蛋白)是由0RF5編碼的囊膜蛋白，是病毒的一個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白。E蛋白是一種跨膜糖蛋白，位于病毒粒子的包膜上，是重要的保護(hù)性抗原蛋白，但不能產(chǎn)生較強(qiáng)的中和抗體，GP5基因免疫保護(hù)效率也不理想，其可能的主要原因是(1)GP5蛋白中存在中和表位和非中和表位，非中和表位對(duì)中和表位有干擾作用；0)GP5蛋白上的糖基化位點(diǎn)也能使病毒發(fā)生免疫逃避，從而使產(chǎn)生的抗體水平降低；C3)基因在豬體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)效率比較低，抗原遞呈作用比較弱，因此，為了提高基因疫苗免疫效力，有必要對(duì)這3個(gè)方面進(jìn)行綜合考慮，設(shè)計(jì)出新的抗原分子。鼠寒沙門(mén)氏菌屬于腸桿菌科，是一組胞內(nèi)侵襲性致病菌，故能有效遞呈抗原，激發(fā)抗沙門(mén)氏菌和誘導(dǎo)外源蛋白的特異性體液免疫反應(yīng)與細(xì)胞免疫反應(yīng)，并能同時(shí)誘導(dǎo)黏膜免疫與全身免疫。近年來(lái)減毒沙門(mén)氏菌作為DNA疫苗載體的研究越來(lái)越多，通過(guò)黏膜自然感染途徑運(yùn)送DNA疫苗，是一種很有前途的方法，有報(bào)道用該菌攜帶PRRSV GP5-M基因可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生PRRSV特異性免疫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供新的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因。本發(fā)明的另一目的是提供含有該修飾基因的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的又一目的是提供攜帶該重組質(zhì)粒的減毒鼠寒沙門(mén)氏菌SL-pCI-SynGP5/ GP4-5。本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因，序列如SEQ IDN0. 2、SEQ IDN0. 3、SEQ IDN0. 4 或 SEQ IDN0. 5 所示。含有所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因的重組質(zhì)粒。所述的重組質(zhì)粒優(yōu)選將所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因插入真核表達(dá)載體PCI的)(ho I和)(ba I酶切位點(diǎn)間。所述的重組質(zhì)粒進(jìn)一步優(yōu)選將SEQ IDN0. 3所示的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5 修飾基因插入真核表達(dá)載體pCI的Bio I和)(ba I酶切位點(diǎn)間。含有所述的重組質(zhì)粒的減毒沙門(mén)氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5。本發(fā)明所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因的重組質(zhì)粒在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的減毒沙門(mén)氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP5蛋白在豬體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)效率比較低，抗原遞呈作用比較弱，不能產(chǎn)生較強(qiáng)的中和抗體，免疫保護(hù)效率不理想的缺陷，通過(guò)對(duì)高致病性PRRSV SY0608毒株0RF5基因進(jìn)行了 3個(gè)方面的修飾和改造，設(shè)計(jì)出新的抗原分子編碼基因，主要包括(1)根據(jù)哺乳動(dòng)物偏嗜性，對(duì)天然的GP5基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，改成哺乳動(dòng)物偏嗜的密碼子；( 突變糖基化位點(diǎn)，將第30、34、35和51位的氨基酸N(天冬氨酸)改變成A(丙氨酸)；(3)利用最新發(fā)現(xiàn)的PRRSV GP4和N蛋白上的T細(xì)胞表位，分別插入至GP5蛋白非中和抗原表位和中和表位中間，并構(gòu)建含有該修飾基因的重組質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)效率顯著高于原始基因。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的體液免疫應(yīng)答、淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答以及Thl和Th2型細(xì)胞因子應(yīng)答。