專利名稱：對(duì)口蹄疫病毒有抑制作用的干擾靶序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一段具有抑制免疫作用的序列，確切講本發(fā)明涉及對(duì)口蹄疫病毒有抑制作用的干擾靶序列。
背景技術(shù)：
口蹄疫是一種由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的，主要危害偶蹄獸的急性、熱性和高度接觸性人畜共患傳染病。其特征是傳播途徑多，傳播速度快，流行范圍廣，傳染性強(qiáng)，感染率高，病原變異大，危害程度烈，幾乎每年都給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。交叉保護(hù)試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)確證口蹄疫病毒有7個(gè)血清型，即0、A、C(歐洲型)和Asial (亞洲1型)以及STAU STA2、STA3 (南非型)。目前還沒有針對(duì)該病的有效治療藥物，主要還是以預(yù)防為主。然而實(shí)驗(yàn)證明，各不同血清型間幾乎沒有交互免疫性， 即一種抗血清僅能保護(hù)一種病毒類型的感染。此外，口蹄疫發(fā)病迅速，傳染極快，感染動(dòng)物通常在2 3天內(nèi)便發(fā)生嚴(yán)重的疾病。滅活疫苗一般在接種7天后才能產(chǎn)生保護(hù)性抗體， 開始發(fā)揮抗病毒作用。因此，目前的疫苗不足以應(yīng)對(duì)快速的疾病爆發(fā)，需要開發(fā)更有效的抗病毒策略來解決這些問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供對(duì)口蹄疫病毒有抑制作用的干擾靶序列，以及由這些靶序列制備的質(zhì)粒，預(yù)期這些干擾靶序列和質(zhì)粒能夠使奶牛對(duì)口蹄疫病毒有一定抑制作用，并可在培育轉(zhuǎn)基因抗口蹄疫病毒奶牛中的應(yīng)用。本發(fā)明的對(duì)口蹄疫病毒有抑制作用的干擾靶序列是位于奶牛功能基因 ENTPDase6mRNA上的RNA干擾靶序列，其序列為序列表中的SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列、SEQID No. 2所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列。上述的序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3在培育轉(zhuǎn)基因抗口蹄疫病毒奶牛中的應(yīng)用。根據(jù)前述的SEQ ID No. 1靶序列可確定出發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列，利用合適的基因載體將該DNA序列轉(zhuǎn)染至牛細(xì)胞后可以轉(zhuǎn)錄成發(fā)夾狀雙鏈RNA，能夠與奶牛功能基因 ENTPDase6中的SEQ ID No. 1片段特異性結(jié)合，從而抑制ENTPDase6的正常表達(dá)，使其表達(dá)產(chǎn)物量降低，進(jìn)而抑制口蹄疫病毒的復(fù)制。該發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列的正義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 4 ；反義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 5。根據(jù)前述的SEQ ID No. 2靶序列可確定出發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列，利用合適的基因載體將該DNA序列轉(zhuǎn)染至牛細(xì)胞后可以轉(zhuǎn)錄成發(fā)夾狀雙鏈RNA，能夠與奶牛功能基因 ENTPDase6中的SEQ ID No. 2片段特異性結(jié)合，從而抑制ENTPDase6的正常表達(dá)，使其表達(dá)產(chǎn)物量降低，進(jìn)而抑制口蹄疫病毒的復(fù)制。該發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列的正義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 6 ；反義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 7。根據(jù)前述的SEQ ID No. 3靶序列可確定出發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列，利用合適的基因載體將該DNA序列轉(zhuǎn)染至牛細(xì)胞后可以轉(zhuǎn)錄成發(fā)夾狀雙鏈RNA，能夠與奶牛功能基因 ENTPDase6中的SEQ ID No. 3片段特異性結(jié)合，從而抑制ENTPDase6的正常表達(dá)，使其表達(dá)產(chǎn)物量降低，進(jìn)而抑制口蹄疫病毒的復(fù)制。該發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列的正義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 8 ；反義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 9。上述的各發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列可在培育轉(zhuǎn)基因抗口蹄疫病毒奶牛中的應(yīng)用。