專利名稱：一種用于黃酒棄糟飼料的益生菌添加劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用釀造工業(yè)廢棄物生產(chǎn)高活性飼用益生菌制劑的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃酒源于中國，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大發(fā)酵酒，距今已有5000多年的歷史。 黃酒作為低度、營養(yǎng)、保健型的釀造酒，正適合當(dāng)今社會新的消費價值取向，其消費量每年保持在10%以上增長，目前我國年產(chǎn)量超過250萬噸。黃酒糟是黃酒企業(yè)生產(chǎn)黃酒的副產(chǎn)物，是發(fā)酵酒醪經(jīng)壓榨、分離去酒液后的留下的固體殘渣。以干型黃酒為例，每萬噸黃酒將會產(chǎn)生黃酒糟1400噸左右(含水量45% -55%不等)，如生產(chǎn)其他類型黃酒其酒糟的數(shù)量將更大。按照每年生產(chǎn)250萬噸的黃酒計算，產(chǎn)生的黃酒棄糟約為40萬噸。我國有700多家黃酒企業(yè)，每年生產(chǎn)大量的黃酒糟。棄糟水分含量大，酸度高，易腐爛變質(zhì)，不易保管和運輸，若不及時處理，將嚴(yán)重污染環(huán)境。少數(shù)酒廠只作為普通的飼料低價出售或作為發(fā)酵飼料，利用率很低，多數(shù)廠家由于棄糟量大，加之黃酒生產(chǎn)具有季節(jié)性，不同季節(jié)產(chǎn)生酒糟量的不平衡，養(yǎng)殖場不愿購買。大量黃酒糟至今無法有效利用，造成嚴(yán)重的資源浪費。更有甚者，部分廠家以海洋傾倒、土地填埋、焚燒、土地農(nóng)用等方式處理棄糟，對土壤和地下水造成嚴(yán)重的污染。在焚燒過程中產(chǎn)生的二噁英、二氧化硫、鹽酸等氣體還造成對對大氣的污染等。隨著生態(tài)環(huán)境意識的加強(qiáng)，黃酒棄糟污染問題日顯突出。解決棄糟的處理或有效再利用問題已經(jīng)迫在眉睫。在國內(nèi)外對酒糟的研究除了繼續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)醋、開發(fā)成調(diào)味品和提取酒糟蛋白以外，還有利用酒糟制取甘油，生產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶，制取糖用活性碳，外敷用于治療關(guān)節(jié)炎等。不過在各種研究中較深入和廣泛的還是酒糟用來生產(chǎn)飼料，這不僅節(jié)省了資源，而且還減少了對環(huán)境的污染。但是，棄糟直接干燥作為動物飼料，存在粗纖維含量較高，消化性和適口性差的問題。黃酒糟的熱能比較低，含有不溶性物質(zhì)多，難以直接利用。而且干燥能耗大，不經(jīng)濟(jì)。且在生產(chǎn)中往往因飼喂不當(dāng)、長期飼喂或突然大量飼喂，常會引起食后中毒現(xiàn)象。如貴州九倉鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶用酒糟喂養(yǎng)黔北麻羊，飼喂后所有羊只出現(xiàn)興奮不安、呼吸迫促、四肢站立不穩(wěn)等異常狀況，嚴(yán)重者出現(xiàn)死亡。根據(jù)剖檢結(jié)果并結(jié)合臨床癥狀診斷為酒糟急性中毒。酒糟中含有酒精和醋酸，大量飼喂，不僅易造成中毒，而且由于酒精所含營養(yǎng)不平衡而引起便秘，另外，在配種期間，也不宜大量使用酒糟。酒糟飼料一般不可單一使用，還要加入一定量的維生素D，配合玉米面、麩皮、骨粉和青綠飼料等。益生菌可產(chǎn)生各種酶，如水解酶、發(fā)酵酶和呼吸酶，這些酶有利于降解飼料中的蛋白質(zhì)、脂肪和較復(fù)雜的碳水化合物，給動物提供營養(yǎng)物質(zhì)。飼料對粘附其上的益生菌有攜帶作用，益生菌隨發(fā)酵飼料顆粒進(jìn)入動物體內(nèi)，充分發(fā)揮益生作用。益生菌能粘附到腸壁細(xì)胞上起到屏障作用，競爭性抑制排斥病原菌，維持動物胃腸道菌群平衡。消化道內(nèi)的益生菌是良好的免疫激活劑，能刺激腸道免疫器官的生長發(fā)育，提高動物抗體水平和巨噬細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，及時殺滅入侵的致病菌，增強(qiáng)動物對多種疫病的抵抗力，大幅度降低發(fā)病率和死淘率。