專利名稱：脫羧酶活性的細(xì)胞化學(xué)和生物化學(xué)檢測方法及試劑盒的制作方法
發(fā)明目的一種脫羧酶活性的細(xì)胞化學(xué)和生物化學(xué)檢測方法及試劑盒，是采用羧化酶酶藕聯(lián)固定CO2的技術(shù)，測定各種脫羧酶的細(xì)胞內(nèi)定位以及活性變化，以替代現(xiàn)有脫羧酶組織化學(xué)和酶生物活性檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
人體存在兩種形式分布的內(nèi)分泌細(xì)胞，一種是內(nèi)分泌細(xì)胞群集形成內(nèi)分泌器官，如垂體等，另一種是內(nèi)分泌細(xì)胞單個(gè)散在于其它組織細(xì)胞之間，形成彌散的內(nèi)分泌系統(tǒng)(diffuse endocrine system)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察，一些分泌肽類物質(zhì)的細(xì)胞具有共同的細(xì)胞化學(xué)特性，即具有攝取胺前體、脫去羧基變?yōu)榛钚园返哪芰?amine precursior uptake and decarboxylation，APUD)，而命名為APUD細(xì)胞，并把這些細(xì)胞歸屬為APUD系統(tǒng)，所分泌的活性物質(zhì)作為激素、神經(jīng)遞質(zhì)而發(fā)揮作用；目前已知APUD系統(tǒng)的細(xì)胞有40多種，已確定的肽類產(chǎn)物有30多種。除了上述作為內(nèi)分泌細(xì)胞的APUD外，還有一些脫羧酶在細(xì)胞的分化、發(fā)育過程中也扮演重要角色，如鳥氨酸脫羧酶是多胺物質(zhì)的關(guān)鍵酶，參與了細(xì)胞增殖甚至腫瘤發(fā)生的過程。但是，目前對APUD細(xì)胞的脫羧酶的組織化學(xué)研究還局限在免疫組織化學(xué)這一方面，對脫羧酶的生化活性測定，還是基本上沿用傳統(tǒng)的核素CO2方法，嚴(yán)重限制了對有重要生理功能的這組細(xì)胞的研究與開發(fā)。
現(xiàn)有的脫羧酶的組織化學(xué)方法有1)酶免疫組織化學(xué)利用抗酶蛋白的特異抗體，去檢測酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。這種方法需要相應(yīng)的抗體。
2)脫羧酶特異性不可逆抑制劑標(biāo)記方法有少數(shù)脫羧酶，可以利用相應(yīng)不可逆的酶抑制劑來檢測酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，以及酶的活性，例如鳥氨酸脫羧酶(Ornithine decarboxylase，ODC)的抑制劑二氟甲基鳥氨酸(Difluoromethylornithine)，當(dāng)二氟甲基鳥氨酸標(biāo)記上相應(yīng)熒光素或生物素，再與組織或細(xì)胞涂片反應(yīng)時(shí)，可以被酶蛋白攝取，被定位于酶蛋白的部位。
3)羥基異丁酸鉛捕獲方法羥基異丁酸鉛(Lead hydroxyisobutyrate)法，是利用脫羧酶釋放的CO2與鉛離子形成不溶性的碳酸鉛鹽(PbCO3)而設(shè)計(jì)的。羥基異丁酸鉛是一種弱酸鉛，可溶于水，但可以與HCO3-形成鉛鹽沉淀，但是由于該法的特異性還存有疑問，實(shí)際應(yīng)用不多。
現(xiàn)有的脫羧酶的生物化學(xué)檢測方法
到目前為止，脫羧酶活性的通用檢測方法是用核素C14標(biāo)記的酶底物。酶反應(yīng)時(shí)用堿性濾紙收集釋放的CO2，檢測濾紙的放射性活性。該法靈敏度高，但需要液閃設(shè)備，并且有放射性污染的危險(xiǎn)?，F(xiàn)有檢測方法的缺陷1)酶免疫化學(xué)需要抗體，而且都是專一性的。
2)酶特異性的抑制劑只有少數(shù)酶有。
3)鉛捕獲法，特異性低，鉛對酶有抑制作用。為了克服現(xiàn)有技術(shù)的局限性，本發(fā)明采用酶藕聯(lián)的方法檢測各類脫羧酶的活性與細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)的定位。其原理如下脫羧酶的一個(gè)共同特點(diǎn)是產(chǎn)生二氧化碳(CO2)，CO2是一種氣體，又溶于水，很難被捕捉。至今尚未發(fā)現(xiàn)理想的捕捉或固定CO2的試劑。1990年Robert A.Dodds等發(fā)現(xiàn)羥基異丁酸鉛可以捕捉CO2形成碳酸鉛沉淀，最后通過硫化鉛顯色(A Quantitative cytochenmical method for ornithine decarboxylase activity，The Journal of Histochemistry and Cytochemistry，1990，38(1)123-7)。但是該方法一個(gè)顯著缺陷是特異性不高，鉛離子對酶反應(yīng)具有很強(qiáng)的抑制作用，在繼后的研究中沒有被采用。所以選擇適當(dāng)?shù)墓潭–O2的試劑是本發(fā)明的關(guān)鍵。