利用前述的發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列可以制備成相應(yīng)的重組質(zhì)粒。這些重組質(zhì)粒也可在培育轉(zhuǎn)基因抗口蹄疫病毒奶牛中的應(yīng)用。眾所周知，病毒的感染及致病性決定于病毒和機(jī)體兩方面。病毒基因決定著病毒的侵入與復(fù)制能力；機(jī)體則通過主動(dòng)或誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫物質(zhì)發(fā)揮抗感染作用。因此，抗病毒感染研究也應(yīng)從病毒基因和機(jī)體抗病毒基因兩個(gè)方面進(jìn)行研究。由于口蹄疫病毒存在多個(gè)血清型并且病毒本身容易容易變異，單純用疫苗來預(yù)防口蹄疫的爆發(fā)難以達(dá)到理想的效果。而從動(dòng)物機(jī)體本身入手，培育出具有抗病毒感染或復(fù)制的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是一個(gè)誘人的研究方向。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究是人類按照意愿有目的、有計(jì)劃、有根據(jù)、有預(yù)見地改變動(dòng)物的遺傳組成，是基于現(xiàn)代分子生物學(xué)和動(dòng)物胚胎和配子生物工程技術(shù)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生標(biāo)志著人們可成功應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，避開物種間雜交不育的生殖隔離，進(jìn)行基因交流，打破物種界限，突破親緣關(guān)系的限制，培育出自然界和常規(guī)育種難以產(chǎn)生的具特別優(yōu)良性狀的動(dòng)物品種。RNA干擾(RNA interference)是一種有效的基因沉默技術(shù)，可通過沉默同源病毒基因或沉默與病毒復(fù)制有關(guān)的宿主基因，抑制病毒感染，且很少出現(xiàn)副作用，因此是一個(gè)強(qiáng)有力的潛在抗病毒武器。RNAi是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，通過21-2;3bp的 dsRNA分子引起與其同源性的mRNA序列的降解過程。在抗口蹄疫病毒研究方面，RNAi也起到了重要的作用，很多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了大膽嘗試。Chen等首次將RNAi技術(shù)運(yùn)用到抗FMDV的研究當(dāng)中，其設(shè)計(jì)的靶向FMDV VPl基因的 siRNA，在BHK-21細(xì)胞中siRNA表達(dá)質(zhì)?？墒笷MDV VPl基因的表達(dá)降低80% 90%。接著又采用重組腺病毒載體表達(dá)siRNA，結(jié)果腺病毒能夠完全抑制FMDV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制；在豚鼠試驗(yàn)中，腺病毒的抑制效應(yīng)亦十分顯著。隨后又有許多不同國(guó)家的學(xué)者應(yīng)用不同的載體對(duì)FMDV不同基因進(jìn)行了干擾試驗(yàn)，都取得了一定的抗病毒效果。說明RNAi技術(shù)在抗口蹄疫病毒的研究中具有很大的潛力。然而這種干擾病毒基因的策略很容易受到病毒血清型及其易突變的影響。研究表明，F(xiàn)MDV主要以整聯(lián)蛋白為受體，包括α νβ 1、α ν β 3、α ν β 6、α ν β 8四種整聯(lián)蛋白和硫酸乙酰肝素，其中α ν是四種整聯(lián)蛋白的共同亞基。因此可利用基因敲除技術(shù)將奶牛體內(nèi)編碼整聯(lián)蛋白的基因敲除掉活著沉默掉，然后利用胚胎干細(xì)胞克隆技術(shù)培育出整聯(lián)蛋白基因缺失的奶牛胚胎干細(xì)胞，進(jìn)而培育出對(duì)口蹄疫病毒具有一定抗性的奶牛。此種抗病奶牛對(duì)口蹄疫病毒不存在血清型的差異，具有普遍的抗性，因此具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。然而對(duì)于單純依靠沉默病毒受體基因進(jìn)行抗病育種來說并還未見有取得突破性的進(jìn)展相關(guān)的報(bào)道。可能是由于受體基因本身對(duì)于動(dòng)物機(jī)體的組成成分、新陳代謝及其它生理功能有重要的作用。在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)尋找與病毒的感染、復(fù)制、組裝及釋放相關(guān)的基因?qū)共∮N極其重要，可以通過沉默或修飾這些基因來達(dá)到抗病育種的目的。最近研究表明，破壞掉ENTPDse6基因可以一定程度上抑制口蹄疫病毒在牛細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。ENTPDse6，即⑶39L2， 屬于胞外核苷三磷酸-二磷酸水解酶家族，是一種完整的可以水解膜外核苷酸的等離子膜蛋白，已經(jīng)證實(shí)在心臟、腦、肺臟、肝臟、骨骼肌及內(nèi)皮組織中都有表達(dá)。ENTPDse6可以影響宿主蛋白糖基化必須的核苷數(shù)量，而這些宿主蛋白對(duì)于FMDV的復(fù)制或其它基本產(chǎn)生步驟是必需的。