經(jīng)益生菌發(fā)酵后飼料有特別的香味，適口性好，可刺激食欲，提高采食量；同時由益生菌產(chǎn)生的蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶，可以幫助動物消化吸收，轉(zhuǎn)化利用率較高，可以提高動物的生產(chǎn)性能。使用益生菌喂養(yǎng)動物，還可以可抑制腸道內(nèi)腐敗菌，減少氨、生物胺、吲哚等有害物質(zhì)產(chǎn)生，芽胞桿菌產(chǎn)生的氨基氧化酶及分解硫化氫的酶類，可將吲哚類物質(zhì)降解，從而降低畜禽舍內(nèi)氨氣、硫化氫的濃度和臭味，減少污染，改善環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明發(fā)明了一種用于黃酒棄糟飼料的益生菌添加劑的制備方法。本發(fā)明采用自主獲得的益生菌菌種丁酸梭菌，具有明顯的調(diào)節(jié)腸道菌群和恢復(fù)抗生素引起的腸道菌群紊亂；發(fā)酵乳桿菌能夠產(chǎn)生GABA，具有降低應(yīng)急和熱敏反應(yīng)功能；發(fā)酵乳桿菌La-YI產(chǎn)生 a-半乳糖苷酶，可有效降解餅粕類飼料組分重的半乳糖苷類等營養(yǎng)拮抗因子，顯著提高飼料報酬；動物雙歧桿菌乳酸亞種QqOS具有耐氧特性，可以消耗基質(zhì)中的微量氧氣，為丁酸梭菌等嚴(yán)格厭氧菌提供良好的厭氧環(huán)境，同時具有良好降解膽固醇作用(去除率可達(dá) 56%)，減少腸道膽固醇在吸收，降低動物產(chǎn)品的膽固醇含量，多菌種復(fù)合，實現(xiàn)產(chǎn)品多功能。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種用于黃酒棄糟飼料的益生菌添加劑，含多種功能不同的益生菌。通過將丁酸梭菌，發(fā)酵乳桿菌 ML7(Lactobacillus fermentum ML7),發(fā)酵乳桿菌 La-YI (Lactobacillus fermentum La- )，動物雙歧桿菌乳酸亞種 Qq08 (BifidcAacterium animal is subsp. Iactis Qq08 CGMCCNo. 2844)高密度發(fā)酵后制備而成。通過飼用益生菌的評價指標(biāo)對菌株進(jìn)行耐熱性、耐酸性、耐膽鹽性、抗菌性、黏附性等進(jìn)行體外綜合評價。丁酸梭菌(Clostridium butyricum) ( 丁酸梭菌培養(yǎng)與發(fā)酵動力學(xué)以及調(diào)節(jié)腹瀉小鼠腸道菌群平衡的研究，孔青，浙江大學(xué)博士論文)能產(chǎn)生降血壓功能因子Y -氨基丁酸的發(fā)酵乳桿菌ML7 (Lactobacillus fermentum ML7)，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，Y-氨基丁酸的產(chǎn)量可達(dá)到117ang/L(產(chǎn)Y -氨基丁酸乳酸菌的研究與應(yīng)用，穆琳，浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文)能產(chǎn)生α-半乳糖苷酶發(fā)酵乳桿菌 La-YI (Lactobacillusfermentum La-ΥΙ)，有效消除餅粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子半乳糖苷類化合物，發(fā)酵培養(yǎng)4小時，a-半乳糖苷酶活性達(dá)到17.35U/mL。(發(fā)酵乳桿菌增殖培養(yǎng)基營養(yǎng)因子優(yōu)化研究，葉雪飛等，食品科學(xué)，2010， Vol. 31. No. 05，194-196)能夠有效去除膽固醇的動物雙歧桿菌乳酸亞種Qq08 (Bifidobacterium animal is subsp. Iactis Qq08)，去除率達(dá)到56. 以上保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC。保藏日期2009年1月4日，保藏號CGMCC No.觀44。最終選定以上菌株作為申請的出發(fā)菌株。通過將上述菌株分別發(fā)酵達(dá)到一定菌體濃度，按比例混合，干燥后即得黃酒棄糟飼用益生菌添加劑成品，
具體實施方式
