專利名稱：三維細胞培養(yǎng)物的生物信號的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三維細胞培養(yǎng)物的生物信號的檢測方法及用于該方法的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
細胞發(fā)揮著各種各樣的功能，具有為機體正常地發(fā)揮功能而傳遞信息的功能。作為觀察細胞的狀態(tài)、細胞所產(chǎn)生的信號、細胞對藥物等的應(yīng)答等的技術(shù)，例如有在給予細胞某種刺激后、從細胞提取DNA或蛋白質(zhì)進行分析的技術(shù)，使用熒光化合物等測定細胞所產(chǎn)生的物質(zhì)、或細胞表面或內(nèi)部存在的物質(zhì)的技術(shù)(專利文獻1)；以及在配置有電極等的細胞培養(yǎng)微陣列上培養(yǎng)細胞，同時利用光學(xué)或電化學(xué)方法觀察細胞的形狀或測量細胞電位的變化的技術(shù)(專利文獻幻等。另一方面，作為將細胞三維層疊的技術(shù)，有交替地反復(fù)形成細胞外基質(zhì)和形成細胞層，從而形成三維層疊物的技術(shù)(專利文獻3、非專利文獻1和幻，將預(yù)先培養(yǎng)成片狀的二維培養(yǎng)細胞片層疊的細胞片技術(shù)(非專利文獻幻、使用殼聚糖薄膜來層疊細胞的技術(shù) (非專利文獻4)和使包含細胞和細胞外基質(zhì)的微流體流入流路來進行層疊的技術(shù)(非專利文獻5)等?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 日本特開2007-279015號公報專利文獻2 日本特開2006-似671號公報專利文獻3 日本特開2007-2^921號公報非專利文獻非專禾Ij文獻 1 :M. Matsusaki et al. , Angew. Chem. Int. Ed. 2007,46,4689.非專禾丨J 文獻 2 :Y. Nakahara et al.，J. Biomater Sci. Polymer Edn. 2007，18， 1565.非專利文獻3 :T. Okano et al.，Circ Res. 2002,90. 40.非專利文獻4 :C. C. Co et al.，J. Am. Chem. Soc. 2005，127，1598.非專利文獻5 :ff. Tan. Et al.，Biomaterials 2004，25，1355.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明預(yù)解決的課題但是，以往的方法中，即使能夠評價細胞單獨的應(yīng)答，也無法在生物體外評價組織所進行的應(yīng)答或組織中的細胞所進行的應(yīng)答。另外，也無法確定由細胞產(chǎn)生的生物信號的擴散位置和進行定量評價。因此，本發(fā)明提供一種檢測三維細胞培養(yǎng)物的生物信號的方法。用于解決課題的手段本發(fā)明涉及一種三維細胞培養(yǎng)物的生物信號的檢測方法，其包括準備包含層疊的至少2層細胞層和能夠檢測生物信號的傳感器粒子的三維細胞培養(yǎng)物，以及對所述傳感器粒子進行光學(xué)觀察。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，例如能夠容易地檢測三維層疊的細胞培養(yǎng)物的生物信號。另外，根據(jù)本發(fā)明，還優(yōu)選獲得例如能夠在生物體外評價組織所進行的應(yīng)答或組織中的細胞所進行的應(yīng)答這樣的效果。


圖1的圖IA和B為表示本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的一個例子的示意圖