故可以考慮對(duì)此基因進(jìn)行沉默改造，對(duì)抗口蹄疫育種來說無疑是種新的路徑。本發(fā)明的發(fā)明思路為RNA干擾通過21_2;3bp的dsRNA分子引起與其同源的mRNA序列的降解，是一種序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程。由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞最有效的siRNA是21-23個(gè)堿基大小、 3'端有兩個(gè)突出堿基的雙鏈RNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn)，與靶mRNA之間一個(gè)堿基錯(cuò)配都會(huì)顯著削弱基因沉默效果，并且受GC含量、自身穩(wěn)定性及其他同源序列等因素的影響。因此，通常需要利用專門的設(shè)計(jì)工具來設(shè)計(jì)siRNA，直接合成siRNA價(jià)格昂貴且不穩(wěn)定，所以根據(jù)載體需要設(shè)計(jì)合成與之互補(bǔ)的DNA，然后連接到載體上，使得操作能在DNA 水平上進(jìn)行。將合成的DNA片段連接到商品化質(zhì)粒載體上，構(gòu)建成含有與靶片斷同源DNA 片段的重組載體，然后將含有不同DNA片段的重組載體單獨(dú)或混合轉(zhuǎn)染至對(duì)口蹄疫病毒敏感的牛腎細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄后形成針對(duì)靶序列的發(fā)夾狀dsRNA。用不同血清型的口蹄疫病毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)含有重組載體的牛腎細(xì)胞對(duì)口蹄疫病毒的抵抗作用，進(jìn)而選出抗病毒效果好的RNA干擾的靶位點(diǎn)。利用商品化的質(zhì)粒載體能夠簡(jiǎn)單快捷的驗(yàn)證所干擾的ENTPDse6中靶片段對(duì)抗口蹄疫病毒的有效性，可以為后續(xù)的培育轉(zhuǎn)基因抗口蹄疫病毒奶牛的打基礎(chǔ)。本發(fā)明首先對(duì)牛的ENTPDase6基因進(jìn)行RNA干擾，篩選有效的干擾位點(diǎn)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)篩選確定出本發(fā)明的3個(gè)干擾位點(diǎn)，即在奶牛的ENTPDase6基因中分別由靶序列SEQ ID No. 1、SEQID No. 2和SEQ ID No. 3所確定的位置，能夠表現(xiàn)出較好的抗口蹄疫病毒效應(yīng)。本發(fā)明所中RNA干擾針對(duì)的是奶牛功能性基因，而非結(jié)構(gòu)性基因。實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì) ENTPDaseB基因中的這三個(gè)位置進(jìn)行干擾不會(huì)引起牛細(xì)胞的明顯損傷，因此能大大提高轉(zhuǎn)基因抗口蹄疫病毒奶牛培育的安全性和可行性。本發(fā)明所涉及的靶序列不受口蹄疫病毒血清型的限制，對(duì)多種血清型的口蹄疫病毒都有不同程度的抑制作用，并且不易受口蹄疫病毒變異性強(qiáng)特性的影響。本發(fā)明針對(duì)的是抑制口蹄疫病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程，而非病毒入侵過程。可以與沉默病毒受體基因的策略相互補(bǔ)充，加快培育轉(zhuǎn)基因抗口蹄疫病毒奶牛的進(jìn)程。本發(fā)明所用技術(shù)路線均為目前較為成熟且普遍應(yīng)用的技術(shù)，可操作性強(qiáng)。


圖 1 為 pSilencer 4. I-CMV puro 載體圖譜；圖2為重組質(zhì)粒BamH I、HindIII雙酶切及BamH I、HindIII單酶切圖；圖3為嘌呤霉素抗性條件下轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒及正常MDBK細(xì)胞圖；圖4為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒及正常MDBK細(xì)胞flfestern-blot圖譜；圖5為靶序列基因沉默后對(duì)不同血清型FMDV的抑制效果具體實(shí)施例方式本發(fā)明具體實(shí)施方式
所用材料及設(shè)備來源
1、細(xì)胞和病毒牛腎細(xì)胞(MDBK)，A型，0型，亞洲I型口蹄疫病毒。2、所用菌種和載體大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci (購(gòu)自于大連寶生物公司)，載體 pSilencer 4. I-CMV puro (購(gòu)自于吉泰生物科技有限公司)。3、工具酶和生化試劑普通質(zhì)粒小提試劑盒，氨芐青霉素，T4DNA Ligase, BamH I， HindIII，DNA Marker (均購(gòu)于 TaKaRa 公司)；脂質(zhì)體 Lipofection 2000 購(gòu)自 GIBCO 公司； 嘌呤霉素(Puromycin)購(gòu)自Amersco公司；細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM，胎牛血清購(gòu)自TBD公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口分析純。