實施例11) 丁酸梭菌的發(fā)酵。液體種子種子培養(yǎng)基2. 44%葡萄糖(W/V)，2.08%酵母浸膏(W/V)，l%胰蛋白陳(w/v) ,0.1% (NH4) 2S04 (w/v) ,0.1% NaHC03 (w/v) ,0. 02 % MnS04 · H20 (w/v) ,0. 02 % Mgso4 ； · 7H20(w/v) ,0. 002% CaCl2 (w/v)，初始 pH 為 8. 5。丁酸梭菌的發(fā)酵培養(yǎng)基2%葡萄糖(w/v)，3. 98 %豆餅粉提取液，0. 1 % (NH4) 2S04 (w/v) ,0. 124 % NaHC03 (w/v)，0. 37 % 玉米菜(w/v) ,0. 02 % MnS04 · H20 (w/v)， 0. 02% Mgso ； · 7H20(w/v) ,0. 002% CaCl2 (w/v)，初始 pH 為 7. 5。培養(yǎng)條件為厭氧，37°C，24h?；罹鷶?shù)可達(dá)7. lxl08cFU/mL，2)發(fā)酵乳桿菌ML7的發(fā)酵。培養(yǎng)基成分為乳糖15g，酵母膏5g，胰蛋白胨5g，無水乙酸鈉2g，MgS04 · 7H20， 0. 02g, MnS04 · 4H20 0. OOlg, NaCl 0. OOlg, FeS04 · 7H20 0. OOlg,麥芽汁(糖度 15° Τ) 10ml，蒸餾水1000ml，初始pH為6. 8。用此培養(yǎng)基，在37°C條件下厭氧培養(yǎng)20h后得到的ML7活菌數(shù)可達(dá)2. hl01Qcfu/ml。。3)發(fā)酵乳桿菌La-YI的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖2. 0 %，牛肉膏0. 5 %，胰酶解酪朊0. 5 %，玉米漿2 %，檸檬酸二銨0. 2 %，乙酸鈉0. 5 %，磷酸氫二鉀0. 2 %，硫酸鎂0. 05 %，硫酸錳0. 02 %，蒸餾水 1000ml。發(fā)酵乳桿菌La-Yl在優(yōu)化后的MRS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)16 18h，達(dá)到了 IOltlCFU/ mL以上4)動物雙歧桿菌乳酸亞種Qq08的發(fā)酵TPY液體胰酶解酪朊IOg ；蛋白胨5g ；酵母浸膏2. 5g ；葡萄糖15g ；土溫80 Iml ； K2HPO4 2g ；MgC12 · 6H20 0. 5g ；CaCl2 0. 15g ；ZnCl2 · 7H20 0. 25g, FeCl 33g，半胱氨酸 0. 5g ； ρΗ6· 5 ；H2O 1000mL。培養(yǎng)條件厭氧，37°C，24h0上述菌株按丁酸梭菌1-5份，發(fā)酵乳桿菌ML7 1_3份，發(fā)酵乳桿菌La-YI 1_3份， 動物雙歧桿菌乳酸亞種QqOS 1-3份的比例混合即得黃酒棄糟飼用益生菌添加劑。將1000ml上述黃酒棄糟飼用益生菌添加劑菌液在速度為6000r/min，溫度為4°C 的條件下離心20min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌后收集菌泥。在離心所得的菌泥中加入菌泥兩倍體積的復(fù)配保護(hù)劑，保護(hù)劑中脫脂乳海藻糖維生素C 谷氨酸鈉(質(zhì)量比) =15 4 1 1.5，并混勻。取500ml的燒杯，裝入液氮，迅速用Iml槍頭的移液槍往燒杯中滴入15ml菌泥，在液氮環(huán)境中放置池后，放入冷凍干燥儀中凍干，得黃酒棄糟飼用益生菌添加劑成品。
權(quán)利要求
1.一種用于黃酒棄糟飼料益生菌添加劑的制備方法，依次包含如下步驟1)丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的發(fā)酵液體種子種子培養(yǎng)基2. 44%葡萄糖(W/V)，2.08%酵母浸膏(W/V)，l%胰蛋白陳(w/v) ,0. 1 % (NH4) 2S04 (w/v) ,0. 1 % NaHCO3 (w/v)，0· 02 % MnSO4 · H2O (w/v)，0· 02 % MgSO4 · 7H20 (w/v)，0. 002 % CaCl2 (w/v)，初始 pH 為 8· 5 ；丁酸梭菌的發(fā)酵培養(yǎng)基2%葡萄糖(w/v)，3. 98%豆餅粉提取液，0. (NH4)2SO4(w/ ν) ,0.124 % NaHCO3 (w/v), 0. 37 % 玉米菜(w/v), 0. 