本發(fā)明采用酶聯(lián)耦合的技術(shù)，通過羧化酶將CO2轉(zhuǎn)變成可以固定并被顯色的物質(zhì)，再通過顯色試劑顯色。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的(

圖1)APUD細(xì)胞或其他一般細(xì)胞內(nèi)的脫羧酶2產(chǎn)生的CO2或其他途徑來源的CO23，在中性偏堿的環(huán)境里5與水化合，產(chǎn)生HCO3-6，HCO3-被磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶13(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEP羧化酶)攝取，將磷酸烯醇式丙酮酸7(phosphoenolpyruvate，PEP)羧化，生成草酰乙酸9(oxaloacetic aicd，OAA)，草酰乙酸與固紫B10(Fast Violet B)形成11不溶于水的紫色復(fù)合物12，沉淀于酶的部位，顯色物質(zhì)的多少與酶的活性相關(guān)。如果在反應(yīng)體系中加入適當(dāng)?shù)幕钚匀ノ蹌?，可使有色沉淀物溶于水，進(jìn)行脫羧酶生化活性的比色分析。
理論上的考慮1)羧化酶的來源PEP羧化酶是植物進(jìn)行光合作用過程中的二羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，在植物葉內(nèi)有很高的濃度，因此酶的來源豐富，商品價(jià)格也不高。本發(fā)明中所使用的PEP羧化酶是來源于玉米，Sigma公司產(chǎn)品。
植物按其固定二氧化碳的途徑不同分成三碳(C3)和四碳(C4)植物兩大類。小麥、水稻、大豆等屬C3作物，玉米、甘薯、甘蔗等屬C4作物。C3途徑是通過有3個(gè)碳原子的糖固定CO2；而C4植物除此之外則還有一套4碳糖的循環(huán)途徑即C4途徑。C4途徑中催化CO2固定的酶(PEP羧化酶)與CO2的親和力極強(qiáng)，起到了CO2泵的作用，使得進(jìn)入C4植物體內(nèi)的CO2輕易不能再出來，因此與CO2有極強(qiáng)親和力的PEP羧化酶比較適合于本發(fā)明中脫羧酶產(chǎn)生的CO2的酶藕聯(lián)固定，不讓CO2擴(kuò)散。
2)羧化酶反應(yīng)的條件
a.pH值PEP羧化酶的最佳pH值接8.0，但在pH7.4至8.0之間均可進(jìn)行酶藕聯(lián)分析，在pH較低時(shí)，酶活性有所下降，但穩(wěn)定性卻大為增加，pH7.4時(shí)的酶活性約為8.0時(shí)的40％，但在pH8.0時(shí)的，由于酶蛋白的不穩(wěn)定酶活性喪失40％，因此反應(yīng)pH值的選擇在pH7.0到pH8.0之間，因?yàn)閜H7.0時(shí)，酶活性喪失很少，大約只有1.5％。一般情況下，PEP羧化酶的保存，采用低pH的緩沖液。
b.鎂離子PEP羧化酶的反應(yīng)需要鎂離子，一般最終反應(yīng)液需要10mM的濃度。
3)顯色問題雖然固紅PDC(Fast red PDC)、固紅ITR(Fast red ITR)也常用再轉(zhuǎn)氨酶(產(chǎn)生草酰乙酸)活性的測定中(Sax SM.，Moore JJ.Determination ofglutamine oxaloacetic transaminase activity by coupling of oxaoacetatewith diazonium salts.Clin Chem 13，175 1976.Amador E.，SalvatoreMA.Serum glutamic oxaoacetic transaminase activityReviesed manualand automated methods using diazonium dyes.Am I Clin Pathol.55，686，1971)，但是這些偶氮染料在溶液中的穩(wěn)定性、與草酰乙酸形成復(fù)合物的穩(wěn)定性、復(fù)合物形成的速度均不及固紫B(Fast violet B)。本發(fā)明采用固紫B，實(shí)用級別固紫B即可，不需要高純度試劑。
