專利名稱：Notch通路關(guān)鍵分子的熒光定量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，是一種基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的分子生物學(xué)方法，特別是涉及熒光定量的聚合酶鏈反應(yīng)Oi-PCR)。通過檢測Notch通路中多個關(guān)鍵分子的相對含量來反映此通路中各分子的表達情況。在合成cDNA的引物中其3’端引入11個特定的核苷酸序列可以逆轉(zhuǎn)錄mRNA，并在5’端帶一個高質(zhì)量的核苷酸序列作為標簽(亦是引物位置)與對側(cè)基因特異性引物進行Q-PCR對各種mRNA進行擴增和相對定量。在與β -Actin 的含量進行比較后，得出各種mRNA的相對含量。NOTCHl、NUMB、DLL3、GCN5L2、HDAC2、EP300、 Hes6,HeslmRNA的相對含量可反映個體在不同病理狀態(tài)下NOTCH通路的表達情況。此方法可一次性對NOTCH通路中多個關(guān)鍵分子的基因表達進行相對定量，從而反映通路中關(guān)鍵分子表達的差異性。優(yōu)化實驗條件后，構(gòu)建簡單、準確的相對定量檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
mRNAs是普遍存在于人體內(nèi)的核苷酸，其表達受到各種因素的調(diào)節(jié)。mRNA的含量對蛋白質(zhì)的合成有重要的作用。通過定量mRNA可以反映蛋白質(zhì)的合成，間接反映表現(xiàn)各種蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。NOTCH關(guān)鍵分子的差異性表達在細胞發(fā)育、腫瘤的發(fā)生、疾病進展等重要的生理、病理過程發(fā)揮了重要的作用。細胞中靜止與激活的NOTCH通路中關(guān)鍵分子 mRNAs表達譜和豐度也不同，表現(xiàn)出顯著的表達差異。而且不同的病理狀態(tài)下NOTCH通路中關(guān)鍵分子mRNAs表達也存在顯著的差異，進而在不同的疾病中發(fā)揮了重要的作用?？焖儆行У臋z測出NOTCH通路中關(guān)鍵分子的表達情況對研究各種惡性腫瘤的病理過程和分子機制有非常重要的價值。Notch信號通路是進化上十分保守的信號傳遞機制，這一通路出現(xiàn)異常往往會導(dǎo)致一些先天性疾病，現(xiàn)已證實NOTCH信號通路中關(guān)鍵分子的異常與CADASIL、Aligile綜合癥和脊髓肋骨發(fā)育不全等遺傳性疾病有關(guān)。另外，NOTCH信號通路在細胞的分化、增殖以及個體的發(fā)育起著非常重要的作用，因此在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也必定與其有關(guān)。在疾病的發(fā)生過程中快速有效的檢測NOTCH通路中關(guān)鍵分子的差異性表達對我們清楚地認識這些關(guān)鍵分子的作用是非常必要的，但是目前檢測方法由于技術(shù)缺陷、操作的繁瑣、實驗時間長、 無法標準化、需要特殊儀器、價格昂貴等情況讓實驗者面臨很大的困難。我們通過建立開放的熒光定量PCR技術(shù)平臺，結(jié)合創(chuàng)新的mRNA檢測方案，開發(fā)出全新的檢測方法。此方法依靠PCR技術(shù)的高靈敏性和熒光定量的效果，可以一次性對NOTCH通路中多個基因表達進行相對定量，檢測不同的病理狀態(tài)下NOTCH信號通路中關(guān)鍵分子的表達的差異性，并通過熒光定量的方法將結(jié)果直觀地顯示出來。NOTCH信號通路在各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，是治療多種腫瘤的潛在的靶點。通過對在體組織和體外培養(yǎng)腫瘤細胞，完成總RNA或短片段RNA的提取，并于熒光 PCR儀器上進行檢測，快速獲得結(jié)果?？偨Y(jié)以上過程可以發(fā)現(xiàn)此方法可以有效的縮短實驗時間、減少經(jīng)濟費用，試劑和儀器可開放使用。是一種檢測NOTCH通路中關(guān)鍵分子差異性表達的快速、準確、簡單的篩選技術(shù)和定量檢測技術(shù)。通過此發(fā)明可以使多種mRNA的檢測標準化，使本來很難采用統(tǒng)一常規(guī)技術(shù)檢測的一組核糖核酸可以通過標準化的核酸核酸擴增技術(shù)進行表達差異分析和定量檢測。通過芯片技術(shù)可以區(qū)分拷貝數(shù)大的mRNAs表達差異， 而Q-PCR技術(shù)可以定量檢測低拷貝的核酸片段，首先通過帶標簽的引物對所有帶多聚腺嘌呤的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過Q-PCR進行相對定量。目前，還未開發(fā)出一種準確、快速、簡單、費用低廉的測量Notch通路中關(guān)鍵分子相對含量的技術(shù)。本發(fā)明基于Q-PCR技術(shù)，通過帶標簽的引物3’端引入11個胸腺嘧啶的核苷酸，可以逆轉(zhuǎn)錄幾乎所有mRNA，并通過一套特異性引物進行Q-PCR分析，進行相對定量的檢測，解決目前對NOTCH信號通路中關(guān)鍵分子快速檢測的技術(shù)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有各種技術(shù)對腫瘤研究中檢測各種通路關(guān)鍵分子差異性表達存在的不足，包括分析耗時長、不能高通量、操作繁瑣等缺陷。