一種檢測(cè)自噬信號(hào)通路的試劑、pcr檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬信號(hào)通路的試劑、PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用，本發(fā)明所述檢測(cè)試劑包括檢測(cè)AKT1基因、AMBRA1基因、APP基因、ATG10基因、ATG12基因等84個(gè)基因的PCR反應(yīng)引物和內(nèi)參GAPDH控制基因、ACTB控制基因、B2M控制基因。本發(fā)明將涉及自噬信號(hào)分子集中在一個(gè)平板上，通過(guò)做一次實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)細(xì)胞的生存狀態(tài)，與正常的肺癌、肺細(xì)胞做對(duì)比，探討自噬信號(hào)通路在腫瘤/正常細(xì)胞中的可能途徑，為研究關(guān)鍵蛋白的調(diào)控提供最直接的證據(jù)；本發(fā)明從轉(zhuǎn)錄水平快速準(zhǔn)確的找到自噬信號(hào)通路相關(guān)分子，為抗癌藥物篩選、新靶向藥物的機(jī)制探討等提供了有力的工具。
【專利說(shuō)明】—種檢測(cè)自噬信號(hào)通路的試劑、PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)自噬信號(hào)通路的試劑、PCR檢測(cè)方法及其在肺癌細(xì)胞中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞死亡分為程序性細(xì)胞死亡和壞死。程序性細(xì)胞死亡又分為2種:1型為細(xì)胞凋亡，II型為自噬性細(xì)胞死亡。自噬是胞漿大分子物質(zhì)和細(xì)胞器在膜包囊泡中降解的生物學(xué)過(guò)程，具有多種生理功能。自噬主要包括兩方面:首先抑制自噬，腫瘤細(xì)胞壞死，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)加劇，從而刺激腫瘤生長(zhǎng)；另外一方面應(yīng)激的細(xì)胞產(chǎn)生無(wú)效自噬，可加劇基因組不穩(wěn)定性，導(dǎo)致癌基因激活和腫瘤的發(fā)生。
[0003]在某些情況下，自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，即自噬性細(xì)胞死亡，許多抗腫瘤藥物都能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。有研究表明，通過(guò)小干擾RNA來(lái)抑制自噬相關(guān)基因，能加速細(xì)胞死亡，表明自噬是腫瘤對(duì)抗細(xì)胞毒藥物的一種反應(yīng)。因此，抑制自噬也可以作為一種治療腫瘤的手段。然而在某些腫瘤藥物作用下，自噬通過(guò)抑制凋亡途徑而保護(hù)腫瘤細(xì)胞；自噬也可以清除損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器從而起到保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用，即所謂的“保護(hù)性自噬”。該類自噬保護(hù)了腫瘤細(xì)胞，有利于腫瘤細(xì)胞度過(guò)惡劣的外環(huán)境，從而促使腫瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。
[0004]自噬與腫瘤的關(guān)系是近年的研究熱點(diǎn)。在肺癌傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物作用下，自噬與自噬性死亡及其調(diào)節(jié)機(jī)制還有許多不明之處。隨著自噬研究的深入有可能為肺癌及其他惡性腫瘤的治療提供新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中如何確定自噬核心信號(hào)分子的調(diào)控，如何解釋核心分子在腫瘤細(xì)胞中的變化的困難，提供了一種檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、自噬的信號(hào)通路的試劑和PCR檢測(cè)方法，本發(fā)明將涉及細(xì)胞自噬的信號(hào)分子集中在一個(gè)平板上，通過(guò)做一次實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)細(xì)胞的生存狀態(tài)，探討在肺癌細(xì)胞系中引起自噬信號(hào)通路變化的可能靶分子與靶途徑，為研究核心自噬信號(hào)蛋白的調(diào)節(jié)提供最直接的證據(jù)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0007]一種檢測(cè)細(xì)胞自噬信號(hào)通路的試劑，它包括以下引物:
[0008](I)檢測(cè)AKTl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0009]5，-CACAAACGAGGGGAGTACAT-3，；
[0010]5’-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3’ ；
[0011](2)檢測(cè)AMBRAl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0012]5，-TGGGGAGGTTAGGATTTGGG-3，；
[0013]5，-GAGCCGTAGGGTGGAAAG-3，；
[0014](3)檢測(cè)APP基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:[0015]5’-GCCCTGCGGAATTGACAA-3’ ；
[0016]5’-CCATCTGCATAGTCTGTGTCT-3’ ；
[0017](4)檢測(cè)ATGlO基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0018]5’-ATAAGATGCGACTGCTACAGG-3’ ；
[0019]5’-CAATGCTCAGCCATGATGTGA-3’ ；
[0020](5)檢測(cè)ATG12基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0021]5，-TAGAGCGAACACGAACCATC-3，；
[0022]5，-CACTGCCAAAACACTCATAGAG-3，；
[0023](6)檢測(cè)ATG16L1基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0024]5’-TCTGGGACATTCGATCAGAGA-3’ ；
[0025]5’-CCTTTCTGGGTTTAAGTCCAG-3’ ；
[0026](7)檢測(cè)ATGl6L2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0027]5’-ACCTGCGTG TCAGCAACA-3’ ；
[0028]5’-CAGCTTTGGTCCAGTCAGAA-3’ ；
[0029](8)檢測(cè)ATG3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0030]5’-GATGGCGGATGGGTAGATAC-3’ ；
[0031]5’-TCTTCACATAGTGCTGAGCAAT-3’ ；
[0032](9)檢測(cè)ATG4A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0033]5’-CAGCGAATGAACATCCTAAACC-3’ ；
[0034]5’-CAGTGGTTGTCACTTCTGG-3’ ；
[0035](10)檢測(cè)ATG4B基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0036]5’-AGTTGGCGAAGGCAAGTC-3’ ；
[0037]5’-CCACGTATCGAAGACAGCAA-3’ ；
[0038](11)檢測(cè)ATG4C基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0039]5’-ACCCCAACAATTTCTCTGAAG-3’ ；
[0040]5’-GTCCATACCAATCTCCTGCTTT-3’ 。
[0041](12)檢測(cè)ATG4D基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0042]5’-CCAGCCCACTGTGGATGT-3’ ；
[0043]5，-AAGCCCACGGTACAGCTT-3，；
[0044](13)檢測(cè)ATG5基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0045]5’-AGAAGCTGTTTCGTCCTGTG-3’ ；
[0046]5’-AGGTGTTTCCAACATTGGCT-3’ ；
[0047](14)檢測(cè)ATG7基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0048]5’-ATGATCCCTGTAACTTAGCCC-3’ ；
[0049]5，-CACGGAAGCAAACAACTTCAA-3，；
[0050](15)檢測(cè)ATG9A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0051]5’-TGTTTCTCAATGAATGGAGCCT-3’ ；
[0052]5’-AAGTTAGCGATGCCAATCCA-3’ ；
[0053](16)檢測(cè)ATG9B基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:[0054]5’-TGTGCTCACCGTCTACGA-3’ ；
[0055]5’-GGGAGGTAGTGCATGTGG-3’ ；
[0056](17)檢測(cè)BAD基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0057]5，-CCCAGAGTTTGAGCCGAGT-3，；
[0058]5’-CCCATCCCTTCGTCGTCC-3’ ；
[0059](18)檢測(cè)BAKl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0060]5’-CATCAACCGACGCTATGACT-3’ ；
[0061]5，-GTCAGGCCATGCTGGTAGA-3，；
[0062](19)檢測(cè)BAIl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0063]5’-ACAACCTGGTTCTCAGCATC-3’ ；
[0064]5’-GGACGGTCGTGTTCCTCT-3’ ；
[0065](20)檢測(cè)BCL2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0066]5’-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3’ ；
[0067]5’-TGAGCAGAGTCTTCAGAGACAGC-3’ ；
[0068](21)檢測(cè)BCL2L1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0069]5，-GACTGAATCGGAGATGGAGAC-3，；
[0070]5，-GCAGTTCAAACTCGTCGCC-3，；
[0071](22)檢測(cè)BECNl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0072]5，-ACCTCAGCCGAAGACTGAA-3，；
[0073]5’-AACAGCGTTTGTAGTTCTGAC-3’ ；
[0074](23)檢測(cè)BID基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0075]5’-ATGGACCGTAGCATCCCTC-3’ ；
[0076]5’-GTAGGTGCGTAGGTTCTGG-3’ ；
[0077](24)檢測(cè)BNIP3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0078]5’-TGAGTCTGGACGGAGTAGCT-3’ ；
[0079]5’-CCCTGTTGGTATCTTGTGGTG-3’ ；
[0080](25)檢測(cè)CASP3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0081]5’-AGAGGGGATCGTTGTAGAAGT-3’ ；
[0082]5’-ACAGTCCAGTTCTGTACCAC-3’ ；
[0083](26)檢測(cè)CASP8基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0084]5，-TCATGGACCACAGTAACATGG-3，；
[0085]5’-AGTGAACTGAGATGTCAGCTCA-3’ ；