將篩選得到的體液免疫應(yīng)答、淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答以及Thl和Th2型細(xì)胞因子應(yīng)答水平最高的修飾基因重組質(zhì)粒pCI-SynGP5/GP4-5轉(zhuǎn)化至減毒鼠寒沙門(mén)氏菌，獲得重組沙門(mén)氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5，分別進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn)和仔豬攻毒保護(hù)免疫試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其較之重組質(zhì)粒pCI-SynGP5/GP4-5能夠誘導(dǎo)較高水平的抗體應(yīng)答；誘導(dǎo)較高水平的干擾素；病毒血癥水平低；攻毒后組織器官的損傷比較輕微，生物安全水平高。以上結(jié)果證明本發(fā)明所構(gòu)建的減毒沙門(mén)氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5在豬體實(shí)驗(yàn)中有良好的免疫效果，在藍(lán)耳病的防制方面有開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景，可在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中應(yīng)用。


圖1GP5基因的擴(kuò)增，1 為 Marker，2 為 GP5 基因。圖 2 酶切得到的基因 SynGP5、SynGP5/GP4_5 和 SynGP5/N_7，IMarker, 2、3、4 分別為 SynGP5、SynGP5/GP4_5 和 SynGP5/N_7。圖 3SynGP5/GP4_3 基因的擴(kuò)增，a、基因 SynGP5-GP4_3 的擴(kuò)增；b、基因 GP4_3_SynGP5 的擴(kuò)增；C、基因 SynGP5/ GP4-3 的擴(kuò)增；其中，1、3、5 為 Marker，2、4、6 分別為 SynGP5-GP4-3、GP4-3_SynGP5、SynGP5/ GP4-3。圖4重組真核質(zhì)粒的雙酶切鑒定，其中，1:lkb DNALadder ；2 =DNALadder DL2000 ；3 :Xho I 和 Xba I 雙酶切的 pCI-neo載體；4 =Xho I和Xba I雙酶切的pCI_GP5重組質(zhì)粒；5 =Xho I和Xba I雙酶切的 pCI-SynGP5重組質(zhì)粒；6 :Xho I和Xba I雙酶切的pCI_SynGP5/GP4_5重組質(zhì)粒；7 :Xho I和 Xba I 雙酶切的 pCI-SynGP5/N-7 重組質(zhì)粒；8 :Xho I 和 Xba I 雙酶切的 pCI_SynGP5/GP4_3
重組質(zhì)粒。圖5Western blot鑒定蛋白的表達(dá)，其中，1 :pCI-neo載體轉(zhuǎn)染HEK193A的細(xì)胞裂解產(chǎn)物；2 :pCI_GP5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK193A的細(xì)胞裂解產(chǎn)物；3 :PCI-SynGP5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK193A的細(xì)胞裂解產(chǎn)物；4 pCI-SynGP5/GP4-5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK493A的細(xì)胞裂解產(chǎn)物；5 :pCI-SynGP5/N_7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK193A的細(xì)胞裂解產(chǎn)物；6 :PCI-SynGP5/GP4-3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK193A的細(xì)胞裂解產(chǎn)物。圖6重組真核質(zhì)粒誘導(dǎo)抗體應(yīng)答；其中，a =ELISA抗體應(yīng)答；b 中和抗體應(yīng)答。圖7重組真核質(zhì)粒免疫鼠誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答。圖8重組真核質(zhì)粒免疫鼠脾細(xì)胞體外誘導(dǎo)的細(xì)胞因子應(yīng)答，其中，a:IFN_ γ ;b :IL_4。圖9重組沙門(mén)氏菌質(zhì)粒的雙酶切鑒定，其中，1=DNALadder DL2000 ；2 :Xho I 和 Xba I 雙酶切的 pCI-SynGP5/GP4_5。圖10免疫豬外周血淋巴細(xì)胞體外誘導(dǎo)的細(xì)胞因子檢測(cè)。圖11攻毒后各免疫組及對(duì)照組的平均體溫變化。圖12攻毒后各組的病毒血癥檢測(cè)。圖13攻毒后各組的肺臟組織病理學(xué)觀察。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因修飾及其真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定1. 1引物設(shè)計(jì)根據(jù)PRRSV SY0608毒株GP5基因序列(GenBank: :EU144079. 1)設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物SY GP5. 1和SY GP5. 2，以pShuttle_GP5質(zhì)粒(李玉峰，姜平，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白重組腺病毒的構(gòu)建與免疫原性測(cè)定[J].中國(guó)病毒學(xué)，2006，2K4) 364-367)為模板，擴(kuò)增GP5基因。上游引物SY GP5. 1 5，-ATTCTCGAGATGTTGGGGAAGTGC-3，(SEQ ID NO. 6)，下游引物SY GP5. 