本發(fā)明實(shí)施步驟1.細(xì)胞或組織切片的固定細(xì)胞涂片或組織的固定，一般以能最大限度保存酶活性和細(xì)胞形態(tài)完整性為目標(biāo)，應(yīng)根據(jù)不同的脫羧酶的檢測而定，在血細(xì)胞涂片中，可采用60％的丙酮(4-10℃)固定30秒鐘或福爾馬林丙酮緩沖液固定30秒，即可進(jìn)行脫羧酶活性的檢測。
固定液配方A.60％檸檬酸丙酮固定液(500ml)0.03M檸檬酸168ml0.03M檸檬酸鈉 32ml丙酮 300mlB.福爾馬林固定液(100ml)Na2HPO420mgKH2PO4100mg蒸餾水 30ml丙酮 45ml福爾馬林(40％甲醛) 25ml2.反應(yīng)液配制A)PEP羧化酶底物反應(yīng)液Tris緩沖液50mmol/L，pH 7.5MgCl210mmol/L
PEP單環(huán)己胺鹽 2mmol/LB)PEP羧化酶保存液Tris緩沖液， 10mmol/L，pH 7.0DTT(二巰基蘇糖醇) 10mmol/LPEP羧化酶 5U/ml(100×)C)脫羧酶底物(根據(jù)酶而定)50mmol/L，終濃度5mmol/LD)固紫B溶液50mg/ml，終濃度1-2.5mg/mlE)復(fù)染液2％甲基綠。
3.檢測0.8ml A液加0.1ml B液加10μl C液加50μl D液混合，滴加到白細(xì)胞涂片上，37℃反應(yīng)1小時(shí)，洗去孵育液，鏡檢。
4.信號觀察陽性信號為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)細(xì)小顆粒狀的紫色顆粒(圖2a，b)，顆粒大小與酶活性強(qiáng)弱、反應(yīng)時(shí)間長短等有關(guān)，顆粒的分布與酶的分布部位有關(guān)。細(xì)小顆粒一般需要1000×油鏡才能觀察到，大顆粒在低倍下也能觀察到。也可用2％甲基綠復(fù)染20分鐘，使結(jié)果更加清晰。
由于紫色沉淀顆粒溶于有機(jī)溶劑，溶解于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，一些常用檢測油也能使之溶解，不溶于二甲苯和乙醚。因此松節(jié)油、甘油等均可能使顆粒擴(kuò)散，應(yīng)避免接觸。所以在用油鏡觀察時(shí)，應(yīng)加蓋玻片，蓋玻片水封。一般情況下，應(yīng)立即觀察，如若保存結(jié)果，可考慮采用高純度化學(xué)膠水封蓋玻片，陽性結(jié)果可以保持?jǐn)?shù)年。
5.影響因素1)所有試劑均需無CO2水配置為了降低背景和可能的擴(kuò)散現(xiàn)象，最好采用去除CO2的水，但不特別要求，對一般的細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果判斷并無顯著影響。
2)固紫B的濃度固紫B濃度較低時(shí)，所生成的紫色顆粒直徑小，分布均勻，如酶活性較高或者要求精確定位，最好采用偏低的固紫B濃度(圖2b)，如0.5mg-1mg/ml，但靈敏度會有所降低。加大固紫B濃度，可使顯色速度加快，但是高濃度的固紫B對PEP羧化酶的活性有抑制作用，一般采用2.5mg/ml的固紫B濃度。
3)反應(yīng)液pH值在偏堿的環(huán)境里，CO2容易溶于水，而容易被水化捕捉，同時(shí)PEP羧化酶的活性也增強(qiáng)，但是會隨著pH的升高而變得不太穩(wěn)定，最好不要超過pH8.0，一般采用pH7.5至pH8.0即可。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.通用性本發(fā)明是基于脫羧酶的共同產(chǎn)物CO2的捕捉而設(shè)計(jì)的，所以所有生成CO2的反應(yīng)均可采用本發(fā)明的酶藕聯(lián)方法。在脫羧酶的反應(yīng)中，只要更換脫羧酶的底物即可檢測相應(yīng)的脫羧酶的細(xì)胞化學(xué)活性，應(yīng)用靈活。
2.真實(shí)反應(yīng)脫羧酶的活性脫羧酶的免疫組織化學(xué)主要反映了酶蛋白的含量，不能真實(shí)反映酶活性的高低。本發(fā)明的方法可以根據(jù)固定脫羧酶產(chǎn)物CO2的方法，定量酶的活性。