圖2A為傳感器粒子分散液的觀察照片的--個例子。
圖2B為傳感器粒子分散液的觀察照片的--個例子。
圖2C為傳感器粒子分散液的觀察照片的--個例子。
圖2D為傳感器粒子分散液的觀察照片的--個例子。
圖2E為傳感器粒子分散液的觀察照片的--個例子。
圖2F為傳感器粒子分散液的觀察照片的--個例子。
圖3A為三維細胞培養(yǎng)物的顯微鏡觀察照片的一個例子。
圖3B為三維細胞培養(yǎng)物的顯微鏡觀察照片的一個例子。
圖3C為參考例的顯微鏡觀察照片的一個例子。
圖3D為參考例的顯微鏡觀察照片的一個例子。
圖4A為三維細胞培養(yǎng)物的顯微鏡觀察照片的一個例子。
圖4B為三維細胞培養(yǎng)物中的傳感器粒子的熒光光譜的一個例子。
圖4C為參考例的細胞培養(yǎng)物的顯微鏡觀察照片的一個例子。
圖4D為參考例的細胞培養(yǎng)物中的傳感器粒子的熒光光譜的一個例子。
圖5A為實施例中制作的鈣離子應(yīng)答傳感器粒子的熒光光譜的一個例子
圖5B為實施例中制作的PH傳感器粒子的熒光光譜的一個例子。
具體實施例方式[三維細胞培養(yǎng)物的生物信號]本發(fā)明中，三維細胞培養(yǎng)物的生物信號例如是三維培養(yǎng)的細胞所產(chǎn)生的生物信號，包括構(gòu)成三維細胞培養(yǎng)物的細胞單獨或二維細胞培養(yǎng)時產(chǎn)生的生物信號、和三維細胞培養(yǎng)物的細胞所特異性地產(chǎn)生的生物信號。此外，三維細胞培養(yǎng)物的生物信號還包括作為其三維細胞培養(yǎng)物的模型對象(模擬對象)的生物組織中產(chǎn)生的生物信號。本發(fā)明基于下述見解使用包含層疊的至少2層細胞層和能夠檢測生物信號的傳感器粒子的三維細胞培養(yǎng)物，例如能夠在三維層疊的細胞培養(yǎng)物中觀察由細胞產(chǎn)生的生物信號等。即，本發(fā)明涉及一種三維細胞培養(yǎng)物的生物信號的檢測方法，其包括準備包含層疊的至少2層細胞層和能夠檢測生物信號的傳感器粒子的三維細胞培養(yǎng)物，以及對所述傳感器粒子進行光學(xué)觀察。通過本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法，能夠例如在生物組織中確定并定量地檢測特異性地產(chǎn)生的生物信號的擴散位置，由此能夠檢查三維細胞培養(yǎng)物能否形成與其生物組織同等的組織體。另外，通過發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法，還能夠例如將三維細胞培養(yǎng)物作為組織模型使用，研究各種物質(zhì)對生物組織的影響。本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法還能夠優(yōu)選發(fā)揮下述效果例如能夠成為以往的使用實驗動物的有關(guān)安全性和藥代動力學(xué)的試驗、檢查之后、給予人之前的檢查、篩選或成為使用實驗動物的試驗、檢查、篩選的替代試驗、檢查、篩選。本發(fā)明中，作為三維細胞培養(yǎng)物的生物信號發(fā)揮作用的物質(zhì)包括例如構(gòu)成三維細胞培養(yǎng)物的細胞在單獨或二維細胞培養(yǎng)時作為生物信號產(chǎn)生的物質(zhì)、由三維細胞培養(yǎng)物的細胞作為生物信號特異性地產(chǎn)生的物質(zhì)、在成為其模型對象(模擬對象)的生物組織中作為生物信號產(chǎn)生的物質(zhì)，可列舉出例如激素、自身有效物質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞增殖因子、細胞因子、生理活性物質(zhì)、酶、各種離子等。