[0086](27)檢測(cè)⑶KNlB基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0087]5’-TAATTGGGGCTCCGGCTAAC-3’ ；
[0088]5’-TGCAGGTCGCTTCCTTATTC-3’ ；
[0089](28)檢測(cè)⑶KN2A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0090]5’-ATGGAGCCTTCGGCTGAC-3’ ；
[0091]5’-GTAACTATTCGGTGCGTTGG-3’ ；
[0092](29)檢測(cè)CLN3基因的PCR反應(yīng)引物， 其引物序列如下:[0093]5’-GCTGTCGCATCCGTTTCA-3’ ；
[0094]5’-CGATGTTGTGGAAGGTGTTC-3’ ；
[0095](30)檢測(cè)CTSB基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0096]5’-AGAGTTATGTTTACCGAGGACC-3’ ；
[0097]5’-GATGCAGATCCGGTCAGAG-3’ ；
[0098](31)檢測(cè)CTSD基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0099]5’-ATTCAGGGCGAGTACATGATC-3’ ；
[0100]5’-CGACACCTTGAGCGTGTA-3’ ；
[0101](32)檢測(cè)CTSS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0102]5’-TGTAGATGCGCGTCATCCTT-3’ ；
[0103]5’-CCAACCACAAGTACACCATGA-3’ ；
[0104](33)檢測(cè)CXCR4基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0105]5，-ACGTCAGTGA GGCAGAT-3，；
[0106]5’-GATGACTGTGGTCTTGA-3’ ；
[0107](34)檢測(cè)DAPKl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0108]5’-GAGTTTGTCGCTCCTGAGATAG-3’ ；
[0109]5’-GCTTAGTGTCTCCAAGAAATGG-3’ ；
[0110](35)檢測(cè)DRAMl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0111]5’-AGTGCTTGGATTGGTGGGAT-3’ ；
[0112]5’-GATGGACTGTAGGAGCGTGT-3’ ；
[0113](36)檢測(cè)DRAM2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0114]5’-TACGGGTGGAAGCCAATTTA-3’ ；
[0115]5’-AGCCGTGTTCGTTCATTGTT-3’ ；
[0116](37)檢測(cè)EIF2AK3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0117]5’-GGAAACGAGAGCCGGATTTAT-3’ ；
[0118]5’-ACTATGTCCATTATGGCAGCTT-3’ ；
[0119](38)檢測(cè)EIF4G1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0120]5，-AAGAGGCTCGGGACATAG-3，；
[0121]5，-GACAAAGGCACTCAAGGGAC-3，；
[0122](39)檢測(cè)ESRl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0123]5，-GAAAGGTGGGATACGAAAAGAC-3，；
[0124]5’-GCTGTTCTTCTTAGAGCGTTTG-3’ ；
[0125](40)檢測(cè)FADD [U1]基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0126]5，-AGAGAAGGAGAACGCAACAG-3，；
[0127]5’-GCTGAACCTCTTGTACCAGGT-3’ ；
[0128](41)檢測(cè)FAS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0129]5’-AGATTGTGTGATGAAGGACATG-3’ ；
[0130]5’-TGTTGCTGGTGAGTGTGCAT-3’ ；
[0131](42)檢測(cè)GAA基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:[0132]5’-TGCCCTCGCAGTATATCACA-3’ ；
[0133]5’-GAGACCCGTAGAGGTTCGC-3’ ；
[0134](43)檢測(cè)GABARAP基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0135]5’-AGAAGAGCATCCGTTCGAGA-3’ ；
[0136]5’-CCAGGTCTCCTATCCGAGCT-3’ ； [0137](44)檢測(cè)GABARAPL1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0138]5’-ATGAAGTTCCAGTACAAGGAGG-3’ ；
[0139]5’-GCTTTTGGAGCCTTCTCTACAA-3’ ；
[0140](45)檢測(cè)GABARAPL2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0141]5’-AGGTCTCAGGCTCTCAGATT-3’ ；
[0142]5’-ACAGGAAGATCGCCTTTTCAG-3’ ；
[0143](46)檢測(cè)HDACl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0144]5，-CGCCCTCACAAAGCCAAT-3，；
[0145]5’-CTGCTTGCTGTACTCCGAC-3’ ；
[0146](47)檢測(cè)HDAC6基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0147]5’-ACCCCAGTGTCCTCTATTTCT-3’ ；
[0148]5’-CCTGGTTCCAAGGCACATTG-3’ ；
[0149](48)檢測(cè)HGS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0150]5’-GAGACAGAAGTCCACGTACAC-3’ ；
[0151]5’-CGGTTGAGATACCGTGCGA-3’ ；
[0152](49)檢測(cè)HSP90AA1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0153]5’-GCTTGACCAATGACTGGGAA-3’ ；
[0154]5’-AGCTCCTCACAGTTATCCATG-3’ ；
[0155](50)檢測(cè)HSPA8基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0156]5’-ATGCCAAACGTCTGATTGGA-3’ ；
[0157]5，-AGCATCATTCACCACCATAAAGG-3，；
[0158](51)檢測(cè)HTT基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0159]5，-AGCTCACCGCTGCTAAGG-3，；
[0160]5’-ACATCCGATCTCGATTCAGAGT-3’ ；
[0161](52)檢測(cè)IFNAl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0162]5’-GCCTCGCCCTTTGCTTTAC-3’ ；
[0163]5’-CTGTGGGTCTCAGGGAGATC-3’ ；
[0164](53)檢測(cè)IGFl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0165]5’-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGG-3’ ；
[0166]5’-CGACTGCTGGAGCCATAC-3’ ；
[0167](54)檢測(cè)INS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0168]5’-GCAGCCTTTGTGAACCAACA-3’ ；
[0169]5’-CCCCGCACACTAGGTAGAG-3’ ；
[0170](55)檢測(cè)IRGM基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:[0171]5’-CCTCACCTCCTACTGAGCT-3’ ；
[0172]5’-GTTTTGGCAAGCATCACATGAT-3’ ；
[0173](56)檢測(cè)LAMPl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0174]5’-CAGATGTGTTAGTGGCACCC-3’ ；
[0175]5’-TTGGAAAGGTACGCCTGGAT-3’ ；
[0176](57)檢測(cè)MAP1LC3A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0177]5’-AACATGAGCGAGTTGGTCAA-3’ ；
[0178]5’-GCTCGTAGATGTCCGCGA-3’ ；
[0179](58)檢測(cè)MAP1LC3B基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0180]5’-AAGGCGCTTACAGCTCAAT-3’ ；
[0181]5’-CTGGGAGGCATAGACCATG-3’ ；
[0182](59)檢測(cè)MAPK14基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0183]5’-CTGTTGGACGTTTTTACACCTG-3’ ；
[0184]5’-AGACCTCGGAGAATTTGGTAG-3’ ；
[0185](60)檢測(cè)MMP2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0186]5’-GATACCCCTTTGACGGTAAGG-3’ ；
[0187]5’-CCTTCTCCCAAGGTCCATAG-3’ ；
[0188](61)檢測(cè)MTOR基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0189]5’-GCAGATTTGCCAACTATCTTCG-3’ ；
[0190]5’-CAGCGGTAAAAGTGTCCCCT-3’ ；
[0191] (62)檢測(cè)N0S3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0192]5’-TGATGGCGAAGCGAGTGAA-3’ ；
[0193]5’-ACTCATCCATACACAGGACC-3’ ；
[0194](63)檢測(cè)NPCl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0195]5’-GTCTCCGAGTACACTCCCAT-3’ ；
[0196]5，-CGCAGTAATGAAGACCAGCG-3，；
[0197](64)檢測(cè)PIK3C3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0198]5’-GTCTGGCCTAATGTAGAAGCA-3’ ；
[0199]5’-GGCAAGACGGCTCATCTGA-3’ ；
[0200](65)檢測(cè)PIK3CG基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0201]5’-AACACCGACCTCACAGTTTT-3’ ；
[0202]5’-CTCAAGCCACACATTCCACA-3’ ；
[0203](66)檢測(cè)PIK3R4基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0204]5’-GCTCTTTAGGCAGTATGTGC-3’ ；
[0205]5’-GATGTCCCCATGACGAACTC-3’ ；
[0206](67)檢測(cè)PR0K2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0207]5’-GTGACAAGGACTCCCAATGT-3’ ；
[0208]5’-TGACCCAGATACTGACAGCA-3’ ；
[0209](68)檢測(cè)RAB24基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:[0210]5’-TCTGGGTGAAGGAACTGC-3’ ；
[0211]5’-ACTGACGTAATCCTCTGCCA-3’ ；
[0212](69)檢測(cè)RAB24基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0213]5’-TCTGGGTGAAGGAACTGC-3’ ；