提供了一種快速檢測 NOTCH通路中關(guān)鍵分子相對含量的技術(shù)，可反映機體在不同的病理狀態(tài)下NOTCH通路的不同的表達情況。逆轉(zhuǎn)錄引物SEQ ID NO. 1的5’端帶有核苷酸序列的標簽，同時引物在3’端引入11個連續(xù)的胸腺嘧啶的特異性核苷酸，可以逆轉(zhuǎn)錄幾乎所有成熟的mRNA，并通過標簽弓丨入通用引物位點進行Q-PCR分析，對mRNA的差異表達進行相對定量的檢測。帶標簽的引物SEQ ID NO. 1包含來源于玉米序列，為SEQ ID N0. 2，其3，端含有11個針對mRNA多聚腺嘌呤的特異性核苷酸序列；及用于對β _Actin、N0TCHl、NUMB、DLL3、GCN5L2、HDAC2、EP300、 Hes6、Hesl mRNA進行相對定量的1條引物，分別為特異性引物SEQ ID N0. 3、SEQ ID NO. 4、 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11在同共同引物SEQ ID NO. 2進行Q-PCR后進行定量分析。本發(fā)明第二個目的是提供一套配套mRNA檢測的擴增程序，使N0TCH1、NUMB、DLL3、 GCN5L2、HDAC2、EP300、Hes6、Hesl mRNA可同時被檢測，達到快速分析的目的，程序如下 95°C預(yù)變性;3min后；進行40個循環(huán)的擴增，95 °C變性kec，62°C退火延伸3kec并獲取熒光強度值。本發(fā)明第三個目的是提供一種用于NOTCH信號通路中關(guān)鍵分子檢測的相對定量檢測的試劑盒。試劑A 5 μ M逆轉(zhuǎn)錄引物50 μ L ；試劑B :20υ/ μ L M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶50 μ L ；試劑 C 5 X 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，200 μ L 含 dNTP 濃度為 5mM (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP) ,Tris-HCl 濃度為250mM，KCl濃度為250mM，MgCl2濃度為20mM，50nM DTT ；試劑D :2XPCR緩沖液組成， ImL 液體中包含 100U taq 酶、600nM R0X, 1 X SYBR Green I dye,2mM dNTPs (包括 dATP、 dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgS04。含引物的 PCR8 聯(lián)反應(yīng)管9條一號反應(yīng)管含有擴增人NOTCHl cDNA的混合引物。包含lXl(T3nmol SEQ ID NO. 2和lXl(T3nmol SEQ ID NO. 4。二號反應(yīng)管含有擴增人NUMB cDNA的混合引物。包含 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 2 和 1 X l(T3nmol SEQ IDN0. 5。三號反應(yīng)管含有擴增人 DLL3 cDNA 的混合引物。包含 lXl(T3nmol SEQID NO. 2 禾口 1 X l(T3nmol SEQ ID NO. 6。四號反應(yīng)管含有擴增人GCN5L2 cDNA的混合引物。包含lX10_3nmol SEQ ID Ν0· 2和1 X 10_3nmol SEQ ID NO. 7。五號反應(yīng)管含有擴增人HDAC2 cDNA的混合引物。包含1 X l(T3nmol SEQ ID Ν0· 2禾口 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 8。六號反應(yīng)管含有擴增人EP300 cDNA的混合引物。包含 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 2 禾口 1 X l(T3nmol SEQ ID NO. 9。七號反應(yīng)管含有擴增人 Hes6cDNA 的混合引物。包含 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 2 和 1 X l(T3nmolSEQ ID NO. 10。八號反應(yīng)管含有擴增人Hes6 cDNA的混合引物。包含1 X l(T3nmolSEQ ID NO. 2和1 X l(T3nmol SEQ ID NO. 11。九號反應(yīng)管含有擴增人β-ActincDNA的混合引物。包含lXl(T3nmol SEQ ID NO. 2 禾口 1 X l(T3nmol SEQ ID NO. 3。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一套用于對NOTCH信號通路中關(guān)鍵分子mRNA進行相對定量檢測的引物，及配套此檢測的一套檢測β-Actin內(nèi)對照的引物。包括一條帶標簽的逆轉(zhuǎn)錄引物SEQ ID Ν0. 1，其 3’端引入11個針對mRNA的多聚腺苷酸尾的胸腺嘧啶；一條公共引物其序列與SEQ ID NO. 1 上的一段相同為 SEQ ID N0. 