專利名稱：通過(guò)二基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)大腸癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存的檢測(cè)方法、探針組和診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸癌的預(yù)后領(lǐng)域，尤其涉及一種通過(guò)二基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)大腸癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存的檢測(cè)方法。本發(fā)明還涉及用于該方法的探針組及診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
大腸癌泛指發(fā)生在直腸和全部結(jié)腸(升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸)的惡性腫瘤，是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。目前，國(guó)內(nèi)大腸癌每年的新發(fā)病例約為80萬(wàn)例，每年有50萬(wàn)人死于大腸癌。由于生活條件和生活習(xí)慣的改變，大腸癌的發(fā)病率還在呈逐年上升趨勢(shì)，與上世紀(jì)90年代和70年代相比，大腸癌的發(fā)病率，在城市上升了 31. 95%，在農(nóng)村上升了 8. 51%，在全國(guó)五大城市(北京、天津、上海、武漢、哈爾濱)中，北京的大腸癌發(fā)病率最高，其次為上海；上海的大腸癌發(fā)病率正以每年4. 2%左右的速度上升。同時(shí)，大腸癌的發(fā)病平均年齡越來(lái)越低，可以預(yù)見(jiàn)，隨著人口的進(jìn)一步老齡化，老年人口的大腸癌發(fā)病率還將 大幅上升。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2005年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，早期大腸癌的五年生存率為90% ;—旦腫瘤侵犯周圍的淋巴結(jié)或者臟器，其五年生存率就降為67% ;假如腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，則其五年生存率就只有9%。但是，由于大腸癌的早期癥狀不明顯，缺乏特異性臨床表現(xiàn)，加上患者的自我保健意識(shí)較差或諱疾忌醫(yī)，因此，大腸癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷比較困難，臨床上，有60 70%以上的患者確診時(shí)已是大腸癌的中晚期，而在能夠進(jìn)行結(jié)直腸癌根治手術(shù)的II期和III期患者中，約20%和50%的患者會(huì)在術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，需要根據(jù)病情再接受化療或放療等輔助治療。但是，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，涉及到眾多基因的變化，其過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，因此，對(duì)患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)度的預(yù)測(cè)比較困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種通過(guò)二基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)大腸癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存的檢測(cè)方法，它有助于提聞大腸癌患者術(shù)后的生存率。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的通過(guò)二基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)大腸癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存的檢測(cè)方法，包括以下步驟(I)采集大腸癌患者的手術(shù)切除癌組織標(biāo)本；(2)抽提 RNA 樣本；(3)純化該RNA樣本；(4)檢測(cè)兩個(gè)探針在該RNA樣本中的表達(dá)，所述探針?lè)謩e具有如SEQ ID No :1和SEQ IDNo 2所示的序列或其互補(bǔ)鏈；(5)計(jì)算上述兩個(gè)探針中，呈高表達(dá)狀態(tài)的探針數(shù)目，并對(duì)該患者手術(shù)后的預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于上述方法的探針組。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的用于通過(guò)二基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)大腸癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存的探針組，包含有兩個(gè)探針，這兩個(gè)探針?lè)謩e具有如SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示的序列或其互補(bǔ)鏈。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于上述方法的診斷試劑盒。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的用于通過(guò)二基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)大腸癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存的診斷試劑盒，包含有上述探針組。本發(fā)明通過(guò)對(duì)兩種保護(hù)基因的檢測(cè)和聯(lián)合分析，來(lái)預(yù)測(cè)大腸癌患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)度，從而可以在術(shù)后及早篩查出復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)度較高的大腸癌患者，對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的輔助治療，以提高患者術(shù)后的生存率，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。