2 5，-CGATCTAGACTAGAGACGACCCCATT-3，(SEQ ID NO. 7)，分別在上、下游引物的5’端引入限制性酶切位點(diǎn)Biol、XbaI,以上引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。1. 2PCR擴(kuò)增GP5目的基因片段取模板pShuttle_GP5 質(zhì)粒 0. 5 μ L，力卩入 PCR 混合液 24. 5 μ U2. 5 μ L 10Xbuffer、2y LdNTP(2. 5mM)、1· 5μ LMg2+(25mM)、兩條引物(SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7) 各lyU20pM)、0. 2yL Taq酶(2. 5U)、滅菌雙蒸水16. 3 μ L)。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94 °C預(yù)變性IOmin ；94°C變性45s ；58°C退火30s ；72°C延伸30s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸 IOmin0 瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物(結(jié)果見(jiàn)圖1)?；厥誔CR產(chǎn)物，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 3修飾的0RF5基因的獲得人工合成了 3條修飾的0RF5基因第一條是SynGP5，在天然的GP5基因(SEQ ID NO. 1)的基礎(chǔ)上按哺乳動(dòng)物偏嗜，又修改了糖基化位點(diǎn)，即第30、34、35和51位的氨基酸將N改變成A所得，序列如SEQ ID N0. 2所示；第二條是SynGP5/GP4_5，在SynGP5的基礎(chǔ)上，第32、33個(gè)氨基酸間再插入GP4-5(氨基酸序列CLFAILLAI ；核苷酸序列TGTCTTTT TGCCATCCTACTGGCAATT (SEQ ID NO. 8))所得，序列如 SEQ ID NO. 3 所示；第三條是 SynGP5/ N-7，在SynGP5的基礎(chǔ)上，第32、33個(gè)氨基酸間插入N_7 (氨基酸序列VRHHFTPSE ；核苷酸序歹Ij :GTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAG(SEQ ID NO. 9))所得，序列如 SEQ ID NO. 4 所示。合成時(shí)，在目的基因的兩端加入了》ιο I和)(ba I的酶切位點(diǎn)，通過(guò)Β ο I和)(ba I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，把該基因片段克隆入真核表達(dá)載體中，獲得的的質(zhì)粒分別命名為pTG19T-SynGP5、 pTG19T-SynGP5/GP4-5 和 pTG19T_SynGP5/N_7，通過(guò)雙酶切的方式獲得基因 SynGP5、 SynGP5/GP4-5 和 SynGP5/N_7，結(jié)果見(jiàn)圖 2。1. 4 重疊 PCR 擴(kuò)增 SynGP5/GP4_3以SynGP5/N_7為模板，用以下引物將N_7突變?yōu)镚P4-3 (氨基酸序列 LLVGFKCFV ；堿基序列CTCTTGGTTGGTTTTAAATGTTTCGTG (SEQ ID NO. 10))，擴(kuò)增 SynGP5/ GP4-3，具體方法為首先以 SynGP5/N-7 為模板用引物 SynGP5/GP4_3. 1 :5’ -ATTCTCGAG ATGTTGGGCAAGTG-3，(SEQ ID NO.11)和 SynGP5/GP4_3. 2 :5，-CACGAAGCACTTGAAGCCCAC CAACAGGCTGGCGGCGGCCAG-3，(SEQ ID NO. 12)擴(kuò)增得到 SynGP5_GP4_3 ；再以 Syn GP5/N-7 為模板，用弓丨物 SynGP5/GP4-3. 3 :5，-CTGTTGGTGGGCTTCAAGTGCTTCGTGAA C GCCGCCAGCTCC-3' (SEQ ID N0. 13)禾口 SynGP5/GP4_3. 4 -TTATCTAGACTACAGGCG GCCCC-3，(SEQ ID N0. 14)擴(kuò)增得到 GP4_3_SynGP5。擴(kuò)增 ^mGP5-GP4_3 和 GP4_3_SynG P5 的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94°C預(yù)變性IOmin ；94°C變性45s ；50/56°C退火30s ；72°C延伸30s， 共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。兩個(gè)PCR產(chǎn)物有GP4-3這個(gè)重疊部分。兩個(gè)PCR 產(chǎn)物回收并純化后，與Melting solution混合，置于94°C水浴鍋lOmin，等水浴鍋?zhàn)匀焕鋮s后，收起產(chǎn)物作為PCR模板，混合體系如下以SynGP5-GP4-3和GP4-3_SynGP5的混合產(chǎn)物作為模板，用引物SynGP5/ GP4-3. 1(SEQ ID NO. 11)和 SynGP5/GP4_3. 4 (SEQ ID NO. 14)擴(kuò)增得到 SynGP5/GP4_3。該 PCR 體系為:PCR 取模板 4 μ L，加入 PCR 混合液 21 μ L (2. 5 μ L10Xbuffer、2 μ LdNTP (2. 5mM)、 1. 5μ L Mg2+(25mM)、兩條引物各 1 μ U20pM)、0. 