[0214]5’-ACTGACGTAATCCTCTGCCA-3’ ；
[0215](70)檢測(cè)RBl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0216]5，-TTGGATCACAGCGATACAAACT-3，；
[0217]5，-AGCGCACGCCAATAAAGACA-3，；
[0218](71)檢測(cè)RGS19基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0219]5’-GGCGCAGTCTTTTGACAAG-3’ ；
[0220]5’-GCCTTCTCGTCTACCACATG-3’ ；
[0221](72)檢測(cè)RPS6KB1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0222]5’-AGAACTTCTGGCTCGAAAG-3’ ；
[0223]5’-CGACAGGTGTCTGACGTGTA-3’ ；
[0224](73)檢測(cè)SNCA基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0225]5’-AAGAGGGTGTTCTCTATGTAGG-3’ ；
[0226]5’-GCTCCTCCAACATTTGTCACT-3’ ；
[0227](74)檢測(cè)SQSTMl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0228]5’-AAGCCGGGTGGGAATGTT-3’ ；
[0229]5’-CCTGAACAGTTATCCGACTCCA-3’ ；
[0230](75)檢測(cè)TGFBl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0231]5’-GGCCAGATCCTGTCCAAG-3’ ；
[0232]5’-GTGGGTTTCCACCATTAGCA-3’ ；
[0233](76)檢測(cè)TGM2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0234]5’-CGTGACCAACTACAACTCG-3’ ；
[0235]5’-CATCCACGACTCCACCCA-3’ ；
[0236](77)檢測(cè)TMEM74基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0237]5，-AAATAACAGCGGAACGGAAAG-3，；
[0238]5’-CTTGGGACCACTCATTTGGAT-3’ ；
[0239](78)檢測(cè)TNF基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0240]5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCT-3’ ；
[0241]5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGA-3’ ；
[0242](79)檢測(cè)TNFSF10基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0243]5，-AGTGAGAGAAAGAGGTCCTCA-3，；
[0244]5’-CCAGAGCCTTTTCATTCTTGG-3’ ；
[0245](80)檢測(cè)TP53基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0246]5’-GAGGTTGGCTCTGACTGTAC-3’ ；
[0247] 5’-CCGTCCCAGTAGATTACCA-3’ ；
[0248](81)檢測(cè)ULKl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:[0249]5’-CCAGAGCAACATGATGG-3’ ；
[0250]5’-CCTTCCCGTCGTAGTGCT-3’ ；
[0251](82)檢測(cè)ULK2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0252]5’-GTGGTATTCGCATCAAAATAGC-3’ ；
[0253]5，-CACAAGTCAGCCTTAGCATCAT-3，；
[0254](83)檢測(cè)UVRAG基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0255]5’-CTTGGGTCAGCAGATTCATG-3’ ；
[0256]5’-CATCGTAAGAATTGCGAACACA-3’ ；
[0257](84)檢測(cè)WIPIl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0258]5’-AACAGGTCTATGTGCTCTCTC-3’ ；
[0259]5，-CTCATGGGCAGCAATAGTG-3，。
[0260]所述試劑還含有內(nèi)參調(diào)控基因GAPDH、ACTB, B2M的引物。
[0261]檢測(cè)GAPDH基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0262]5，-ACTGCCACC CAGAAGAC-3，；
[0263]5，-GCTCAGTGTAGCCCAGGA-3，；
[0264]檢測(cè)ACTB基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0265]5’-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3’ ；
[0266]5’-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3’ ；
[0267]檢測(cè)B2M基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0268]5’-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3’ ；
[0269]5’-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3’ 。
[0270]本發(fā)明還提供了用所述檢測(cè)試劑檢測(cè)細(xì)胞自噬信號(hào)通路的PCR檢測(cè)方法，所述PCR檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。
[0271]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為:Taq聚合酶反應(yīng)混合液10 μ I,上游引物0.2 μ mol,下游引物0.2 μ mol, cDNA模板50_100ng,滅菌蒸懼水補(bǔ)足到20 μ 10
[0272]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述Taq聚合酶為TaKaRa公司的2><SYBR?Premix Ex Taq 聚合酶。
[0273]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性，30秒；95°C變性，5 #, 600C，20秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
[0274]本發(fā)明還提供了所述的試劑在制備檢測(cè)癌細(xì)胞的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞。
[0275]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本發(fā)明提供了檢測(cè)自噬信號(hào)通路核心分子變化的試劑，借助于所述檢測(cè)試劑可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在轉(zhuǎn)錄水平快速檢測(cè)出與自噬相關(guān)的基因，在此基礎(chǔ)上分析研究腫瘤自噬信號(hào)通路的核心分子及作用機(jī)理，從而快速準(zhǔn)確的找到腫瘤相關(guān)藥物的自噬調(diào)節(jié)信號(hào)通路，為抗癌藥物篩選、新靶向藥物的機(jī)制探討等提供了有力的 工具。
[0276]同時(shí)本發(fā)明還提供了檢測(cè)的PCR方法，所述實(shí)驗(yàn)體系可以在任何一臺(tái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器上進(jìn)行，其PCR反應(yīng)儀器為羅氏公司的LightCycler480。將上述引物置于96孔板中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)?？梢酝ㄟ^(guò)一次反應(yīng)獲得關(guān)于自噬信號(hào)通路核心分子的變化。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低廉，結(jié)果重復(fù)性好，有利于減少下游不必要的檢測(cè)，是研究腫瘤相關(guān)藥物作用機(jī)理的一種重要手段。
[0277]結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0278]圖1表明了本發(fā)明利用自噬信號(hào)通路篩選出肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549與肺正常細(xì)胞系16HBE差異表達(dá)的基因，其中1:A549細(xì)胞；2:16HBE細(xì)胞。
[0279]圖2是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)自噬信號(hào)通路基因的表達(dá)。
[0280]圖3是溶解曲線分析自噬信號(hào)通路基因的表達(dá)。
[0281]圖4是肺癌/正常肺細(xì)胞中自噬信號(hào)通路基因表達(dá)的差異。
[0282]圖5是肺癌/正常肺細(xì)胞中自噬信號(hào)通路的核心基因變化通過(guò)自噬信號(hào)通路的篩選。
【具體實(shí)施方式】
[0283]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0284]實(shí)施例1
[0285]本發(fā)明通過(guò)肺癌細(xì)胞進(jìn)行舉例說(shuō)明，但是本發(fā)明并不限于肺癌，本發(fā)明所述檢測(cè)試劑可以應(yīng)用于包括乳腺癌、肺癌、肝癌等常見(jiàn)癌癥。
[0286]本發(fā)明通過(guò)培養(yǎng)兩種細(xì)胞系:人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人肺正常細(xì)胞系16HBE然后利用自噬信號(hào)通路檢測(cè)試劑檢測(cè)兩種細(xì)胞系中核心自噬分子的變化。
[0287]本發(fā)明中所用的人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人肺正常細(xì)胞系16HBE購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，用于提取總RNA的RNAiso，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，2><SYBR? Premix Ex Taq 試劑盒購(gòu)買自 TaKaRa。
[0288]利用本發(fā)明所述試劑檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬信號(hào)通路包括以下具體步驟:
[0289]一、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人肺正常細(xì)胞系16HBE的培養(yǎng)與傳代
[0290]以A549細(xì)胞為例，在60mm細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入ImL0.2%胰酶溶液，輕輕搖動(dòng)以使胰酶與細(xì)胞充分接觸，37°C二氧化碳孵箱內(nèi)孵育2min，鏡下觀察大部分細(xì)胞浮起后，加入4mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹勻后加入15mL離心管內(nèi)，2000g離心6min，棄去上清，根據(jù)細(xì)胞種類加入相應(yīng)的適當(dāng)體積培養(yǎng)液，用IOmL移液管反復(fù)吹打數(shù)次，使細(xì)胞游離。此過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，以免影響細(xì)胞計(jì)數(shù)。取細(xì)胞懸液20 μ L,滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)，按細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)量四角四大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)僅計(jì)數(shù)細(xì)胞形態(tài)完整的細(xì)胞，堆積的細(xì)胞按I個(gè)細(xì)胞計(jì)算。計(jì)算公式如下:
[0291]細(xì)胞濃度(個(gè)/mL)= (4大格細(xì)胞總數(shù))X IO4X稀釋倍數(shù)/4。
[0292]根據(jù)細(xì)胞種類用相應(yīng)的培養(yǎng)液細(xì)胞懸液稀釋至5 X IO6個(gè)/mL，在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)加入細(xì)胞，每板2mL此細(xì)胞稀釋液，置于37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞一般在0.5h-lh后貼壁，數(shù)小時(shí)后開始生長(zhǎng)，24h-48h后成為單層細(xì)胞。
[0293]二、總RNA的提取[0294]I)取CO2孵箱中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期60mm平皿的細(xì)胞一盤，吸掉培養(yǎng)液后，用無(wú)菌IXPBS清洗2次后，在細(xì)胞表面加ImL RNAiso，用槍頭反復(fù)抽吸均勻，轉(zhuǎn)入無(wú)菌管中。
[0295]2)室溫培育5min，以溶解核蛋白。加0.2mL酚/氯仿(1:1 )，劇烈振蕩15sec，室溫孵育2-3min。
[0296]3)4°C，12000g離心15min，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生分層。
[0297]4)將上層液體轉(zhuǎn)至無(wú)RNase的離心管中，加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻3次，室溫培育IOmin。
[0298]5) 4°C, 12000g 離心 IOmin, RNA 形成底部沉淀。
[0299]6)棄上清，用無(wú)RNase的75%乙醇ImL洗滌沉淀。4°C，7000g離心5min。
[0300]8)空氣中干燥RNA約5-10min。不宜太干。
[0301]9)用 30-50 μ L DEPC 水溶解 RNA。
[0302]三、cDNA的合成
[0303]I)在預(yù)冷的試管中加入下列反應(yīng)混合物:
[0304]總RNA 1-5 μ g
[0305]oligo (dT) (0.5 μ g/ μ I) IyL
[0306]用RNase-free 水定容至 12 μ L。
[0307]2)混勻，離心 3_5sec。
[0308]3) 70°C作用 5min 后冰浴 30sec,離心 3_5sec。
[0309]4)將試管冰浴，再加入如下組分:
[0310]5 X Reaction buffer 4 μ L
[0311]Rnase Inhibiter (20U/ μ L) IuL
[0312]dNTP mix(IOmM) 2μ L
[0313]5)輕輕混勻，離心3_5sec。
[0314]6) 37°C水浴 5min,加 I μ L 的 M-MuLV Reverse Transcriptase (20U/ μ L),混勻。
[0315]7) 37°C作用60min。70°C孵育IOmin結(jié)束反應(yīng)，置冰上進(jìn)行下游試驗(yàn)。
[0316]四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR
[0317]取合成好的cDNA為模板，按照以下體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng):
[0318]
2xSYBR? Premix Ex Taq10 pL
上游引物0.1 -0.2 μ mol
下游引物0.1-0.2μιηο1
cDNA 模板25-100ng
DW補(bǔ)足體積至20 μι
[0319]在羅氏的LightCycler480儀器上設(shè)置如下程序:95°C預(yù)變性，30秒；95°C變性，5秒，60°C，20秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析95°C，15秒，至65°C，I分鐘，按照4.4°C /秒進(jìn)行梯度降溫。
[0320](I)檢測(cè)AKTl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0321]5’-CACAAACGAGGGGAGTACAT-3’ ；(SEQ ID No:1)[0322]5’-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3’ ；(SEQ ID No:2)
[0323](2)檢測(cè)AMBRAl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0324]5，-TGGGGAGGTTAGGATTTGGG-3， ；(SEQ ID No:3)
[0325]5’-GAGCCGTAGGGTGGAAAG-3’ ；(SEQ ID No:4)
[0326](3)檢測(cè)APP基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0327]5’-GCCCTGCGGAATTGACAA-3’ ；(SEQ ID No:5)
[0328]5’-CCATCTGCATAGTCTGTGTCT-3’ ；(SEQ ID No:6)
[0329](4)檢測(cè)ATGlO基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0330]5’-ATAAGATGCGACTGCTACAGG-3’ ；(SEQ ID No:7)
[0331]5’-CAATGCTCAGCCATGATGTGA-3’ ；(SEQ ID No:8)
[0332](5)檢測(cè)ATG12基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0333]5’-TAGAGCGAACACGAACCATC-3’ ；(SEQ ID No:9)
[0334]5，-CACTGCCAAAACACTCATAGAG-3， ；(SEQ ID No:10)
[0335](6)檢測(cè)ATG16L1基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0336]5’-TCTGGGACATTCGATCAGAGA-3’ ；(SEQ ID No:11)
[0337]5’-CCTTTCTGGGTTTAAGTCCAG-3’ ；(SEQ ID No:12)
[0338](7)檢測(cè)ATGl6L2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0339]5’-ACCTGCGTGTCAGCAACA-3’ ；(SEQ ID No:13)
[0340]5’-CAGCTTTGGTCCAGTCAGAA-3’ ；(SEQ ID No:14)
[0341](8)檢測(cè)ATG3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0342]5’-GATGGCGGATGGGTAGATAC-3’ ；(SEQ ID No:15)
[0343]5’-TCTTCACATAGTGCTGAGCAAT-3’ ；(SEQ ID No:16)
[0344](9)檢測(cè)ATG4A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0345]5’-CAGCGAATGAACATCCTAAACC-3’ ；(SEQ ID No:17)
[0346]5’-CAGTGGTTGTCACTTCTGG-3’ ；(SEQ ID No:18)
[0347](10)檢測(cè)ATG4B基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0348]5’-AGTTGGCGAAGGCAAGTC-3’ ；(SEQ ID No:19)
[0349]5’-CCACGTATCGAAGACAGCAA-3’ ；(SEQ ID No:20)
[0350](11)檢測(cè)ATG4C基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:[0351 ]5’-ACCCCAACAATTTCTCTGAAG-3’ ；(SEQ ID No:21)
[0352]5’-GTCCATACCAATCTCCTGCTTT-3’ ；(SEQ ID No:22)
[0353](12)檢測(cè)ATG4D基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0354]5’-CCAGCCCACTGTGGATGT-3’ ；(SEQ ID No:23)
[0355]5’-AAGCCCACGGTACAGCTT-3’ ；(SEQ ID No:24)
[0356](13)檢測(cè)ATG5基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0357]5’-AGAAGCTGTTTCGTCCTGTG-3’ ；(SEQ ID No:25)
[0358]5’-AGGTGTTTCCAACATTGGCT-3’ ；(SEQ ID No:26)
[0359](14)檢測(cè)ATG7基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0360]5’-ATGATCCCTGTAACTTAGCCC-3’ ；( SEQ ID No:27)[0361]5’-CACGGAAGCAAACAACTTCAA-3’ ；(SEQ ID No:28)
[0362](15)檢測(cè)ATG9A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0363]5’-TGTTTCTCAATGAATGGAGCCT-3’ ；(SEQ ID No:29)
[0364]5’-AAGTTAGCGATGCCAATCCA-3’ ；(SEQ ID No:30)
[0365](16)檢測(cè)ATG9B基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0366]5’-TGTGCTCACCGTCTACGA-3’ ；(SEQ ID No:31)
[0367]5’-GGGAGGTAGTGCATGTGG-3’ ；(SEQ ID No:32)
[0368](17)檢測(cè)BAD基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0369]5’-CCCAGAGTTTGAGCCGAGT-3’ ；(SEQ ID No:33)
[0370]5’-CCCATCCCTTCGTCGTCC-3’ ；(SEQ ID No:34)
[0371](18)檢測(cè)BAKl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0372]5’-CATCAACCGACGCTATGACT-3’ ；(SEQ ID No:35)
[0373]5’-GTCAGGCCATGCTGGTAGA-3’ ；(SEQ ID No:36)
[0374](19)檢測(cè)BAIl 基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0375]5’-ACAACCTGGTTCTCAGCATC-3’ ；(SEQ ID No:37)
[0376]5’-GGACGGTCGTGTTCCTCT-3’ ；(SEQ ID No:38)
[0377](20)檢測(cè)BCL2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0378]5’-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3’ ；(SEQ ID No:39)
[0379]5’-TGAGCAGAGTCTTCAGAGACAGC-3’ ；(SEQ ID No:40)
[0380](21)檢測(cè)BCL2L1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0381]5’-GACTGAATCGGAGATGGAGAC-3’ ；(SEQ ID No:41)
[0382]5’-GCAGTTCAAACTCGTCGCC-3’ ；(SEQ ID No:42)
[0383](22)檢測(cè)BECNl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0384]5’-ACCTCAGCCGAAGACTGAA-3’ ；(SEQ ID No:43)
[0385]5’-AACAGCGTTTGTAGTTCTGAC-3’ ；(SEQ ID No:44)
[0386](23)檢測(cè)BID基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0387]5’-ATGGACCGTAGCATCCCTC-3’ ；(SEQ ID No:45)
[0388]5’-GTAGGTGCGTAGGTTCTGG-3’ ；(SEQ ID No:46)
[0389](24)檢測(cè)BNIP3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0390]5，-TGAGTCTGGACGGAGTAGCT-3， ；(SEQ ID No:47)
[0391]5’-CCCTGTTGGTATCTTGTGGTG-3’ ；(SEQ ID No:48)
