專利名稱：一種腸道病毒ev71型鼠適應(yīng)株573及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腸道病毒EV71型鼠適應(yīng)株，具體地說，是關(guān)于一種腸道病毒EV71 型鼠適應(yīng)株573及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2008年3月，我國安徽省阜陽地區(qū)開始爆發(fā)手足口病疫情，導(dǎo)致23人死亡，3000 多人感染。之后，在北京、上海、浙江、廣東等地區(qū)也相繼有EV71感染的報道。2009年繼河南省明泉縣報道手足口病感染并有僅十例病人死亡后，相繼在山東、北京、四川、廣西、云南、甘肅、貴州等多個省市流行，患病人數(shù)和死亡人數(shù)超過2008年近兩倍。2010年我國內(nèi)地共有1，774，669個報告病例，造成905例死亡和超過2. 1萬例重癥。重癥病例多由EV71感染引起，并且高達(dá)5%的重癥死亡，致死原因主要為病毒感染引起過度的腦干腦炎。因此，控制重癥是治療手足口病、降低死亡率的關(guān)鍵。目前還沒有能預(yù)防手足口病的疫苗，引起重癥的致病機制仍不清楚，更沒有控制重癥的治療手段。因此研究EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的分子機制，揭示手足口病重癥發(fā)生的機理，將為疫苗的設(shè)計以及治療重癥提供理論依據(jù)，并對保障我國兒童的生命安全和健康成長有重要意義。手足口病的主要病原體是屬于微小病毒科(picornaviridae)中的腸病毒71型 (Enterovirus 71，EV71)和柯沙奇病毒 A16(Coxsackieviruses A16，CAV16)等，其中 EV71 是引起神經(jīng)性癥狀和死亡的主要元兇。EV71于1969年從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中首次分離確定。自1974年首次報道以來，在1975，1978，1997和1998 年在分別在保加利亞，匈牙利，馬來西亞和臺灣等國家和地區(qū)引起了不同程度的爆發(fā)，涉及數(shù)十人死亡。研制EV71病毒疫苗及藥物，有效控制手足口疫情，是目前擺在我國甚至全世界科研工作者面前的一個重大使命，但EV71研究中存在一個難題。任何一個疫苗和藥物在上市之前都必須經(jīng)過嚴(yán)格的實驗，評估安全性和有效性。這其中就包括臨床3期、臨床2期、臨床1期和進(jìn)入臨床實驗前的動物實驗。而EV71病毒具有種屬限制，即病毒對人易感，對其它動物不敏感，使得臨床前動物實驗受到制約，無法對疫苗或其它藥物的安全性和有效性進(jìn)行準(zhǔn)確的評估，阻礙了疫苗及藥物的研發(fā)。盡管在臺灣、日本等地的少數(shù)研究者已經(jīng)獲得了小鼠適應(yīng)性病毒株，但因為知識產(chǎn)權(quán)等問題，這些病毒株無法用于我國的疫苗研制。中國專利文獻(xiàn)CN :101864399A，公開了一株腸道病毒及其應(yīng)用。中國專利文獻(xiàn)CN 101906403A，公開了腸道病毒及其應(yīng)用。中國專利文獻(xiàn)CN 101717754A，公開了一株71型腸道病毒(簡稱EV71)及其應(yīng)用。該文獻(xiàn)報道的腸道病毒是通過蝕斑法分離的單克隆病毒， 該病毒株或由其生產(chǎn)的疫苗可用于預(yù)防由EV71病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是兒童的手足口病)。但是關(guān)于能有效感染實驗小鼠產(chǎn)生適應(yīng)性突變的病毒株目前還未見報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種腸道病毒EV71型鼠適應(yīng)株 573。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種腸道病毒EV71型鼠適應(yīng)株573的用途。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種以EV71型鼠適應(yīng)株573為免疫原所制備的抗體。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種抗體的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種腸道病毒EV71型鼠適應(yīng)株573， 所述的EV71型鼠適應(yīng)株573保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO V201110。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是 所述的EV71型鼠適應(yīng)株573用于評估疫苗安全性和有效性。所述的EV71型鼠適應(yīng)株573用于評估預(yù)防或者治療EV71的生物和化學(xué)藥物。所述的EV71型鼠適應(yīng)株573用于評估EV71的診斷試劑。所述的EV71型鼠適應(yīng)株573作為實驗材料在EV71病毒學(xué)研究中的應(yīng)用。所述的EV71型鼠適應(yīng)株573作為實驗材料在EV71病毒與免疫研究中的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種通過EV71型鼠適應(yīng)株 573為免疫原所制備的抗體。為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的抗體作為實驗材料在 EV71病毒學(xué)免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。本發(fā)明建立的腸道病毒EV71型鼠適應(yīng)株573通過以下方法
首先，本發(fā)明從阜陽地區(qū)手足口重癥患者中分離到了 EV71病毒株，并命名為FY573。其次，本發(fā)明通過病毒培養(yǎng)感染和實驗動物技術(shù)，獲得了 ICR小鼠適應(yīng)性毒株573 (Mouse-adapted virus strain 573,MAV573)。第三，為了進(jìn)一步確認(rèn)MAVS573基因特征，發(fā)明人對基因和氨基酸序列進(jìn)行了比對，確定突變的氨基酸位點，工程化疫苗提供改造方案。第四，本發(fā)明建立了以ICR小鼠和MAV573為基礎(chǔ)的動物感染模型。第五，本發(fā)明提供了基于MAV573或ICR小鼠和MAV573下的疫苗及各種抗病毒藥物的研發(fā)及病毒免疫學(xué)基礎(chǔ)研究的動物模型。本發(fā)明建立的腸道病毒EV71型鼠適應(yīng)株573已保藏。保藏日期2011年4月 21日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏單位地址武漢大學(xué)。保藏編號CCTCC V201110 。本發(fā)明優(yōu)點在于