4、設(shè)備和器材GHP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SffCJ-IF超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；HH. S-I-Ni電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；MICR0CL 17微量離心機(jī)，上海迭戈生物科技有限公司；XDS-IB倒置生物顯微鏡，北京佳源興業(yè)科技有限公司；SWCJ-I⑶潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DYCP-31DN型電泳槽，北京六一儀器廠；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；JY04S-3C凝膠成像分析系統(tǒng)，北京君益東方電泳設(shè)備有限公司。美國(guó)SieIlab 二氧化碳培養(yǎng)箱，上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司；實(shí)施例1 本發(fā)明中重組載體具體構(gòu)建及制備方法1、siRNA 模板設(shè)計(jì)從GeneBank中下載牛ENTPDase6基因的mRNA序列(GeneBank登錄號(hào) ΝΜ_001045991)，利用siRNA設(shè)計(jì)軟件篩選出以下三個(gè)干擾靶片段SEQ ID No. 1 :AATGTACAGTTCTCGAAATAASEQ ID No. 2 :AAGTGCTCATGCAGAAGCTGTSEQ ID No. 3 :AAGCCAGGTCTTTCTGCTTAT根據(jù)pSilencer 4. I-CMV載體(圖1)要求，確定分別針對(duì)上述各靶序列RNA干擾序列模板，人工合成這些長(zhǎng)度為55bp的DNA序列(1)根據(jù)SEQ ID No. 1確定的發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列SEQ ID No. 4 正義鏈5 ‘ -GATCCTGTACAGTTCTCGAAATAATTCAAGAGATTATTTCGAGAACTGTACATTA-3‘SEQ ID No. 5 反義鏈5 ‘ -AGCTTAATGTACAGTTCTCGAAATAATCTCTTGAATTATTTCGAGAACTGTACAG-3‘(2)根據(jù)SEQ ID No. 2確定的發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列SEQ ID No. 6 正義鏈5 ‘ -GATCCGTGCTCATGCAGAAGCTGTTTCAAGAGAACAGCTTCTGCATGAGCACTTA-3‘SEQ ID No. 7
反義鏈5 ‘ -AGCTTAAGTGCTCATGCAGAAGCTGTTCTCTTGAAACAGCTTCTGCATGAGCACG-3‘(3)根據(jù)SEQ ID No. 3確定的發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列SEQ ID No. 8 正義鏈5 ‘ -GATCCGCCAGGTCTTTCTGCTTATTTCAAGAGA ATAAGCAGAAAGACCTGGCTTA-3‘SEQ ID No. 9 反義鏈5 ‘ -AGCTTAGCCAGGTCTTTCTGCTTATTCTCTTGAA ATAAGCAGAAAGACCTGGCG-3‘2、重組載體構(gòu)建(1)退火條件將上述合成DNA單鏈溶于退火緩沖液，使?jié)舛葹镮ng/ μ L。等體積混合，90°C 3min,37°C Ih退火，形成具有與pSilencer 4. I-CMV載體對(duì)應(yīng)的粘性末端的雙鏈 DNA。(2)連接體系取上述退火后 DNA 溶液 1 μ L, pSilencer 4. I-CMV vector 1 μ L, 10XT4DNALigase Buffer 1 μ L, T4 DNA ligase (5U/ μ L) 1 μ L, Nuclease-free Water 6 μ L，混合均勻，16°C過夜連接。3、制備培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化平板(I)LB 液體培養(yǎng)基配制(400ml) :Tryptone 4g, Yeast Extract 2g, NaCl 4g，力口 300mlddH20,充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓渭?N NaOH約80 μ L，調(diào)節(jié)PH約7. 0,加ddH20定容至 400ml。121°C，0. IMPa，高壓滅菌 20min，4°C保存?zhèn)溆谩?2)含抗生素(氨芐青霉素)的LA固體培養(yǎng)基配制GOOml) =Tryptone 4g, Yeast Extract 2g，NaCl 4g，Agra powder 4. 8g，加 300mlddH20，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，滴?5N NaOH 約80 μ L,調(diào)節(jié)PH約7. 0，加ddH20定容至400ml。121°C，0. IMPa,高壓滅菌20min,冷卻至 60°C左右，在超凈臺(tái)內(nèi)向其加入抗生素(氨芐青霉素)200 μ L，混勻后倒平板，4°C保存?zhèn)溆谩?