02 % MnSO4 ‘ H2O (w/v), 0. 02 % Mgso4 ； · 7H20 (w/v)，0. 002 % CaCl2 (w/v)，初始 pH 為 7. 5 ；培養(yǎng)條件為厭氧，370C，24h,活菌數(shù)可達(dá)7. lxl08cFU/mL。2)發(fā)酵乳桿菌ML7 (Lactobacillus fermentum ML7)的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為乳糖15g，酵母膏5g，胰蛋白胨5g，無水乙酸鈉2g，MgSO4 · 7Η20，0· 02g, MnSO4 · 4H20 O.OOlg，NaCl 0. OOlg, FeSO4 · 7H20 O.OOlg，麥芽汁(糖度 15° Τ) 10ml，蒸溜水1000ml，初始pH為6. 8 ；用此培養(yǎng)基，在37°C條件下厭氧培養(yǎng)20h后得到的ML7活菌數(shù)可達(dá) 2. 2xl010cfu/mL·3)發(fā)酵乳桿菌La-YI (Lactobacillus fermentum La-YI)的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖2. 0 %，牛肉膏0. 5 %，胰酶解酪朊0.5%，玉米漿2 %，檸檬酸二銨0. 2 %，乙酸鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.05%，硫酸錳0.02%，蒸餾水1000ml ； 發(fā)酵乳桿菌La-Yl此培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)16 18h，達(dá)到了 101(lCFU/mL以上；4)動物雙歧桿菌乳酸亞種Qq08 (Bifidobacterium animal is subsp. Iactis Qq08)的發(fā)酵TPY液體胰酶解酪朊IOg ；蛋白胨5g ；酵母浸膏2. 5g ；葡萄糖15g ；土溫80 Iml ;Κ2ΗΡ04 2g ；MgCl2 · 6H20 0. 5g ；CaCl2 0. 15g ；ZnCl2 · 7H20 0. 25g, FeCl3 3g，半胱氨酸 0. 5g ；ρΗ6· 5 ； H2O IOOOmL ；培養(yǎng)條件厭氧，37°C，24h;上述菌株按丁酸梭菌1-5份，發(fā)酵乳桿菌ML7 1-3份，發(fā)酵乳桿菌La-YI 1-3份，動物雙歧桿菌乳酸亞種QqOS 1-3份的比例混合即得黃酒棄糟飼用益生菌添加劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法還包括冷凍干燥步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述冷凍干燥方法為將1000ml上述黃酒棄糟飼用益生菌添加劑菌液在速度為6000r/min，溫度為4°C的條件下離心20min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌后收集菌泥；在離心所得的菌泥中加入菌泥兩倍體積的復(fù)配保護(hù)劑， 保護(hù)劑中脫脂乳海藻糖維生素C 谷氨酸鈉(質(zhì)量比)=15 4 1 1. 5，并混勻； 取500ml的燒杯，裝入液氮，迅速用Iml槍頭的移液槍往燒杯中滴入15ml菌泥，在液氮環(huán)境中放置池后，放入冷凍干燥儀中凍干，得黃酒棄糟飼用益生菌添加劑成品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于黃酒棄糟飼料益生菌添加劑的制備方法，采用益生菌菌種丁酸梭菌，發(fā)酵乳桿菌ML7，發(fā)酵乳桿菌La-YI，動物雙歧桿菌乳酸亞種Qq08，多菌種復(fù)合制備多功能黃酒棄糟飼料益生菌添加劑。該添加劑具有調(diào)節(jié)動物腸道菌群和恢復(fù)抗生素引起的腸道菌群紊亂，降低應(yīng)急和熱敏反應(yīng)功能，有效降解餅粕類飼料組分重的a-半乳糖苷類等營養(yǎng)拮抗因子，顯著提高飼料報酬，以及降解膽固醇作用減少腸道膽固醇在吸收，降低動物產(chǎn)品的膽固醇含量得作用。并能改善黃酒棄糟飼料的適口性，提高牲畜食欲增加采食量。
文檔編號C12N1/20GK102239957SQ201110142478
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者周永山 申請人:紹興市古煌釀酒有限公司