[0392](25)檢測(cè)CASP3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0393]5’-AGAGGGGATCGTTGTAGAAGT-3’ ；(SEQ ID No:49)
[0394]5’-ACAGTCCAGTTCTGTACCAC-3’ ；(SEQ ID No:50)
[0395](26)檢測(cè)CASP8基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0396]5’-TCATGGACCACAGTAACATGG-3’ ；(SEQ ID No:51)
[0397]5’-AGTGAACTGAGATGTCAGCTCA-3’ ；(SEQ ID No:52)
[0398](27)檢測(cè)⑶KNlB基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0399]5’-TAATTGGGGCTCCGGCTAAC-3’ ；(SEQ ID No:53)[0400] 5’-TGCAGGTCGCTTCCTTATTC-3’ ；(SEQ ID No:54)
[0401](28)檢測(cè)⑶KN2A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0402]5’-ATGGAGCCTTCGGCTGAC-3’ ；(SEQ ID No:55)
[0403]5’-GTAACTATTCGGTGCGTTGG-3’ ；(SEQ ID No:56)
[0404](29)檢測(cè)CLN3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0405]5’-GCTGTCGCATCCGTTTCA-3’ ；(SEQ ID No:57)
[0406]5’-CGATGTTGTGGAAGGTGTTC-3’ ；(SEQ ID No:58)
[0407](30)檢測(cè)CTSB基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0408]5’-AGAGTTATGTTTACCGAGGACC-3’ ；(SEQ ID No:59)
[0409]5’-GATGCAGATCCGGTCAGAG-3’ ；(SEQ ID No:60)
[0410](31)檢測(cè)CTSD基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0411]5’-ATTCAGGGCGAGTACATGATC-3’ ；(SEQ ID No:61)
[0412]5’-CGACACCTTGAGCGTGTA-3’ ；(SEQ ID No:62)
[0413](32)檢測(cè)CTSS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0414]5’-TGTAGATGCGCGTCATCCTT-3’ ；(SEQ ID No:63)
[0415]5’-CCAACCACAAGTACACCATGA-3’ ；(SEQ ID No:64)
[0416](33)檢測(cè)CXCR4基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0417]5，-ACGTCAGTGAGGCAGAT-3， ；(SEQ ID No:65)
[0418]5’-GATGACTGTGGTCTTGA-3’ ；(SEQ ID No:66)
[0419](34)檢測(cè)DAPKl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0420]5’-GAGTTTGTCGCTCCTGAGATAG-3’ ；(SEQ ID No:67)
[0421]5’-GCTTAGTGTCTCCAAGAAATGG-3’ ；(SEQ ID No:68)
[0422](35)檢測(cè)DRAMl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0423]5’-AGTGCTTGGATTGGTGGGAT-3’ ；(SEQ ID No:69)
[0424]5’-GATGGACTGTAGGAGCGTGT-3’ ；(SEQ ID No:70)
[0425](36)檢測(cè)DRAM2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0426]5’-TACGGGTGGAAGCCAATTTA-3’ ；(SEQ ID No:71)
[0427]5’-AGCCGTGTTCGTTCATTGTT-3’ ；(SEQ ID No:72)
[0428](37)檢測(cè)EIF2AK3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0429]5’-GGAAACGAGAGCCGGATTTAT-3’ ；(SEQ ID No:73)
[0430]5’-ACTATGTCCATTATGGCAGCTT-3’ ；(SEQ ID No:74)
[0431](38)檢測(cè)EIF4G1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0432]5’-AAGAGGCTCGGGACATAG-3’ ；(SEQ ID No:75)
[0433]5，-GACAAAGGCACTCAAGGGAC-3，；(SEQ ID No:76)
[0434](39)檢測(cè)ESRl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0435]5，-GAAAGGTGGGATACGAAAAGAC-3， ；(SEQ ID No:77)
[0436]5’-GCTGTTCTTCTTAGAGCGTTTG-3’ ；(SEQ ID No:78)
[0437](40)檢測(cè)FADD基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0438]5’-AGAGAAGGAGAACGCAACAG-3’ ；(SEQ ID No:79)[0439]5’-GCTGAACCTCTTGTACCAGGT-3’ ；(SEQ ID No:80)
[0440](41)檢測(cè)FAS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0441 ]5’-AGATTGTGTGATGAAGGACATG-3’ ；(SEQ ID No:81)
[0442]5’-TGTTGCTGGTGAGTGTGCAT-3’ ；(SEQ ID No:82)
[0443](42)檢測(cè)GAA基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0444]5’-TGCCCTCGCAGTATATCACA-3’ ；(SEQ ID No:83) [0445]5’-GAGACCCGTAGAGGTTCGC-3’ ；(SEQ ID No:84)
[0446](43)檢測(cè)GABARAP基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0447]5’-AGAAGAGCATCCGTTCGAGA-3’ ；(SEQ ID No:85)
[0448]5’-CCAGGTCTCCTATCCGAGCT-3’ ；(SEQ ID No:86)
[0449](44)檢測(cè)GABARAPL1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0450]5’-ATGAAGTTCCAGTACAAGGAGG-3’ ；(SEQ ID No:87)
[0451]5’-GCTTTTGGAGCCTTCTCTACAA-3’ ；(SEQ ID No:88)
[0452](45)檢測(cè)GABARAPL2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0453]5’-AGGTCTCAGGCTCTCAGATT-3’ ；(SEQ ID No:89)
[0454]5’-ACAGGAAGATCGCCTTTTCAG-3’ ；(SEQ ID No:90)
[0455](46)檢測(cè)HDACl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0456]5，-CGCCCTCACAAAGCCAAT-3， ；(SEQ ID No:91)
[0457]5’-CTGCTTGCTGTACTCCGAC-3’ ；(SEQ ID No:92)
[0458](47)檢測(cè)HDAC6基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0459]5’-ACCCCAGTGTCCTCTATTTCT-3’ ；(SEQ ID No:93)
[0460]5’-CCTGGTTCCAAGGCACATTG-3’ ；(SEQ ID No:94)
[0461](48)檢測(cè)HGS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0462]5’-GAGACAGAAGTCCACGTACAC-3’ ；(SEQ ID No:95)
[0463]5’-CGGTTGAGATACCGTGCGA-3’ ；(SEQ ID No:96)
[0464](49)檢測(cè)HSP90AA1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0465]5’-GCTTGACCAATGACTGGGAA-3’ ；(SEQ ID No:97)
[0466]5’-AGCTCCTCACAGTTATCCATG-3’ ；(SEQ ID No:98)
[0467](50)檢測(cè)HSPA8基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0468]5’-ATGCCAAACGTCTGATTGGA-3’ ；(SEQ ID No:99)
[0469]5，-AGCATCATTCACCACCATAAAGG-3， ；(SEQ ID No:100)
[0470](51)檢測(cè)HTT基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0471]5，-AGCTCACCGCTGCTAAGG-3， ；(SEQ ID No:101)
[0472]5’-ACATCCGATCTCGATTCAGAGT-3’ ；(SEQ ID No:102)
[0473](52)檢測(cè)IFNAl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0474]5’-GCCTCGCCCTTTGCTTTAC-3’ ；(SEQ ID No:103)
[0475]5’-CTGTGGGTCTCAGGGAGATC-3’ ；(SEQ ID No:104)
[0476](53)檢測(cè)IGFl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0477]5’-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGG-3’ ；(SEQ ID No:105)[0478]5’-CGACTGCTGGAGCCATAC-3’ ；(SEQ ID No:106)
[0479](54)檢測(cè)INS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0480]5’-GCAGCCTTTGTGAACCAACA-3’ ；(SEQ ID No:107)
[0481]5，-CCCCGCACACTAGGTAGAG-3， ；(SEQ ID No:108)
[0482](55)檢測(cè)IRGM基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0483]5’-CCTCACCTCCTACTGAGCT-3’ ；(SEQ ID No:109)
[0484]5’-GTTTTGGCAAGCATCACATGAT-3’ ；(SEQ ID No:110)
[0485](56)檢測(cè)LAMPl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0486]5’-CAGATGTGTTAGTGGCACCC-3’ ；(SEQ ID No:111)
[0487]5’-TTGGAAAGGTACGCCTGGAT-3’ ；(SEQ ID No:112)
[0488](57)檢測(cè)MAP1LC3A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0489]5’-AACATGAGCGAGTTGGTCAA-3’ ；(SEQ ID No:113)
[0490] 5’-GCTCGTAGATGTCCGCGA-3’ ；(SEQ ID No:114)
[0491](58)檢測(cè)MAP1LC3B基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0492]5’-AAGGCGCTTACAGCTCAAT-3’ ；(SEQ ID No:115)
[0493]5，-CTGGGAGGCATAGACCATG-3， ；(SEQ ID No:116)
[0494](59)檢測(cè)MAPK14基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0495]5’-CTGTTGGACGTTTTTACACCTG-3’ ；(SEQ ID No:117)
[0496]5’-AGACCTCGGAGAATTTGGTAG-3’ ；(SEQ ID No:118)