、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α(1)將5 μ L上述連接產(chǎn)物加入50 μ L感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中，混勻，冰浴30min ；(2) 42°C熱應(yīng)激90s，然后立即冰浴;3min ；(3)加入300yL提前37°C預(yù)熱好的不含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C，150rpm搖床培養(yǎng)Ih ；(4)取200μ L(3)中LB培養(yǎng)基涂轉(zhuǎn)化平板，干燥后，37°C倒置平板培養(yǎng)約14h。(5)挑取靠近平板中部，中等大小的單個(gè)菌落接種到含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床，150rpm培養(yǎng)約14h。5、質(zhì)粒提取、雙酶切鑒定及測(cè)序(1)按照質(zhì)粒小提說明書從上述(5)中菌夜中提取質(zhì)粒，并按照50%甘油和菌液 1 1的比例于-20°C保存菌種。(2)對(duì)質(zhì)粒做BamH I，HindIII雙酶切實(shí)驗(yàn)，向滅菌的1. 5ml EP管中依次加入上述質(zhì)粒 DNA 10 μ L, BamH I 禾口 HindIII 各 1 μ L，IOXK buffer 2 μ L, ddH20 補(bǔ)足總體系至 20 μ L，混勻；37°C水浴條件下酶切2h，70°C IOmin終止酶切。
(3)對(duì)上述雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)酶切結(jié)果理想的重組質(zhì)粒送至金唯智生物公司測(cè)序。

6、重組質(zhì)粒的大量制備(1)從_20°C保存的甘油菌吸取50 μ L測(cè)序結(jié)果正確的菌液，接種到3_4mL的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600大于1. 6-1. 8。(2)取ImL的菌液于400mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600大于2. 0以上。再加入氨芐青霉素至170μ g/mL，37°C振蕩培養(yǎng)搖15h。(3)按照!Iomega Midiprep System說明書從上述菌液中提取質(zhì)粒，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｖ亟M質(zhì)粒雙酶切結(jié)果如圖2所示，泳道1-4分別為BamH LHindIII雙酶切；BamH I單酶切；HindIII單酶切；5000marker。質(zhì)粒載體全長(zhǎng)4781bp，接近5000bp ；連接片段僅為55bp (電泳圖中觀察不到)。另外質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果完全符合理論值，證明已經(jīng)成功構(gòu)建出上述重組載體。實(shí)施例2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選實(shí)驗(yàn)1、材料(1)細(xì)胞和載體MDBK 細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室保存)，重組質(zhì)粒載體 pSilencer_SEQ4、pSilencer_SEQ5、 pSilencer_SEQ6 ；(2)試劑無血清DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofection Reagent 2000均購(gòu)自GIBCO公司；嘌呤霉素(Puromycin)購(gòu)自Amersco公司；胰蛋白酶購(gòu)自Promega 公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口分析純。2、實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器材6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)Corning公司；XDS-IB倒置生物顯微鏡，北京佳源興業(yè)科技有限公司；HH. S-I-Ni電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；SWCJ-I⑶潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；細(xì)胞瓶、移液槍、EP管等常用的實(shí)驗(yàn)室器材。3、實(shí)驗(yàn)方法(1)提前Mh，將牛腎細(xì)胞按照3X IO5的密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。(2)制備轉(zhuǎn)染液在EP管中制備以下兩液，為每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量。A液不含血清的培養(yǎng)基94 μ L+上述三種重組質(zhì)粒各2 μ L，終量100 μ L，(溫育 5min)；B 液不含血清培養(yǎng)基 95 μ L+5 μ L lipofectamine 2000，終量 100 μ L。(3)輕輕混合A、B液，室溫條件下放置20min。(4)將6孔板中的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基沖洗兩遍，加入Iml無血清培養(yǎng)基。(5)將A液與B液的混合液逐滴加入孔中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板，混勻。37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中保溫6小時(shí)。(6) 6小時(shí)后，更換含有血清的完全培養(yǎng)基，在37 °C，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，