附圖為本發(fā)明實(shí)施例的對(duì)數(shù)生存函數(shù)曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。I.實(shí)驗(yàn)對(duì)象本實(shí)施例的研究對(duì)象選自2004年6月至12月間，在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科接受根治性手術(shù)治療，且術(shù)前檢查無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的172例II-III期結(jié)直腸癌患者。在上述所有患者均完成術(shù)后輔助治療并進(jìn)入單純隨訪期后，再進(jìn)行二次篩選，排除未接受輔助化療的II期患者29例，術(shù)后未接受或接受少于3個(gè)療程化療的患者12例，接受術(shù)后輔助放療的低位直腸癌患者15例，未獲得組織標(biāo)本的患者8例，術(shù)后采用CPT-Il作為輔助化療藥物的患者6例，研究開(kāi)始時(shí)即失訪的患者7例，最后有95例患者通過(guò)篩選，成為本實(shí)施例的研究對(duì)象。這95例患者術(shù)后病理證實(shí)均為AJCC/nCC分期II-III期，所接受的術(shù)后輔助化療方案包括不含奧沙利鉬的單藥化療方案(5-Fu/CF或卡培他濱單藥)和含奧沙利鉬的聯(lián)合化療方案(5-Fu+CF+奧沙利鉬或卡培他濱+奧沙利鉬)，且所有直腸癌患者均未接受輔助或新輔助放射治療。對(duì)這95例患者的隨訪時(shí)間為4 48個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為37個(gè)月，除在隨訪開(kāi)始后36個(gè)月內(nèi)死亡的患者，所有患者的隨訪時(shí)間至少為36個(gè)月。2.實(shí)驗(yàn)方法采集上述95例患者的手術(shù)切除癌組織標(biāo)本,用德國(guó)Qiagen公司的RNeasy MiniColumnKit,按照試劑盒的說(shuō)明，抽提RNA樣本。抽提后的RNA樣本保存在-70°C的深低溫冰箱中。用Roche Molecular Biochemicals 公司的 High Pure RNA Paraffin Kit (貨號(hào)3270289)，按照試劑盒的說(shuō)明，對(duì)抽提的RNA進(jìn)行純化。采用DASL(cDNA介導(dǎo)退火、選擇、延伸、連接反應(yīng))技術(shù)，按照illuminabeadstationDASL系統(tǒng)手冊(cè)(Illumina Doc. #11175105)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，對(duì)純化后的95個(gè)RNA樣本同時(shí)進(jìn)行502個(gè)基因的表達(dá)檢測(cè)。
對(duì)DASL分析所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用quantile (分位數(shù))標(biāo)化法，剔除2個(gè)信號(hào)較差樣本，剩余93例樣本,進(jìn)入下一步分析。選擇表達(dá)差異分?jǐn)?shù)大于13或小于-13，同時(shí)表達(dá)差異倍數(shù)大于I. 3倍的探針(共5個(gè))，進(jìn)一步進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的兩個(gè)探針，這兩個(gè)特異性探針的序列分別如SEQ ID No :1和SEQ ID No:2所示。通過(guò)ROC(受試者工作特征)曲線選擇切點(diǎn)，定義這兩個(gè)探針的高低表達(dá)，并計(jì)算各樣本中高表達(dá)的探針數(shù)。3.結(jié)果分析結(jié)合93例患者的隨訪結(jié)果，利用EpiCalc統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果(檢驗(yàn)值為14. 02，P = O. 000181)如表I所示表I趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)二基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)大腸癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)采集大腸癌患者的手術(shù)切除癌組織標(biāo)本； (2)抽提RNA樣本； (3)純化該RNA樣本； (4)檢測(cè)兩個(gè)探針在該RNA樣本中的表達(dá)，所述探針?lè)謩e具有如SEQID No 1和SEQIDNo 2所示的序列或其互補(bǔ)鏈； (5)計(jì)算上述兩個(gè)探針中，呈高表達(dá)狀態(tài)的探針數(shù)目，并對(duì)該患者手術(shù)后的預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)。
2.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟⑵中，使用RNeasyMiniColumnKit抽提RNA樣本，抽提后的RNA樣本保存在-70°C的深低溫冰箱中。
3.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中，使用HighPure RNAParaffinKit 純化 RNA 樣本。
4.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟⑷中，采用cDNA介導(dǎo)退火、選擇、延伸、連接反應(yīng)技術(shù)，檢測(cè)探針的表達(dá)。
5.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(5)中，所述預(yù)后評(píng)價(jià)包括復(fù)發(fā)率和無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間的評(píng)價(jià)。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述高表達(dá)的探針數(shù)目越多，該患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率越低，無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間越長(zhǎng)。
7.一種用于通過(guò)二基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)大腸癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存的探針組，其特征在于包含有兩個(gè)探針，該兩探針?lè)謩e具有如SEQ ID No : I和SEQ ID No 2所示的序列或其互補(bǔ)鏈。
8.一種用于通過(guò)二基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)大腸癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存的診斷試劑盒，其特征在于包含有如權(quán)利要求7所述的探針組。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)二基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)大腸癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存的檢測(cè)方法，包括步驟采集大腸癌患者的手術(shù)切除癌組織標(biāo)本；抽提RNA樣本；純化RNA樣本；檢測(cè)兩個(gè)特異性探針的表達(dá)；計(jì)算高表達(dá)探針數(shù)目，評(píng)價(jià)該患者的預(yù)后。本發(fā)明還公開(kāi)了由上述兩個(gè)探針組成的探針組，及包含該探針組的診斷試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)方法有助于提高大腸癌患者術(shù)后的生存率。在大腸癌患者接受根治性手術(shù)后，即可通過(guò)對(duì)兩個(gè)特異性探針的檢測(cè)和聯(lián)合分析，快速判斷出該患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)度，從而能夠?qū)?fù)發(fā)危險(xiǎn)度較高的患者及早地進(jìn)行輔助治療，幫助延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102766679SQ20111011350
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者彭俊杰, 徐燁, 牛振民, 王志敏, 王海豐, 蔡三軍, 黃薇 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心, 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院