1、本發(fā)明通過EV71病毒臨床株的分離、培養(yǎng)和動物感染篩選等技術(shù)手段，得到了能有效感染實驗小鼠產(chǎn)生適應(yīng)性突變的病毒株，為疫苗的研發(fā)、各種生化藥物治療的有效性評估、病毒感染機制和機體免疫反應(yīng)等基礎(chǔ)研究提供了有力的動物模型。2、本發(fā)明與原始毒株FY573比較表明該毒株不僅能在人源細(xì)胞株中培養(yǎng)，也能使鼠源細(xì)胞系發(fā)生病變，充分具備了鼠適應(yīng)能力。


圖1 人RD (人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞)和SK-N-SH(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)細(xì)胞系和鼠L929 (小鼠成纖維細(xì)胞)和NeUro-2a (小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞)分別感染EV71FY573和 EV7Imav573 48小時后與沒有感染(mock)相比，細(xì)胞病變情況的顯微鏡照片。顯微鏡放大倍數(shù)為100。圖2 人 RD 和 SK-N-SH 細(xì)胞系和鼠 L929 和 Neuro_2a 分別感染 EV7 Ify573 和 EV7 Imav573 后，病毒復(fù)制和增長情況。圖3 三日齡幼鼠感染EV71FY573、EV7Imav573病毒或細(xì)胞上清液對照(mock)后，小鼠存活情況。圖4 感染EV71MV573的幼鼠大腦組織的EV71抗原組織化學(xué)圖。圖5 感染EV71MV573的野生型C57BL/6小鼠和IFNARl基因敲除小鼠的體重變化。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細(xì)說明。本發(fā)明人經(jīng)過深入研究，從臨床樣本中分離得到病毒株FY573，該病毒基因部分序列已經(jīng)提交NCBI對外公布，基因號為HM064456. 1。該毒株能在體外感染人源細(xì)胞系，進(jìn)行培養(yǎng)擴增，得到高滴度的病毒。起初，發(fā)明人用FY573病毒接種ICR品系一日齡小鼠、三至四日后從組織分離病毒、再次接種小鼠，并沒有得到能再次感染小鼠的病毒。通過改進(jìn)試驗，將從組織分離得到的病毒經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)后再感染小鼠，循環(huán)兩輪，篩選得到了能使ICR小鼠致病的病毒株 MAVS573。進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)，與原始毒株FY573比較表明該毒株不僅能在人源細(xì)胞株中培養(yǎng)，也能使鼠源細(xì)胞系發(fā)生病變，充分具備了鼠適應(yīng)能力。進(jìn)一步，利用生物信息學(xué)手段， 發(fā)明人通過測序及序列比對，得到了鼠適應(yīng)株與母本毒株(FY573)及NCBI數(shù)據(jù)庫中兩條 human EV71 (ACJ70062. 1，ACD63041. 1)序列比對，發(fā)現(xiàn)10個全新的突變位點(見表1)。表1鼠適應(yīng)株氨基酸點突變
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒EV71型鼠適應(yīng)株573，其特征在于，所述的EV71型鼠適應(yīng)株573保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :V201110。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV71型鼠適應(yīng)株573的應(yīng)用，其特征在于用于評估疫苗安全性和有效性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV71型鼠適應(yīng)株573的應(yīng)用，其特征在于用于評估預(yù)防或者治療EV71的生物和化學(xué)藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV71型鼠適應(yīng)株573的應(yīng)用，其特征在于用于評估EV71的診斷試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV71型鼠適應(yīng)株573的應(yīng)用，其特征在于所述的EV71型鼠適應(yīng)株573作為實驗材料在EV71病毒學(xué)研究中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV71型鼠適應(yīng)株573的應(yīng)用，其特征在于所述的EV71型鼠適應(yīng)株573作為實驗材料在EV71病毒與免疫研究中的應(yīng)用。
7.一種通過權(quán)利要求1所述的EV71型鼠適應(yīng)株573為免疫原所制備的抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體的應(yīng)用，其特征在于所述的抗體作為實驗材料在EV71 病毒學(xué)免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腸道病毒EV71型鼠適應(yīng)株，所述的EV71型鼠適應(yīng)株573保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOV201110。本發(fā)明還提供了通過EV71型鼠適應(yīng)株573為免疫原所制備的抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明通過EV71病毒臨床株的分離、培養(yǎng)和動物感染篩選等技術(shù)手段，得到了能有效感染實驗小鼠產(chǎn)生適應(yīng)性突變的病毒株，為疫苗的研發(fā)、各種生化藥物治療的有效性評估、病毒感染機制和機體免疫反應(yīng)等基礎(chǔ)研究提供了有力的動物模型。本發(fā)明與原始毒株FY573比較表明該毒株不僅能在人源細(xì)胞株中培養(yǎng)，也能使鼠源細(xì)胞系發(fā)生病變，充分具備了鼠適應(yīng)能力。
文檔編號C12N7/00GK102220288SQ20111011355
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者萬俊峰, 冷啟彬, 張娜, 方鐘, 朱理業(yè), 楊春富 申請人:中國科學(xué)院上海巴斯德研究所