8以1 10的稀釋比例接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)板中。(7)加嘌呤霉素進(jìn)行篩選培養(yǎng)，用含嘌呤霉素終濃度為4 μ g/ml的無血清培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)Mh，然后用嘌呤霉素終濃度為3 μ g/ml的完全培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)5-6代。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，圖為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的MDBK細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況圖。經(jīng)過嘌呤霉素抗性篩選，對(duì)照組細(xì)胞已經(jīng)大部分細(xì)胞在48h內(nèi)變圓脫落，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞傳代 5-6代仍生長(zhǎng)良好。5、結(jié)論結(jié)果表明已經(jīng)成功將重組質(zhì)粒載體導(dǎo)入MDBK細(xì)胞，在有嘌呤霉素選擇壓力存在的情況下，重組質(zhì)?？梢栽诩?xì)胞內(nèi)持續(xù)存在并能穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)施例3 =SDS-PAGE 及 Western-blot 的鑒定分析1、材料(1)細(xì)胞正常MDBK細(xì)胞，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后傳至第6代的MDBK細(xì)胞。(2)試劑PBS, SDS Buffer,分離膠和濃縮膠，脫色液；抗ENTPDase6多克隆抗體，酶標(biāo)二抗 (實(shí)驗(yàn)室保存)，其它試劑均為國(guó)內(nèi)及進(jìn)口分析純。2、實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器材MICR0CL 17微量離心機(jī)，上海迭戈生物科技有限公司；LBC-20BA2電磁爐，廣東洛貝電子有限公司；WD9405B水平搖床，北京市六一儀器廠；164-5050電泳儀、電泳槽，美國(guó)BIORAD ；JY300C型轉(zhuǎn)移電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；超低溫冰箱，美國(guó)熱電公司；3、實(shí)驗(yàn)方法(1)樣品處理收集轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的第6代MDBK陽(yáng)性細(xì)胞以及正常的MDBK細(xì)胞， 以SOOrmpJmin離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌MDBK陽(yáng)性細(xì)胞3次盡量除去殘留的培養(yǎng)基。 加入IOOyL PBS重新懸浮細(xì)胞，在-80°C條件下速凍速融三次，然后加入IOOyI^XSDS Buffer [50mmol/L Tris-HCL ρΗ6· 8 ； 100mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT) ；2% SDS ；0. 溴酚藍(lán)； 10%甘油]使其充分與PBS-細(xì)胞懸浮液充分混合，煮沸l(wèi)Omin，12000rmp離心獲得上清。(2)制備12%的分離膠和5%的濃縮膠及電泳緩沖液5ml 12% 的分離膠配方:ddH20 2. 17ml ；40%膠溶液 1. 5ml ；1. 5M Tris HCl (PH 8. 8) 1.25ml ；10% SDS 50 μ L ；10% APS 25 μ L ；TEMED 2. 5 μ L05 % 的濃縮膠配方ddH20 3ml ；40 % 膠溶液 625 μ L ；0. 5Μ Tris HCl (PH 6. 8) 1. 25ml ；10% SDS 50 μ L ；10% APS 25 μ L ；TEMED 5μ L。SDS-PAGE 電泳緩沖液配方甘氨酸 4. 32g ；Tris 堿 0. 91g，10% SDS 3ml ；ddH20 定容至300ml。(3)利用微量加樣器取上述樣品20 μ L上樣，開始時(shí)以80伏電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)至120伏，繼續(xù)電泳至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部，電泳結(jié)束，取下凝膠，考馬斯亮藍(lán)[25%異丙醇(V/V)，10% (V/V)冰醋酸，0. 1% (W/V)考馬斯亮藍(lán)R-250]染色池后移出染色液，用脫色液[10% (V/V)冰醋酸，5% (V/V)乙醇]脫色，其間更換脫色液2 3次，直至脫色充分，觀察電泳情況。