2 μ LTaq 酶(2. 5U)、滅菌雙蒸水 12. 8μ L) 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)52°C退火30s ；72°C延伸45s ；94°C變性45s ；58°C退火30s ；72°C延伸45s， 共進(jìn)行35循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。1 %瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物SynGP5/GP4_3， 結(jié)果見(jiàn)圖3。1.5重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將PCR 擴(kuò)增的 GP5、SynGP5/GP4_3 基因和酶切的 SynGP5、SynGP5/GP4_5、SynGP5/ N-7基因回收并純化，同時(shí)對(duì)pCI-neo真核載體(ftOmega)進(jìn)行BioI和)(baI酶切與回收，然后將各段基因分別連接入pCI-neo載體的BioI和^CbaI之間，分別得到重組質(zhì)粒pCI-GP5、 pCI-SynGP5、pCI-SynGP5/GP4-5、pCI-SynGP5/N-7 和 pCI-SynGP5/GP4_3，通過(guò) XhoI 和 XbaI 雙酶切以及測(cè)序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4，測(cè)序結(jié)果顯示GP5基因序列為 SEQ ID NO. l，SynGP5基因序列為 SEQ ID N0. 2，SynGP5/GP4_5序列為 SEQ ID NO. 3,SynGP5/ N-7 基因序列為 SEQ ID NO. 4，SynGP5/GP4-3 基因序列為 SEQ ID NO. 5。
SynGP5-GP4-3回收產(chǎn)物 GP4-3-SynGP5回收產(chǎn)物 Melting solution
總計(jì)
\3μL 10|iL 20μL 43μ 。
將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ΗΕΚ493Α細(xì)胞(購(gòu)自QbioGen公司)。細(xì)胞裂解產(chǎn)物經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后，用豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白中和性單克隆抗體5F12 (馬蘇，戴建君，李玉峰，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白中和性單克隆抗體的制備與免疫學(xué)特性測(cè)定[J]·南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31(1) 72-76)進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 pCI-SynGP5、pCI-SynGP5/GP4-5、pCI-SynGP5/N-7 和 pCI-SynGP5/GP4_3 的細(xì)胞在相應(yīng)大小處有目的條帶，PCI-GP5在目的位置的條帶不明顯，pCI-neo在目的位置沒(méi)有條帶(結(jié)果見(jiàn)圖幻，證明上述GP5基因經(jīng)修飾后在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)效率更高。實(shí)施例2表達(dá)修飾的GP5蛋白的真核質(zhì)粒DNA小鼠免疫特性研究2. 1真核表達(dá)質(zhì)粒的大量制備利用堿裂法大量提取質(zhì)粒，用分光光度計(jì)測(cè)定0D260和0擬80，計(jì)算各重組真核質(zhì)粒含量和純度。DNA含量(yg/mL)=樣品稀釋倍數(shù)X50X0擬60。2. 2小鼠分組與免疫實(shí)驗(yàn)取6-8周齡雌性Balb/c小鼠70只，分為7組，每組10只。第一組為陰性對(duì)照組， 注射PBS，第二、三、四、五、六、七組分別腿部肌肉注射免疫pCI-neo、pCI-GP5、pCI-SynGP5、 pCI-SynGP5/GP4-5、pCI_SynGP5/N_7 和 pCI_SynGP5/GP4_3，劑量為每只小鼠免疫 100 μ g， 首免第21、42天后分別以相同的劑量加強(qiáng)免疫(免疫質(zhì)粒前Mh，腿部肌肉注射2%鹽酸利多卡因，50 μ L/只)。2. 3免疫后各反應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)分別于首次免疫后42和63d采血測(cè)定ELISA抗體和中和抗體；取脾臟，分離淋巴細(xì)胞，測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；并測(cè)定脾臟淋巴細(xì)胞體外刺激后細(xì)胞因子應(yīng)答。2. 4 結(jié)果2. 4. 1體液免疫應(yīng)答將重組真核質(zhì)粒免疫Balb/c小鼠，首免后6周各組均可檢測(cè)到ELISA抗體，首免后9周ELISA抗體達(dá)到較高的水平，結(jié)果見(jiàn)圖6a，其中，pCI_SynGP5和pCI-SynGP5/GP4_5 免疫組抗體顯著高于其它免疫組(P < 0. 01)，其次為pCI-SynGP5/N-7免疫組；pCI_GP5和 pCI-SynGP5/GP4-3免疫組抗體水平較低，pCI-neo和陰性對(duì)照組均未產(chǎn)生一定的特異性 ELISA抗體。