2;針對 β-Actin、N0TCHl、NUMB、DLL3、GCN5L2、HDAC2、EP300、 Hes6、HeslmRNA進行相對定量的9條引物，分別為特異性引物SEQ ID N0. 3、SEQ ID NO. 4、 SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10,SEQID NO. 11。一個針對 mRNA 檢測的檢測程序，使 β _Actin、N0TCHl、NUMB、DLL3、GCN5L2、HDAC2、 EP300、Hes6、HeslmRNA可同時被檢測，達到快速分析的目的，程序如下95°C預(yù)變性!Min 后；進行40個循環(huán)的擴增，95°C變性kec，62°C退火延伸3kec并獲取熒光強度值。一種對 β -Actin、NOTCHl、NUMB、DLL3、GCN5L2、HDAC2、EP300、Hes6、HeslmRNA 進行相對定量的一套試劑盒，其特征包括1，由下述試劑組成試齊[JA :5μΜ逆轉(zhuǎn)錄引物50μ L ；試劑B :20U/ μ L M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，50 μ L ；試劑C :5Χ逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，200 μ L含dNTP濃度為5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、 dTTP)，Tris-HCl 濃度為 250mM，KCl 濃度為 250mM，MgCl2 濃度為 20mM，50nM DTT ；試劑D :2XPCR 緩沖液組成，ImL 液體中包含 100U taq 酶、600nM R0X, 1 X SYBR Green I dye,2mM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl, 40mM (NH4) 2S04、6mM MgSO4。含引物的PCR 8聯(lián)反應(yīng)管9條一號反應(yīng)管含有擴增人NOTCHlcDNA的混合引物。包含1 X l(T3nmol SEQ IDN0. 2 和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 4。二號反應(yīng)管含有擴增人NUMB cDNA的混合引物。包含lXl(T3nmol SEQ IDN0. 2 和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 5。三號反應(yīng)管含有擴增人DLL3 cDNA的混合引物。包含lXl(T3nmol SEQ IDN0. 2 和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 6。四號反應(yīng)管含有擴增人GCN5L2cDNA的混合引物。包含1 X l(T3nmol SEQ IDN0. 2 和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 7。五號反應(yīng)管含有擴增人HDAC2 cDNA的混合引物。包含lX10_3nmol SEQ IDN0. 2 和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 8。六號反應(yīng)管含有擴增人EP300 cDNA的混合引物。包含lXl(T3nmol SEQ IDN0. 2 和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 9。七號反應(yīng)管含有擴增人Hes6 cDNA的混合引物。包含lXl(T3nmol SEQ IDN0. 2 和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 10。
八號反應(yīng)管含有擴增人Hesl cDNA的混合引物。包含lX10_3nmol SEQ IDN0. 2 和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 11。九號反應(yīng)管含有擴增人β-Actin cDNA的混合引物。包含lXl(T3nmol SEQID NO. 2 禾口 1 X l(T3nmol SEQ ID NO. 3。本發(fā)明優(yōu)點NOTCH信號通路在各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，是治療多種腫瘤的潛在的靶點。已經(jīng)表明在一些先天性疾病和多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中NOTCH通路中關(guān)鍵分子出現(xiàn)mRNA表達譜的改變，通過本發(fā)明的引物設(shè)計，在逆轉(zhuǎn)錄時帶入一個良好的引物位置作為第二步核酸擴增時的引物位置。各引物的反應(yīng)溫度都進行了標準，片段反應(yīng)長度也進行了標準化，所有mRNA定量均可在相同的條件下進行，使不同實驗間具有可比性。本發(fā)明能夠建立在mRNA檢測的Q-PCR技術(shù)平臺上，不僅可以縮短實驗時間，同時可以提高開放性儀器的使用率，減少經(jīng)濟費用、提供一個全新的檢測標準和評估體系。通過體外培養(yǎng)腫瘤細胞后快速完成總RNA或短片段RNA的提取，并于熒光PCR儀器上進行檢測?？偨Y(jié)以上過程可以發(fā)現(xiàn)此方法可以有效的縮短實驗時間、減少經(jīng)濟費用，試劑和儀器可開放使用。通過優(yōu)化實驗反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，組成檢測靈敏、方便的試劑盒，為個體檢測NOTCH信號通路中關(guān)鍵分子提供可靠的檢測技術(shù)。