[0497](60)檢測(cè)MMP2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0498]5’-GATACCCCTTTGACGGTAAGG-3’ ；(SEQ ID No:119)
[0499]5’-CCTTCTCCCAAGGTCCATAG-3’ ；(SEQ ID No:120)
[0500](61)檢測(cè)MTOR基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0501]5’-GCAGATTTGCCAACTATCTTCG-3’ ；(SEQ ID No:121)
[0502]5’-CAGCGGTAAAAGTGTCCCCT-3’ ；(SEQ ID No:122)
[0503](62)檢測(cè)N0S3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0504]5’-TGATGGCGAAGCGAGTGAA-3’ ；(SEQ ID No:123)
[0505]5’-ACTCATCCATACACAGGACC-3’ ；(SEQ ID No:124)
[0506](63)檢測(cè)NPCl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0507]5’-GTCTCCGAGTACACTCCCAT-3’ ；(SEQ ID No:125)
[0508]5’-CGCAGTAATGAAGACCAGCG-3’ ；(SEQ ID No:126)
[0509](64)檢測(cè)PIK3C3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0510]5’-GTCTGGCCTAATGTAGAAGCA-3’ ；(SEQ ID No:127)
[0511]5’-GGCAAGACGGCTCATCTGA-3’ ；(SEQ ID No:128)
[0512](65)檢測(cè)PIK3CG基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0513]5’-AACACCGACCTCACAGTTTT-3’ ；(SEQ ID No:129)
[0514]5’-CTCAAGCCACACATTCCACA-3’ ；(SEQ ID No:130)
[0515](66)檢測(cè)PIK3R4基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0516]5’-GCTCTTTAGGCAGTATGTGC-3’ ；(SEQ ID No:131)[0517]5’-GATGTCCCCATGACGAACTC-3’ ；(SEQ ID No:132)
[0518](67)檢測(cè)PR0K2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0519]5’-GTGACAAGGACTCCCAATGT-3’ ；(SEQ ID No:133)
[0520]5’-TGACCCAGATACTGACAGCA-3’ ；(SEQ ID No:134)
[0521](68)檢測(cè)RAB24基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0522]5’-TCTGGGTGAAGGAACTGC-3’ ；(SEQ ID No:135)
[0523]5’-ACTGACGTAATCCTCTGCCA-3’ ；(SEQ ID No:136)
[0524](69)檢測(cè)RAB24基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0525]5’-TCTGGGTGAAGGAACTGC-3’ ；(SEQ ID No:137)
[0526]5’-ACTGACGTAATCCTCTGCCA-3’ ；(SEQ ID No:138)
[0527](70)檢測(cè)RBl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0528]5’-TTGGATCACAGCGATACAAACT-3’ ；(SEQ ID No:139) [0529]5’-AGCGCACGCCAATAAAGACA-3’ ；(SEQ ID No:140)
[0530](71)檢測(cè)RGS19基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0531]5’-GGCGCAGTCTTTTGACAAG-3’ ；(SEQ ID No:141)
[0532]5’-GCCTTCTCGTCTACCACATG-3’ ；(SEQ ID No:142)
[0533](72)檢測(cè)RPS6KB1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0534]5’-AGAACTTCTGGCTCGAAAG-3’ ；(SEQ ID No:143)
[0535]5’-CGACAGGTGTCTGACGTGTA-3’ ；(SEQ ID No:144)
[0536](73)檢測(cè)SNCA基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0537]5’-AAGAGGGTGTTCTCTATGTAGG-3’ ；(SEQ ID No:145)
[0538]5’-GCTCCTCCAACATTTGTCACT-3’ ；(SEQ ID No:146)
[0539](74)檢測(cè)SQSTMl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0540]5’-AAGCCGGGTGGGAATGTT-3’ ；(SEQ ID No:147)
[0541]5’-CCTGAACAGTTATCCGACTCCA-3’ ；(SEQ ID No:148)
[0542](75)檢測(cè)TGFBl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0543]5’-GGCCAGATCCTGTCCAAG-3’ ；(SEQ ID No:149)
[0544]5’-GTGGGTTTCCACCATTAGCA-3’ ；(SEQ ID No:150)
[0545](76)檢測(cè)TGM2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0546]5’-CGTGACCAACTACAACTCG-3’ ；(SEQ ID No:151)
[0547]5’-CATCCACGACTCCACCCA-3’ ；(SEQ ID No:152)
[0548](77)檢測(cè)TMEM74基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0549]5’-AAATAACAGCGGAACGGAAAG-3’ ；(SEQ ID No:153)
[0550]5’-CTTGGGACCACTCATTTGGAT-3’ ；(SEQ ID No:154)
[0551](78)檢測(cè)TNF基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0552]5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCT-3’ ；(SEQ ID No:155)
[0553]5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGA-3’ ；(SEQ ID No:156)
[0554](79)檢測(cè)TNFSF10基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0555]5’-AGTGAGAGAAAGAGGTCCTCA-3’ ；(SEQ ID No:157)[0556]5’-CCAGAGCCTTTTCATTCTTGG-3’ ；(SEQ ID No:158)
[0557](80)檢測(cè)TP53基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0558]5’-GAGGTTGGCTCTGACTGTAC-3’ ；(SEQ ID No:159)
[0559]5’-CCGTCCCAGTAGATTACCA-3’ ；(SEQ ID No:160)
[0560](81)檢測(cè)ULKl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0561]5’-CCAGAGCAACATGATGG-3’ ；(SEQ ID No:161)
[0562]5’-CCTTCCCGTCGTAGTGCT-3’ ；(SEQ ID No:162)
[0563](82)檢測(cè)ULK2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0564]5’-GTGGTATTCGCATCAAAATAGC-3’ ；(SEQ ID No:163)
[0565]5’-CACAAGTCAGCCTTAGCATCAT-3’ ；(SEQ ID No:164)
[0566](83)檢測(cè)UVRAG基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0567]5’-CTTGGGTCAGCAGATTCATG-3’ ；(SEQ ID No:165)
[0568]5’-CATCGTAAGAATTGCGAACACA-3’ ；(SEQ ID No:166)
[0569](84)檢測(cè)WIPIl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0570]5’-AACAGGTCTATGTGCTCTCTC-3’ ；(SEQ ID No:167)
[0571]5’-CTCATGGGCAGCAATAGTG-3’ ；(SEQ ID No:168)
[0572](85)檢測(cè)GAPDH基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0573]5’-ACTGCCACCCAGAAGAC-3’ ；(SEQ ID No:169)
[0574]5’-GCTCAGTGTAGCCCAGGA-3’ ；(SEQ ID No:170)
[0575](86)檢測(cè)ACTB基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0576]5’-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3’ ；(SEQ ID No:171)
[0577]5’-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3’ ；(SEQ ID No:172)
[0578](87)檢測(cè)B2M基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:
[0579]5’-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3’ ；(SEQ ID No:173)
[0580]5’-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3’ (SEQ ID No:174)。
[0581]上述引物置于96孔板上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中每對(duì)引物置于任一孔中，共將87對(duì)引物置于87個(gè)孔中即可。
[0582]五、數(shù)據(jù)分析
[0583]利用各個(gè)基因的Ct值計(jì)算核心自噬基因的表達(dá)差異。
[0584]圖1總RNA提取后的電泳圖1:A549細(xì)胞；2:16HBE細(xì)胞，該結(jié)果提示了 A549和16HBE細(xì)胞的總RNA提取質(zhì)量良好，適合進(jìn)行下游的逆轉(zhuǎn)錄等研究。
[0585]圖2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)自噬信號(hào)通路基因的表達(dá)。該結(jié)果顯示A549和16HBE細(xì)胞的擴(kuò)增效果良好，適合做下游分析；
[0586]圖3溶解曲線分析自噬信號(hào)通路基因的表達(dá)。該結(jié)果顯示目的細(xì)胞的溶解曲線均為單峰，無(wú)引物二聚 體等非特異性擴(kuò)增，表明PCR的結(jié)果為目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0587]圖4肺癌/正常肺細(xì)胞中自噬信號(hào)通路基因表達(dá)的差異。利用點(diǎn)圖分析目的細(xì)胞中核心基因的變化，從點(diǎn)圖中可以看出，自噬信號(hào)通路的核心基因有明顯的變化。
[0588]圖5肺癌/正常肺細(xì)胞中自噬信號(hào)通路的核心基因變化通過(guò)自噬信號(hào)通路的篩選,可以篩選出與肺癌自噬發(fā)生相關(guān)的HDAC6、IGFU ATG9B、BAD、SNCA, PTEN、RAB24、TNF、HDACl、ESRl、NPCl、EIF4G1、CTSD和SQSTMl基因的mRNA水平的變化，為進(jìn)一步闡述自噬在
腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。