3.操作方便不管是細(xì)胞涂片還是組織切片，只要在玻片加上酶反應(yīng)混合物，一定時(shí)間溫育后即可直接檢測結(jié)果，而免疫組織化學(xué)需要經(jīng)過多道洗片、溫育程序，操作麻煩。
4.成本低本發(fā)明的所使用的藕聯(lián)酶PEP羧化酶，大量存在于植物的葉片組織內(nèi)，來源豐富，商品價(jià)格也不算很貴，其他都是一般的化學(xué)試劑，與免疫組化相比檢測成本很低。
以下結(jié)合附圖和實(shí)例詳細(xì)解釋本發(fā)明實(shí)施過程。
圖1.脫羧酶組織細(xì)胞化學(xué)檢測原理1 脫羧酶底物8 羧化反應(yīng)2 脫羧酶9 羧化酶產(chǎn)物，草酰乙酸3 脫羧酶產(chǎn)物10 顯色試劑，固紫B4 脫羧酶產(chǎn)物CO211 草酰乙酸與固紫B的結(jié)合反應(yīng)5 CO2水和反應(yīng) 12 紫色沉淀物6 CO2與水形成的HCO3-13 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶7 羧化酶底物，磷酸烯醇式丙酮酸 14 羧化酶反應(yīng)所需的Mg++圖2.白血病細(xì)胞鳥氨酸脫羧酶細(xì)胞化學(xué)(1000×)15鳥氨酸脫羧酶陽性細(xì)胞 18 鳥氨酸脫羧酶陽性細(xì)胞16鳥氨酸脫羧酶陰性細(xì)胞 19 鳥氨酸脫羧酶陰性細(xì)胞17陽性顆粒(大顆粒) 20 陽性顆粒(小顆粒顆粒)
實(shí)例1鳥氨酸脫羧酶細(xì)胞化學(xué)檢測試劑盒鳥氨酸脫羧酶是生成多胺(Polyamines)的關(guān)鍵酶，而多胺是γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)的良好底物，可被γ-GT催化參與蛋白質(zhì)修飾或蛋白質(zhì)間的交聯(lián)，與細(xì)胞分化過程有關(guān)，同時(shí)多胺帶有正電荷，還可以通過離子鍵和氫鍵的形式與帶負(fù)荷的物質(zhì)結(jié)合，調(diào)節(jié)其生物學(xué)活性和功能，因此認(rèn)為多胺是細(xì)胞增殖和分化的重要調(diào)控物質(zhì)，許多腫瘤的形成往往伴有多胺合成的異常。細(xì)胞內(nèi)多胺合成是從鳥氨酸脫羧開始的，由鳥氨酸脫羧酶(ODC)催化脫羧形成腐胺，然后再分別經(jīng)過一次或兩次丙胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成精脒或精胺。ODC是多胺合成的限速酶，因而亦是人為干預(yù)細(xì)胞內(nèi)多胺代謝的一個(gè)重要作用位點(diǎn)。ODC活性的組織化學(xué)測定至今尚無很好的測定方法，主要是采用酶蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)。
試劑盒內(nèi)容組成(100人份裝)試劑1脫羧酶、羧化酶底物反應(yīng)混合液，凍干，-20℃保存，應(yīng)用時(shí)加試劑4無CO2水90ml溶解，成份及濃度如下。溶解后適當(dāng)分裝，-20℃保存。
Tris緩沖液 50mmol/L，pH 7.5MgCl210mmol/LPEP單環(huán)己胺鹽2mmol/L鳥氨酸 5mmol/L試劑2PEP羧化酶保存液，凍干粉供應(yīng)，-20℃保存，應(yīng)用時(shí)加1ml試劑4無CO2水溶解，成份及濃度如下(100×)，-20℃保存。
Tris緩沖液，10mmol/L，pH 7.0DDT(二巰基蘇糖醇) 10mmol/LPEP羧化酶 5U/ml試劑3固紫B溶液50mg/ml，5ml試劑4無CO2水，100ml。
檢測操作方法1.骨髓細(xì)胞固定細(xì)胞涂片采用60％的丙酮(4-10℃)固定30秒鐘，10ml Tris-HCl(pH 7.4)洗片2次，晾干，可進(jìn)行脫羧酶活性的檢測。
2.檢測將試劑盒中試劑1-3分別溶解稀釋，按比例取試劑10.8ml；試劑210μl；試劑350μl，混合，滴加于細(xì)胞處，以蓋滿整個(gè)細(xì)胞涂片為宜，將玻片置濕盒，37℃溫育1小時(shí)，10ml Tris-HCl(pH 7.4)洗片2次，晾干，加15-30μl 10mMTris-HCl(pH 7.4)，蓋上蓋玻片，鏡檢?？筛鶕?jù)需要選擇1000×油鏡檢測。陽性信號表現(xiàn)為細(xì)胞核周邊散在的微小顆粒，呈紫紅色(圖2a，b)。
注意三種試劑混合后，應(yīng)立即使用，以避免PEP羧化酶活性的喪失以及底物的破壞。