圖 1 為胰腺癌標本 N0TCH1、NUMB、DLL3、GCN5L2、HDAC2、EP300、Hes6、HeslmRNA 的檢測效果。圖 2 為各標本 N0TCH1、NUMB、DLL3、GCN5L2、HDAC2、EP300、Hes6、Hesl 檢測的溶解曲線。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1培養(yǎng)細胞或癌組織中加入Iml Trizol，振蕩器振蕩或移液器吸打數(shù)次混勻，放置 5min。加入氯仿200，劇烈混勻，靜置5分鐘。12000rpm離心10分鐘后，取上層液體500 μ L， 加入500 μ L異丙醇-20度放置2小時。12000rpm離心15分鐘后，棄上清液。用75%乙醇洗滌，12000rpm離心15分鐘后，棄上清液。重復(fù)洗2次后，室溫下放置10分鐘，加入DEPC 處理的水30 μ L。充分溶解，-80度保存。實施例2一種配套此方法檢測目的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄操作程序。10 μ L體系中含 1 μ LmRNA (0. 5pg_l μ g)，引物混合液試劑A 1 μ L，逆轉(zhuǎn)錄酶試劑BlyL和逆轉(zhuǎn)錄緩沖液試劑C 2 μ L(終濃度dNTP為ImM，引物為500nM，M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度為40U，Tris-HCl濃度為50mM，KCl濃度為50mM，MgCl2濃度為4mM)，加水5 μ L。逆轉(zhuǎn)錄程序為冰上放置5min， 30°C 30min，95°C 5min。逆轉(zhuǎn)錄完成后，試管內(nèi)加入90 μ L水，進行10倍的稀釋。實施例3一種檢測NOTCH通路關(guān)鍵分子mRNA的Q-PCR方法，及操作過程和反應(yīng)程序。每個項目需要進行2個重復(fù)管的檢測，每反應(yīng)管反應(yīng)系可為1(^1^-5(^1^。在1(^1^ Q-PCR體系中，首先取18 μ L稀釋后的cDNA加入空白的管中，加90 μ L的試劑D，加水72 μ L混合后，每次取出10 μ L分別加入1-9號管中(共2條管)每個管中終濃度分別為引物200ηΜ，300ηΜ R0X, 0. 5X SYBR Green I dye, Imm dNTPs,40mM Tris_HCl、40mM KCl, 20mM(NH4)2S04, 3mM MgSO4, Taq酶0. 5U。貼上貼膜，在ABI 7500上進行檢測。對cDNA擴增及定量程序如下 95°C預(yù)變性:3min后；進行40個循環(huán)，95°C變性kec，62°C退火延伸35sec(此步驟采集熒光值)。通過常規(guī)方法對各PCR管的Ct值進行分析，經(jīng)與內(nèi)對照進行比較后得出結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一條用于逆轉(zhuǎn)錄mRNA的共同引物，其特征是一條帶標簽的核苷酸序列，3’端帶11 個連續(xù)的胸腺嘧啶與mRNA的多聚腺嘌呤特異性互補，核酸序列為SEQ ID NO. 1，可用于逆轉(zhuǎn)錄 mRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對mRNA進行定量PCR的對側(cè)引物由SEQIDN0. 1內(nèi)包含一個高質(zhì)量的引物位置為SEQ ID NO. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對貝塔肌動蛋白(β-Actin)進行定量PCR的特異性引物 SEQ ID NO. 3，與人 β -Actin mRNA 一段互補。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對NOTCHlmRNA進行定量PCR的特異性引物SEQ ID NO. 4，與人 NOTCHl mRNA 一段互補。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對NumbmRNA進行定量PCR的特異性引物SEQID NO. 5， 與人NUNB mRNA 一段互補。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對DLL3mRNA進行定量PCR的特異性引物SEQID NO. 6， 與人DLL3 mRNA 一段互補。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對GCN5L2mRNA進行定量PCR的特異性引物SEQ ID NO. 7，與人 GCN5L2 mRNA 一段互補。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對HDAC2mRNA進行定量PCR的特異性引物SEQID NO. 8， 與人HDAC2 mRNA 一段互補。