中和試驗(yàn)結(jié)果(圖6b)顯示，首免后9周可檢測(cè)到中和抗體，其中，pCI-SynGP5/ GP4-5免疫組中和抗體最高，平均達(dá)到1 22，顯著高于其他各組(P <0.05)，其次為 pCI-SynGP5/N-7、pCI-SynGP5/GP4-3 和 pCI_SynGP5 免疫組，pCI_GP5 免疫組產(chǎn)生的中和抗體較低，PCI-neo和陰性對(duì)照組均未產(chǎn)生一定的特異性中和抗體。2.4. 2淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答分別在首免后6周和首免后9周分離鼠的淋巴細(xì)胞，進(jìn)行PRRSV特異性的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，結(jié)果表明，首免后6周各組均沒(méi)有淋巴細(xì)胞的特異性的增殖，首免后9周可檢測(cè)到各組的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答，其中，pCI-SynGP5/GP4-5免疫組的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答顯著高于其他各免疫組(P < 0. 05)，pCI-SynGP5/N-7、pCI_SynGP5/GP4_3 和 pCI_SynGP5 免疫組的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答水平依次降低，陰性對(duì)照組、pCI-neo和pCI-GP5免疫組均未產(chǎn)生淋巴細(xì)胞的增殖。該結(jié)果說(shuō)明，修飾的0RF5基因可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答，其中 pCI-SynGP5/GP4-5更能提高細(xì)胞免疫應(yīng)答(結(jié)果見(jiàn)圖7)。2. 4. 3細(xì)胞因子應(yīng)答
應(yīng)用美國(guó)R&D公司的小鼠細(xì)胞因子(IL-4及IFN-Y) ELISA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)免疫鼠的脾細(xì)胞體外經(jīng)特異性PRRSV抗原刺激后細(xì)胞因子分泌水平。首免后9周可從各組刺激孔的細(xì)胞上清中檢測(cè)出細(xì)胞因子的應(yīng)答，其中，pCI-SynGP5/GP4-5免疫組產(chǎn)生的IL-4 及IFN-γ細(xì)胞因子應(yīng)答顯著高于其他各免疫組(P < 0.05)，其次為pCI-SynGP5/N-7、 pCI-SynGP5/GP4-3 和 pCI_SynGP5 免疫組，pCI_GP5 免疫組中 IL-4 及 IFN- γ 的分泌量較低，陰性對(duì)照組和pCI-neo免疫組的最低，如圖8a和圖Sb。結(jié)果表明，修飾的0RF5基因可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生細(xì)胞因子應(yīng)答，其中，pCI-SynGP5/GP4-5免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的Thl和Th2型細(xì)胞因子應(yīng)答最高(結(jié)果見(jiàn)圖8)。實(shí)施例3表達(dá)修飾的GP5蛋白的真核質(zhì)粒及其重組減毒沙門(mén)氏菌對(duì)仔豬的免疫特性研究3. 1重組減毒沙門(mén)氏菌的構(gòu)建及鑒定制備減毒沙門(mén)氏菌SL3263 (豬霍亂沙門(mén)氏菌C500弱毒株，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 下同)的感受態(tài)細(xì)胞，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移入減毒沙門(mén)氏菌SL3263中，轉(zhuǎn)化后， 將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含50μ g/mL氨芐青霉素抗性的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化出的單個(gè)菌落在含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600nm = 1. 0 ；采用堿裂法提取質(zhì)粒，然后雙酶切鑒定，證明獲得重組減毒沙門(mén)氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5 (圖9)。3. 2豬體免疫和攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)將30頭仔豬隨機(jī)分為6組，每組5頭，隔離飼養(yǎng)。第1組接種英國(guó)勃林格殷格翰公司的PRRSV活疫苗(1頭份/頭)，第2組接種質(zhì)粒pCI-SynGP5/GP4-5 (500 μ g/頭)， 第3組接種質(zhì)粒pCI-neo (500 μ g/頭)，前三組均為頸部肌肉免疫，第4、5組分別口服免疫 SL-pCI-SynGP5/GP4-5 (108CFU/mL)和減毒沙門(mén)氏菌 SL3263 (108CFU/mL)，2mL/ 頭，第 6 組設(shè)為攻毒對(duì)照，免疫PBS。除了第1組，其余各組在兩周后進(jìn)行第二次免疫。二免后兩周所有組用PRRSV SY0608 (CGMCC No. 4932)強(qiáng)毒株攻毒，每頭豬滴鼻3mL TCID50為1(Γ5_°/mL的病毒液，每個(gè)鼻孔各1.5mL。3. 