[0589]以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本 質(zhì) 脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)細(xì)胞自噬信號(hào)通路的試劑，其特征在于它包括以下引物:(1)檢測(cè)AKTl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-CACAAACGAGGGGAGTACAT-3，；`5，-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3，；(2)檢測(cè)AMBRAl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-TGGGGAGGTTAGGATTTGGG-3，；`5，-GAGCCGTAGGGTGGAAAG-3，；(3)檢測(cè)APP基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:5’-GCCCTGCGGAATTGACAA-3’ ；5’-CCATCTGCATAGTCTGTGTCT-3’ ；(4)檢測(cè)ATGlO基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:5’-ATAAGATGCGACTGCTACAGG-3’ ；5’-CAATGCTCAGCCATGATGTGA-3’ ；(5)檢測(cè)ATG12基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-TAGAGCGAACACGAACCATC-3，；`5，-CACTGCCAAAACACTCATAGAG-3，；(6)檢測(cè)ATG16L1基因的的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-TCTGGGACATTCGATCAGAGA-3，；5’-CCTTTCTGGGTTTAAGTCCAG-3’ ；(7)檢測(cè)ATG16L2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:5’-ACCTGCGTGTCAGCAACA-3’ ；5’-CAGCTTTGGTCCAGTCAGAA-3’ ；(8)檢測(cè)ATG3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-GATGGCGGATGGGTAGATAC-3，；5’-TCTTCACATAGTGCTGAGCAAT-3’ ；(9)檢測(cè)ATG4A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-CAGCGAATGAACATCCTAAACC-3，；`5’-CAGTGGTTGTCACTTCTGG-3’ ；(10)檢測(cè)ATG4B基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-AGTTGGCGAAGGCAAGTC-3，；`5，-CCACGTATCGAAGACAGCAA-3，；(11)檢測(cè)ATG4C基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:5’-ACCCCAACAATTTCTCTGAAG-3’ ；5’-GTCCATACCAATCTCCTGCTTT-3’ ；(12)檢測(cè)ATG4D基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:5’-CCAGCCCACTGTGGATGT-3’ ；`5，-AAGCCCACGGTACAGCTT-3，；(13)檢測(cè)ATG5基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:5’-AGAAGCTGTTTCGTCCTGTG-3’ ；.5’-AGGTGTTTCCAACATTGGCT-3’ ； (14)檢測(cè)ATG7基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-ATGATCCCTGTAACTTAGCCC-3’ ；.5，-CACGGAAGCAAACAACTTCAA-3，；(15)檢測(cè)ATG9A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-TGTTTCTCAATGAATGGAGCCT-3’ ；.5’-AAGTTAGCGATGCCAATCCA-3’ ；(16)檢測(cè)ATG9B基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-TGTGCTCACCGTCTACGA-3’ ；.5’-GGGAGGTAGTGCATGTGG-3’ ；(17)檢測(cè)BAD基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-CCCAGAGTTTGAGCCGAGT-3，；.5’-CCCATCCCTTCGTCGTCC-3’ ；(18)檢測(cè)BAKl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-CATCAACCGACGCTATGACT-3’ ；.5，-GTCAGGCCATGCTGGTAGA-3，；(19)檢測(cè)BAIl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:5’-ACAACCTGGTTCTCAGCATC-3’ ；.5’-GGACGGTCGTGTTCCTCT-3’ ；(20)檢測(cè)BCL2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:5’-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3’ ；.5’-TGAGCAGAGTCTTCAGAGACAGC-3’ ；(21)檢測(cè)BCL2L1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-GACTGAATCGGAGATGGAGAC-3，；.5，-GCAGTTCAAACTCGTCGCC-3，；(22)檢測(cè)BECNl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-ACCTCAGCCGAAGACTGAA-3，；.5’-AACAGCGTTTGTAGTTCTGAC-3’ ；(23)檢測(cè)BID基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-ATGGACCGTAGCATCCCTC-3’ ；.5’-GTAGGTGCGTAGGTTCTGG-3’ ；(24)檢測(cè)BNIP3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-TGAGTCTGGACGGAGTAGCT-3，；.5’-CCCTGTTGGTATCTTGTGGTG-3’ ；(25)檢測(cè)CASP3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-AGAGGGGATCGTTGTAGAAGT-3，；.5’-ACAGTCCAGTTCTGTACCAC-3’ ；(26)檢測(cè)CASP8基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-TCATGGACCACAGTAACATGG-3，；.5，-AGTGAACTGAGATGTCAGCTCA-3，；(27)檢測(cè)⑶KNlB基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-TAATTGGGGCTCCGGCTAAC-3，；.5’-TGCAGGTCGCTTCCTTATTC-3’ ；(28)檢測(cè)⑶KN2A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-ATGGAGCCTTCGGCTGAC-3’ ；.5’-GTAACTATTCGGTGCGTTGG-3’ ；(29)檢測(cè)CLN3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GCTGTCGCATCCGTTTCA-3’ ；.5’-CGATGTTGTGGAAGGTGTTC-3’ ；(30)檢測(cè)CTSB基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-AGAGTTATGTTTACC GAGGACC-3’ ；.5’-GATGCAGATCCGGTCAGAG-3’ ；(31)檢測(cè)CTSD基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-ATTCAGGGCGAGTACATGATC-3’ ；.5’-CGACACCTTGAGCGTGTA-3’ ；(32)檢測(cè)CTSS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-TGTAGATGCGCGTCATCCTT-3’ ；.5’-CCAACCACAAGTACACCATGA-3’ ；(33)檢測(cè)CXCR4基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-ACGTCAGTGAGGCAGAT-3，；.5’-GATGACTGTGGTCTTGA-3’ ；(34)檢測(cè)DAPKl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GAGTTTGTCGCTCCTGAGATAG-3’ ；.5’-GCTTAGTGTCTCCAAGAAATGG-3’ ；(35)檢測(cè)DRAMl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-AGTGCTTGGATTGGTGGGAT-3'；.5’-GATGGACTGTAGGAGCGTGT-3'；(36)檢測(cè)DRAM2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-TACGGGTGGAAGCCAATTTA-3’ ；.5’-AGCCGTGTTCGTTCATTGTT-3’ ；(37)檢測(cè)EIF2AK3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GGAAACGAGAGCCGGATTTAT-3’ ；.5’-ACTATGTCCATTATGGCAGCTT-3’ ；(38)檢測(cè)EIF4G1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-AAGAGGCTCGGGACATAG-3，；.5，-GACAAAGGCACTCAAGGGAC-3，；(39)檢測(cè)ESRl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-GAAAGGTGGGATACGAAAAGAC-3，；`5’-GCTGTTCTTCTTAGAGCGTTTG-3’ ；(40)檢測(cè)FADD基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-AGAGAAGGAGAACGCAACAG-3，；`5’-GCTGAACCTCTTGTACCAGGT-3’ ；(41)檢測(cè)FAS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5’-AGATTGTGTGATGAAGGACATG-3’ ；`5’-TGTTGCTGGTGAGTGTGCAT-3’ ；(42)檢測(cè)GAA基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5’-TGCCCTCGCAGTATATCACA-3’ ；`5，-GAGACCCGTAGAGGTTCGC-3，；(43)檢測(cè)GABARAP基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5’-AGAAGAGCATCCGTTCGAGA-3’ ；`5’-CCAGGTCTCCTATCCGAGCT-3’ ；(44)檢測(cè)GABARAPL1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5’-ATGAAGTTCCAGTACAAGGAGG-3’ ；`5’-GCTTTTGGAGCCTTCTCTACAA-3’ ；(45)檢測(cè)GABARAPL2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-AGGTCTCAGGCTCTCAGATT-3，；`5’-ACAGGAAGATCGCCTTTTCAG-3’ ；(46)檢測(cè)HDACl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-CGCCCTCACAAAGCCAAT-3，；`5’-CTGCTTGCTGTACTCCGAC-3’ ；(47)檢測(cè)HDAC6基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5’-ACCCCAGTGTCCTCTATTTCT-3’ ；`5’-CCTGGTTCCAAGGCACATTG-3’ ；(48)檢測(cè)HGS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5’-GAGACAGAAGTCCACGTACAC-3’ ；`5’-CGGTTGAGATACCGTGCGA-3’ ；(49)檢測(cè)HSP90AA1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5’-GCTTGACCAATGACTGGGAA-3’ ；`5’-AGCTCCTCACAGTTATCCATG-3’ ；(50)檢測(cè)HSPA8基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5’-ATGCCAAACGTCTGATTGGA-3’ ；`5，-AGCATCATTCACCACCATAAAGG-3，；(51)檢測(cè)HTT基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5，-AGCTCACCGCTGCTAAGG-3，；`5’-ACATCCGATCTCGATTCAGAGT-3’ ；(52)檢測(cè)IFNAl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:`5’-GCCTCGCCCTTTGCTTTAC-3’ ；.5’-CTGTGGGTCTCAGGGAGATC-3’ ；(53)檢測(cè)IGFl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGG-3’ ；. 