(4)配制 Western Blot 相關(guān)液體轉(zhuǎn)移緩沖液(IL):2. 93g 甘氨酸，5. 28g Tirs 堿，0. 37g SDS, 200ml 甲醇，ddH20 定容至IL ；免疫印跡底物溶液30ml PBST中溶解15mg DAB ( 二甲基聯(lián)苯胺)，9mg CoC12 · 6H20,10 μ L 30% 的 H2O2 混合。(5)轉(zhuǎn)膜將SDS-PAGE后的聚丙烯酰胺凝膠用去離子水沖洗后3次，平放于用轉(zhuǎn)移緩沖液預(yù)濕的硝酸纖維素(NC)膜上，除盡氣泡。在硝酸纖維素膜下和凝膠上分別放置用轉(zhuǎn)移液預(yù)濕的四張準(zhǔn)確對(duì)齊或略小于硝酸纖維素膜和凝膠大小的濾紙，置于半干式電轉(zhuǎn)移儀中，使得凝膠在負(fù)極，NC膜在正極，冰浴，橫流120mA轉(zhuǎn)印150min。(6)切取含有蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的纖維素膜，用氨基黑染色5min，再用脫色液脫色。 余下的含有檢測(cè)樣品的纖維素膜用PBST充分漂洗三次后，加入5%的脫脂奶粉過夜封閉， 然后用20ml PBST洗膜三次，加入用封閉液1 150稀釋的抗ENTPDase6多克隆抗體，25°C 作用lh。用PBST在搖床上洗膜4 5次，加入1 20000稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育lh， 用PBST漂洗3次。加入15ml底物溶液避光顯色數(shù)秒后，用去離子水終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，圖中1、2、3分別為標(biāo)準(zhǔn)蛋白、轉(zhuǎn)染重組載體的MDBK細(xì)胞蛋白、正常 MDBK細(xì)胞蛋白。目標(biāo)蛋白ENTPDase6大小為56kDa。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)論與正常MDBK相比，轉(zhuǎn)染重組載體的MDBK的ENTPDase6表達(dá)量明顯降低，說明重組載體在牛腎細(xì)胞內(nèi)能夠干擾ENTPDase6基因的正常表達(dá)，使其表達(dá)量有所降低。實(shí)施例4 攻毒及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)1、材料(1)細(xì)胞和病毒正常及轉(zhuǎn)染重組載體的MDBK細(xì)胞，BHK-21細(xì)胞，A、0、亞洲I型口蹄疫病毒(實(shí)驗(yàn)室保存)；(2)試齊[JDMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，Hanks液，其他試劑均為國(guó)內(nèi)和進(jìn)口分析純。2、實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器材96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)Corning公司；LD4-2低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)長(zhǎng)；XDS-IB倒置生物顯微鏡，北京佳源興業(yè)科技有限公司；SWCJ-I⑶潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；細(xì)胞瓶、移液槍、EP管等常用的實(shí)驗(yàn)室器材。3、實(shí)驗(yàn)方法(1)第6代MDBK陽(yáng)性細(xì)胞以及正常的MDBK細(xì)胞培養(yǎng)20-24h后，用4X102TCID50/ 孔的FMDV感染，37°C，5% CO2溫箱中孵育lh，使病毒感染細(xì)胞，對(duì)A、0、亞洲I型三個(gè)不同血清型FMDV做平行實(shí)驗(yàn)。(2)111后，以8001~1^，&^11離心收集細(xì)胞，用沖洗緩沖液(1501111 NaCl，20mM嗎啉乙磺酸酸，PH 6.0)沖洗以殺死培養(yǎng)基及細(xì)胞表面的殘留病毒，然后換以新鮮DMEM培養(yǎng)基連
續(xù)培養(yǎng)。(3)收集不同時(shí)間段的細(xì)胞培養(yǎng)上清液(病毒液)，滴定BHK-21細(xì)胞，以測(cè)定不同時(shí)間段上清液的TCID50。(4)根據(jù)Reed-Muench法測(cè)定病毒的TCID50。具體方法如下①每孔Iml已培養(yǎng)好的BHK-21細(xì)胞，37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到細(xì)胞長(zhǎng)成單層。②將上述病毒液用維持液作10倍系列稀釋，使其濃度分別為10_\10_2. . . 10_1Q。③棄去BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)液，用Hanks液洗滌3次，每孔加入不同稀釋度的病毒液1ml，每個(gè)稀釋度3-4個(gè)孔，對(duì)照孔加Iml維持液，37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中吸附lh， 吸出毒樣后補(bǔ)加Iml維持液。輕輕搖勻，37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。逐日觀察各孔的細(xì)胞病變情況，連續(xù)觀察4天。