更具體而言，可列舉出例如一氧化氮(N0)、ai2+、 Ca2+、0H自由基、蛋白酪氨酸磷酸酶、活性氧、Mg2+、Cr、胱天蛋白酶、磷酸二酯酶、OCr、組胺、 多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺、過氧化氫等。[傳感器粒子]本發(fā)明中，“能夠檢測生物信號的傳感器粒子”包括例如上述的能夠檢測作為生物信號發(fā)揮作用的物質(zhì)的粒子，優(yōu)選可包括能夠與生物信號物質(zhì)特異性地反應(yīng)或結(jié)合，且通過與生物信號物質(zhì)的反應(yīng)或結(jié)合從而熒光特性等發(fā)光特性發(fā)生變化的粒子。另外，能夠檢測生物信號的傳感器粒子優(yōu)選為沒有細胞毒性的粒子。例如從能夠?qū)⒕哂袀鞲衅鞴δ艿奈镔|(zhì)局部地濃縮、和/或能夠提高定量評價的靈敏度、和/或能夠檢測局部的變化的觀點出發(fā)，傳感器粒子優(yōu)選包含具有傳感器功能的物質(zhì)和對其進行載持的載持體、更優(yōu)選在載持體內(nèi)載持有具有傳感器功能的物質(zhì)。本發(fā)明中， “具有傳感器功能的物質(zhì)”包括例如通過與作為生物信號發(fā)揮作用的物質(zhì)特異性地反應(yīng)或結(jié)合從而激發(fā)波長、熒光波長、熒光強度等熒光特性發(fā)生變化的功能性物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所要檢測的生物信號物質(zhì)的種類來適當選擇具有傳感器功能的物質(zhì)。作為能夠檢測NO的具有傳感器功能的物質(zhì)，可列舉出例如4，5-二氨基熒光素(DAF-2) (H. Kojima et al.，Anal. Chem. 1998，70，2446. )、二氨基羅丹明(DAR-4M、 DAR-4MAM) ,2,3- 二氨基萘(DAN)、二氨基花青(DAC)、DAMB0-pH等。作為能夠檢測Ca2+的具有傳感器功能的物質(zhì)，可列舉出例如1-[6_氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N' , N'-四乙酸五鉀鹽(Fura_2 (1))、 1-[2-氨基-5- (2，7- 二氯-6-羥基-3-氧代-9-咕噸基)苯氧基]-2- (2-氨基-5-甲基苯氧基)乙燒-N，N，N'，N'-四乙酸(Fluo-3 O)) (A. Takahashi et al. ,Physiol. Rev. 1999, 79,1089.)等。作為能夠檢測&ι2+的具有傳感器功能的物質(zhì)，可列舉出例如二皮考林基花青(DIPCY)、1-[2-[5-( 二甲基氨基)-1-萘亞磺酰氨基]乙基]_1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷四氫氧化物二水合物(Dansylaminoethyl-cyclen)、ZnAF-2F、ZnAF 2DA等。作為能夠檢測氯化物離子的具有傳感器功能的物質(zhì)，可列舉出例如N-乙氧基羰基甲基-6-甲氧基溴化喹啉(MQAE)等。作為能夠檢測OH自由基、過氧亞硝基陰離子的具有傳感器功能的物質(zhì)，可列舉出例如羥苯基熒光素(HPF)、氨基苯基熒光素(APF)等。關(guān)于傳感器粒子，從能夠?qū)⒕哂袀鞲衅鞴δ艿奈镔|(zhì)穩(wěn)定地載持于載持體的觀點出發(fā)，優(yōu)選在載持具有傳感器功能的物質(zhì)的載持體的表面交替地層疊堿性聚合物層和酸性聚合物層，更優(yōu)選交替地層疊多層堿性聚合物層和酸性聚合物層，進一步優(yōu)選分別包含4層以上的堿性聚合物層和酸性聚合物層，且它們交替地形成。