5’-CGACTGCTGGAGCCATAC-3’ ；(54)檢測(cè)INS基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GCAGCCTTTGTGAACCAACA-3’ ；.5，-CCCCGCACACTAGGTAGAG-3，；(55)檢測(cè)IRGM基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-CCTCACCTCCTACTGAGCT-3’ ；.5’-GTTTTGGCAAGCATCACATGAT-3’ ；(56)檢測(cè)LAMPl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-CAGATGTGTTAGTGGCACCC-3’ ；.5，-TTGGAAAGGTACGCCTGGAT-3，；(57)檢測(cè)MAP1LC3A基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-AACATGAGCGAGTTGGTCAA-3，；.5’-GCTCGTAGATGTCCGCGA-3’ ；(58)檢測(cè)MAP1LC3B基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-AAGGCGCTTACAGCTCAAT-3，；.5，-CTGGGAGGCATAGACCATG-3，；(59)檢測(cè)MAPK14基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-CTGTTGGACGTTTTTACACCTG-3’ ；.5，-AGACCTCGGAGAATTTGGTAG-3，；(60)檢測(cè)MMP2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GATACCCCTTTGACGGTAAGG-3’ ；.5’-CCTTCTCCCAAGGTCCATAG-3’ ；(61)檢測(cè)MTOR基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GCAGATTTGCCAACTATCTTCG-3’ ；.5，-CAGCGGTAAAAGTGTCCCCT-3，；(62)檢測(cè)N0S3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-TGATGGCGAAGCGAGTGAA-3，；.5’-ACTCATCCATACACAGGACC-3’ ；(63)檢測(cè)NPCl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GTCTCCGAGTACACTCCCAT-3’ ；.5，-CGCAGTAATGAAGACCAGCG-3，；(64)檢測(cè)PIK3C3基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GTCTGGCCTAATGTAGAAGCA-3’ ；.5’-GGCAAGACGGCTCATCTGA-3’ ；(65)檢測(cè)PIK3CG基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-AACACCGACCTCACAGTTTT-3，；.5’-CTCAAGCCACACATTCCACA-3’ ；(66)檢測(cè)PIK3R4基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GCTCTTTAGGCAGTATGTGC-3’ ；.5’-GATGTCCCCATGACGAACTC-3’ ；(67)檢測(cè)PR0K2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GTGACAAGGACTCCCAATGT-3’ ；.5’-TGACCCAGATACTGACAGCA-3’ ；(68)檢測(cè)RAB24基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-TCTGGGTGAAGGAACTGC-3，；. 5’-ACTGACGTAATCCTCTGCCA-3’ ；(69)檢測(cè)RAB24基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-TCTGGGTGAAGGAACTGC-3，；.5’-ACTGACGTAATCCTCTGCCA-3’ ；(70)檢測(cè)RBl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-TTGGATCACAGCGATACAAACT-3，；.5，-AGCGCACGCCAATAAAGACA-3，；(71)檢測(cè)RGS19基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GGCGCAGTCTTTTGACAAG-3’ ；.5’-GCCTTCTCGTCTACCACATG-3’ ；(72)檢測(cè)RPS6KB1基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-AGAACTTCTGGCTCGAAAG-3，；.5’-CGACAGGTGTCTGACGTGTA-3’ ；(73)檢測(cè)SNCA基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-AAGAGGGTGTTCTCTATGTAGG-3’ ；.5’-GCTCCTCCAACATTTGTCACT-3’ ；(74)檢測(cè)SQSTMl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-AAGCCGGGTGGGAATGTT-3，；.5’-CCTGAACAGTTATCCGACTCCA-3’ ；(75)檢測(cè)TGFBl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-GGCCAGATCCTGTCCAAG-3’ ；.5’-GTGGGTTTCCACCATTAGCA-3’ ；(76)檢測(cè)TGM2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-CGTGACCAACTACAACTCG-3’ ；.5’-CATCCACGACTCCACCCA-3’ ；(77)檢測(cè)TMEM74基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5，-AAATAACAGCGGAACGGAAAG-3，；.5’-CTTGGGACCACTCATTTGGAT-3’ ；(78)檢測(cè)TNF基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCT-3’ ；. 5，-GAGGACCTGGGAGTAGATGA-3，； (79)檢測(cè)TNFSFIO基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下: . 5，-AGTGAGAGAAAGAGGTCCTCA-3，； . 5’-CCAGAGCCTTTTCATTCTTGG-3’ ； (80)檢測(cè)TP53基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下: . 5’-GAGGTTGGCTCTGACTGTAC-3’ ； . 5’-CCGTCCCAGTAGATTACCA-3’ ； (81)檢測(cè)ULKl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下: . 5’-CCAGAGCAACATGATGG-3’ ； . 5，-CCTTCCCGTCGTAGTGCT-3，； (82)檢測(cè)ULK2基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下: . 5’-GTGGTATTCGCATCAAAATAGC-3’ ； . 5，-CACAAGTCAGCCTTAGCATCAT-3，； (83)檢測(cè)UVRAG基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下: . 5’-CTTGGGTCAGCAGATTCATG-3’ ；.
5，-CATCGTAAGAATTGCGAACACA-3，； (84)檢測(cè)WIPIl基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下: . 5’-AACAGGTCTATGTGCTCTCTC-3’ ； . 5，-CTCATGGGCAGCAATAGTG-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)自噬信號(hào)通路的試劑，其特征在于:所述試劑還含有內(nèi)參調(diào)控基因GAPDH、ACTB、B2M的PCR反應(yīng)引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)自噬信號(hào)通路的試劑，其特征在于: 檢測(cè)GAPDH基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下: . 5，-ACTGCCACCCAGAAGAC-3，； . 5，-GCTCAGTGTAGCCCAGGA-3，； 檢測(cè)ACTB基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.
5’-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3’ ； . 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3’ ； 檢測(cè)B2M基因的PCR反應(yīng)引物，其引物序列如下:.
5’-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3’ ； .
5’-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3’ 。
4.利用權(quán)利要求書I所述試劑檢測(cè)自噬信號(hào)通路的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求書4所述的檢測(cè)自噬信號(hào)通路的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為:Taq聚合酶反應(yīng)混合液10 μ 1，上游引物0.2 μ mol，下游引物.0.2 μ mol, cDNA模板50_100ng,滅菌蒸懼水補(bǔ)足到20 μ I。
6.根據(jù)權(quán)利要求書5所述的檢測(cè)自噬信號(hào)通路的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述Taq聚合酶為TaKaRa公司的2><SYBR? Premix Ex Taq聚合酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求書5所述的檢測(cè)自噬信號(hào)通路的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性，30秒；95°C變性，5秒，60°C，20秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
8.權(quán)利要求1所述的試劑在制備檢測(cè)癌細(xì)胞的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑在制備檢測(cè)癌細(xì)胞的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103642927SQ201310682812
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】梁曄, 隋愛(ài)華, 劉世海, 姚如永, 徐文華, 劉相萍, 周泉 申請(qǐng)人:青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院