實(shí)例2組氨酸脫羧酶的生化活性檢測白血病細(xì)胞，特別是慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞中存在一定比例的嗜堿性粒細(xì)胞，并伴有組氨酸脫羧酶(HDC)活性的增高。一般一次分析，106細(xì)胞就夠了，也可以先進(jìn)行蛋白定量，每100μg蛋白即可進(jìn)行組氨酸脫羧酶活性的分析，最后調(diào)節(jié)到100μl。
900μl酶反應(yīng)Tris緩沖液含50mmol/L(pH 7.5)，MgCl210mmol/L，PEP單環(huán)己胺鹽2mmol/L，組氨酸5mmol/L，PEP羧化酶0.5U，加到100μl細(xì)胞勻漿中，混勻，37℃反應(yīng)1小時(shí)，加入含1％Tween 80的固紫B溶液(50mg/ml)50μl，混勻，留置5分鐘，520nm比色，同時(shí)設(shè)置空白對照。也可采用96孔微板格式，用酶標(biāo)儀檢測分析。
同時(shí)該生化檢測方法還可以用于自動生化分析儀的檢測。
附表.可采用本發(fā)明檢測的脫羧酶及其底物
權(quán)利要求
1.一種脫羧酶活性的細(xì)胞化學(xué)和生物化學(xué)檢測方法及試劑盒，是采用羧化酶酶藕聯(lián)固定脫羧酶產(chǎn)物CO2的技術(shù)，測定脫羧酶的細(xì)胞內(nèi)定位以及活性變化，該檢測系統(tǒng)或試劑盒包括a)待檢測的特定脫羧酶的底物及維持脫羧酶活性所必需的物質(zhì)；b)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和底物磷酸烯醇式丙酮酸以及維持羧化酶活性的所必需的物質(zhì)；c)羧化酶產(chǎn)物的顯色試劑以及比色法所需的色素增溶試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的脫羧酶，其特征是指所有可催化底物脫羧產(chǎn)生CO2的酶類，包括鳥氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶、多巴脫羧酶、羥胺脫羧酶、谷氨酸脫羧酶、丙酮酸脫羧酶、S腺苷蛋氨酸脫羧酶、尿卟啉原脫羧酶、谷氨酰胺脫羧酶、酪氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、色氨酸脫羧酶、甘氨酸脫羧酶、磷酸酯絲氨酸脫羧酶、己四醇醛酸脫羧酶、二烷基甘氨酸脫羧酶、丙二酰CoA脫羧酶、肉桂酸脫羧酶、苯(甲)酰(基)甲酸脫羧酶、羧基香草醛脫羧酶、草酸脫羧酶、半胱氨酸脫羧酶、α-乙酰乳酸脫羧酶等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所描述的脫羧酶的底物，其特征是底物可被相應(yīng)的脫羧酶脫去羧基產(chǎn)生CO2，相應(yīng)的底物包括鳥氨酸、組氨酸、多巴、羥胺、谷氨酸、丙酮酸、S腺苷蛋氨酸、尿卟啉原、谷氨酰胺、酪氨酸、精氨酸、色氨酸、甘氨酸、磷酸酯絲氨酸、己四醇醛酸、二烷基甘氨酸、丙二酰CoA、肉桂酸、苯(甲)酰(基)甲酸、羧基香草醛、草酸、半胱氨酸、α-乙酰乳酸等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的羧化酶，其特征是指可利用CO2進(jìn)行合成的酶類，包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)，其相應(yīng)的底物為磷酸烯醇式丙酮酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的羧化酶產(chǎn)物的顯色試劑，其特征是顯色試劑可以與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶產(chǎn)物草酰乙酸結(jié)合生成不溶性有色物質(zhì)原位沉積，或被色素增溶試劑溶解進(jìn)行比色分析，顯色試劑包括固紫B(Fast violetB)、固紅PDC(Fast red PDC)、固紅ITR(Fast red ITR)。
全文摘要
一種脫羧酶活性的細(xì)胞化學(xué)和生物化學(xué)檢測方法及試劑盒，是采用羧化酶酶藕聯(lián)固定CO
文檔編號C12Q1/25GK1500885SQ0214526
公開日2004年6月2日 申請日期2002年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者繆金明 申請人:繆金明