3免疫和攻毒后各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)分別在首次免疫后14天(二免前)、觀天(攻毒前)及攻毒后第7天、14天、21 天采血，分離血清，用于PRRSV特異性ELISA抗體、中和抗體、血清中細(xì)胞因子及病毒血癥檢測(cè)。攻毒后每日觀察記錄豬的臨床表現(xiàn)，測(cè)量每只豬直腸體溫。所有組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于攻毒后 21天剖檢，觀察并記錄肺臟病理變化，采集肺臟樣品用于制備組織病理切片。3. 4 結(jié)果3. 4. IPRRSV特異性的ELISA及中和抗體測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，，由表1可見(jiàn)首免后2周，各組均未檢出ELISA抗體和中和抗體，首免后4周，PRRSV活疫苗免疫組的ELISA抗體水平達(dá)到了 1 800，中和抗體水平為1 4， 其余各組中，除了 SL-pCI-SynGP5/GP4-5免疫組產(chǎn)生了 1 100的ELISA抗體水平，其他各組的抗體水平均未檢出。此結(jié)果說(shuō)明，與PRRSV活疫苗免疫組相比，SL-pCI-SynGP5/GP4-5 免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生了較低的體液免疫應(yīng)答，pCI-SynGP5/GP4-5、pCI-neo、SL3263和攻毒對(duì)照組都沒(méi)有產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答。表1試驗(yàn)豬ELISA及中和抗體測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因，其特征在于序列如SEQIDNO. 2、SEQ IDN0. 3、SEQ IDNO. 4 或 SEQ IDNO. 5 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因，其特征在于序列如 SEQ IDN0. 3 所示。
3.含有權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因的重組質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述的重組質(zhì)粒是將權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因插入真核表達(dá)載體pCI的B10 I和)(ba I酶切位點(diǎn)間。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述的重組質(zhì)粒是將SEQIDNO. 3所示的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因插入真核表達(dá)載體pCI的B10 I和)(ba I酶切位點(diǎn)間。
6.含有權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒的減毒沙門(mén)氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5。
7.權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求3所述的含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5修飾基因的重組質(zhì)粒在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述的減毒沙門(mén)氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種新的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5修飾基因及其應(yīng)用。豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5修飾基因，序列如SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.3、SEQ IDNO.4或SEQ IDNO.5所示。含有該豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5修飾基因的重組質(zhì)粒。含有所述的重組質(zhì)粒的減毒沙門(mén)氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5。結(jié)果顯示所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的體液免疫應(yīng)答、淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答以及細(xì)胞因子應(yīng)答。重組沙門(mén)氏菌能夠誘導(dǎo)較高水平的抗體應(yīng)答；誘導(dǎo)較高水平的干擾素；病毒血癥水平低；攻毒后組織器官的損傷比較輕微，生物安全水平高。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102321638SQ201110262408
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者華莉, 姜平, 李玉峰 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)