④細(xì)胞全部出現(xiàn)CPE為(++++) ；50%-70%細(xì)胞出現(xiàn)CPE為(+++) ；2%-50%細(xì)胞出現(xiàn)CPE為(++) ；25%以內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)CPE為⑴；無CPE為(-)，按Reed-Munch計(jì)算法進(jìn)行 TCID50。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，圖5㈧、5⑶、5(C)分別表示用不同血清型FMDV(A型、0型、亞洲I 型)對(duì)MDBK細(xì)胞攻毒后的不同時(shí)間細(xì)胞培養(yǎng)液的TCID50，可以反應(yīng)出MDBK細(xì)胞的排毒情況。由圖5可以看出，轉(zhuǎn)染重組載體的MDBK細(xì)胞在攻毒后的不同檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，其培養(yǎng)液中的病毒量都明顯低于正常MDBK細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)證明上述三種靶序列被干擾后能夠一定程度上抑制口蹄疫病毒在MDBK細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，在抗口蹄疫病毒轉(zhuǎn)基因奶牛培育方面有很好的應(yīng)用潛能。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)口蹄疫病毒有抑制作用的干擾靶序列，其特征在于位于奶牛功能基因 ENTPDase6mRNA上的RNA干擾靶序列，其序列為序列表中的SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.—種對(duì)口蹄疫病毒有的抑制作用的干擾靶序列，其特征在于位于奶牛功能基因 ENTPDase6 mRNA上的RNA干擾靶序列，其序列為序列表中的SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
3.—種對(duì)口蹄疫病毒有的抑制作用的干擾靶序列，其特征在于位于奶牛功能基因 ENTPDase6 mRNA上的RNA干擾靶序列，其序列為序列表中的SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列。
4.一種針對(duì)權(quán)利要求1所述核苷酸序列確定的發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列，其特征在于其正義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 4 ；反義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 5。
5.一種針對(duì)權(quán)利要求2所述核苷酸序列確定的發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列，其特征在于其正義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 6 ；其反義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 7。
6.一種針對(duì)權(quán)利要求3所述核苷酸序列確定的發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列，其特征在于其正義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 8 ；其反義鏈序列為序列表中SEQ ID No. 9。
7.利用權(quán)利要求4或5或6所述的序列制備重組質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求1至3中所述的任一序列在培育轉(zhuǎn)基因抗口蹄疫病毒奶牛中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求4至6中所述的任一對(duì)序列在培育轉(zhuǎn)基因抗口蹄疫病毒奶牛中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求7所述的重組質(zhì)粒在培育轉(zhuǎn)基因抗口蹄疫病毒奶牛中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一段對(duì)口蹄疫病毒有抑制作用的干擾靶序列。本發(fā)明的對(duì)口蹄疫病毒有抑制作用的干擾靶序列是位于奶牛功能基因ENTPDase6mRNA上的RNA干擾靶序列，其序列為序列表中的SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列。由上述的序列可分別確定出發(fā)夾狀DNA互補(bǔ)序列，利用合適的基因載體將該DNA序列轉(zhuǎn)染至牛細(xì)胞后可以轉(zhuǎn)錄成發(fā)夾狀雙鏈RNA，能夠與奶牛功能基因ENTPDase6中的SEQ ID No.1片段特異性結(jié)合，從而抑制ENTPDase6的正常表達(dá)，使其表達(dá)產(chǎn)物量降低，進(jìn)而抑制口蹄疫病毒的復(fù)制。
文檔編號(hào)C12N15/55GK102226198SQ201110113538
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者劉永生, 張 杰, 張永光, 王永錄, 陳豪泰 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所