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對EP300mRNA進行定量PCR的特異性引物SEQID NO. 9， 與人EP300mRNA —段互補。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對Hes6mRNA進行定量PCR的特異性引物SEQ ID NO. 10，與人 Hes6mRNA —段互補。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對HeslmRNA進行定量PCR的特異性引物SEQ ID N0. 11，與人 HeslmRNA—段互補。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對mRNA進行相對定量的一套試劑盒，其特征包括1，由下述試劑組成試齊[J A :5 μ M逆轉(zhuǎn)錄弓丨物50 μ L ；試劑 B :20U/ μ L M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，50 μ L ；試劑C :5Χ逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，200 μ L含dNTP濃度為5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)， Tris-HCl 濃度為 250mM，KCl 濃度為 250mM，MgCl2 濃度為 20mM，50nM DTT ；試劑D :2XPCR緩沖液組成，ImL液體中包含 100U taq酶、600nM R0X, 1 X SYBR Green I dye,2mM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、 6mM MgSO4。含引物的PCR 8聯(lián)反應(yīng)管9條一號反應(yīng)管含有擴增人N0TCH1 cDNA的混合引物。包含1 X l(T3nmol SEQ IDN0. 2和 lXl(T3nmol SEQ ID Ν0· 4。二號反應(yīng)管含有擴增人NUMB cDNA的混合引物。包含lX10_3nmol SEQ IDN0. 2和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 5。三號反應(yīng)管含有擴增人DLL3 cDNA的混合引物。包含lXl(T3nmol SEQ IDN0. 2和 lXl(T3nmol SEQ ID Ν0· 6。四號反應(yīng)管含有擴增人GCN5L2cDNA的混合引物。包含1 X l(T3nmolSEQ IDN0. 2和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 7。五號反應(yīng)管含有擴增人HDAC2 cDNA的混合引物。包含lX10_3nmolSEQ IDN0. 2和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 8。六號反應(yīng)管含有擴增人EP300 cDNA的混合引物。包含lXl(T3nmolSEQ IDN0. 2和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 9。七號反應(yīng)管含有擴增人Hes6 cDNA的混合引物。包含lXl(T3nmolSEQ IDN0. 2和 lX10_3nmol SEQ ID NO. 10。八號反應(yīng)管含有擴增人Hesl cDNA的混合引物。包含lXl(T3nmolSEQ IDN0. 2和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 11。九號反應(yīng)管含有擴增人β-Actin cDNA的混合引物。包含lX10_3nmol SEQID NO. 2 和 lXl(T3nmol SEQ ID NO. 3。
全文摘要
本發(fā)明公開了可用于對Notch通路中關(guān)鍵分子進行相對定量檢測的一條逆轉(zhuǎn)錄引物和多條配套擴增的基因特異性引物、試劑盒。試劑盒包括試劑A5μM逆轉(zhuǎn)錄引物50μL；試劑B20U/μL M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，50μL；試劑C5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，200μL含dNTP濃度為5mM，Tris-HCl濃度為250mM，KCl濃度為250mM，MgCl2濃度為20mM，50nM DTT；試劑D2×PCR緩沖液組成，1mL液體中包含100U taq酶、600nM ROX、1×Green I dye、2mM dNTPs、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4；含引物的PCR 8聯(lián)反應(yīng)管9條。本發(fā)明所提供的整套試劑盒可一次性對NOTCH通路中多個關(guān)鍵分子NOTCH1、NUMB、DLL3、GCN5L2、HDAC2、EP300、Hes6、Hes1mRNA的mRNA表達進行相對定量，從而反映其表達的差異性。
文檔編號C12N15/11GK102226177SQ201110113299
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者周蒙滔, 楊云秀, 陳必成 申請人:周蒙滔, 楊云秀, 陳必成