因此，本發(fā)明的傳感器粒子的優(yōu)選的一個實施方式是下述傳感器粒子其包含具有傳感器功能的物質(zhì)、載持具有傳感器功能的物質(zhì)的載持體、以及在所述載持體的表面交替地層疊的堿性聚合物層和酸性聚合物層，所述載持體為多孔性粒子。當為該實施方式的傳感器粒子時，由于傳感器粒子表面的電荷與后述的細胞外基質(zhì)的電相互作用，能夠?qū)鞲衅髁Ｗ臃€(wěn)定地固定在細胞外基質(zhì)，從而能夠精度更好地檢測三維細胞培養(yǎng)物的表面和內(nèi)部的生物信號。更優(yōu)選的實施方式的傳感器粒子能夠檢測細胞所產(chǎn)生的低濃度(例如納摩爾級)的生物信號。載持體表面的堿性聚合物層和酸性聚合物層可通過采用例如交替層疊(LBL)法使載持了具有傳感器功能的物質(zhì)的載持體交替地接觸堿性聚合物液和酸性聚合物液、制成多層來制作。作為堿性聚合物和酸性聚合物，優(yōu)選例如生物相容性的聚合物。作為堿性聚合物，可列舉出例如殼聚糖、甲殼素、聚賴氨酸、聚二烯丙基二甲基氯化銨等。作為酸性聚合物，可列舉出例如硫酸葡聚糖、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸等。另外，作為堿性聚合物，可以使用具有正電荷的高分子；作為酸性聚合物，可以使用具有負電荷的高分子。作為堿性聚合物與酸性聚合物的組合，可列舉出例如聚賴氨酸與硫酸葡聚糖的組合、殼聚糖與硫酸葡聚糖的組合等，其中，從生物相容性、毒性小、且能夠有效地防止具有傳感器功能的物質(zhì)的流出的觀點出發(fā)，優(yōu)選殼聚糖與硫酸葡聚糖的組合。堿性聚合物和酸性聚合物可透過生物信號物質(zhì)，優(yōu)選為生物降解性。載持體只要是能夠載持具有傳感器功能的物質(zhì)的載持體即可，優(yōu)選是能夠在載持體的內(nèi)部載持具有傳感器功能的物質(zhì)的載持體，可列舉出例如二氧化硅、氧化鋁、磷酸鈣等多孔性粒子，從提高傳感器粒子的載持穩(wěn)定性和提高檢測靈敏度的觀點出發(fā)，優(yōu)選介孔二氧化硅。從在三維細胞培養(yǎng)物中將具有傳感器功能的物質(zhì)局部地濃縮進行配置的觀點出發(fā)，傳感器粒子中的具有傳感器功能的物質(zhì)的載持量以每個傳感器粒子計優(yōu)選為0. Ipg 100 μ g、更優(yōu)選為Ipg 1 μ g。關(guān)于傳感器粒子的大小(粒徑)，雖然能夠根據(jù)細胞的大小來適當決定，但從細胞和細胞層間的大小的觀點出發(fā)，例如為5μπι以下、優(yōu)選為3μπι以下、更優(yōu)選為2μπι以下， 從充分地檢測生物信號和/或使具有傳感器功能的物質(zhì)載持的觀點出發(fā)，例如為200nm以上、優(yōu)選為500nm以上；此外，從使傳感器粒子不被攝入到細胞內(nèi)而是在細胞層間穩(wěn)定保持的觀點出發(fā)，更優(yōu)選為1 μ m以上、進一步優(yōu)選為1. 6 μ m以上。因此，傳感器粒子的大小(粒徑)從提高傳感器粒子的細胞間保持穩(wěn)定性的觀點、以及從提高具有傳感器功能的物質(zhì)的載持量的觀點出發(fā)，優(yōu)選為200nm 5 μ m、更優(yōu)選為500nm 3 μ m、進一步優(yōu)選為1 2 μ m、 更進一步優(yōu)選為1.6 2μπι。[細胞層]三維細胞培養(yǎng)物上層疊的細胞層的數(shù)目沒有特殊限制，但從使其進一步發(fā)揮與人等的生物組織同等的性質(zhì)、功能的觀點出發(fā)，優(yōu)選為3層以上、更優(yōu)選為4層以上、進一步優(yōu)選為5層以上、更進一步優(yōu)選為6層以上。層疊的細胞數(shù)的上限沒有特殊限制，例如為100 層以下、50層以下、40層以下、20層以下、10層以下等。作為三維細胞培養(yǎng)物中所含的細胞，可列舉出人和/或除人以外的動物的細胞和 /或來源于它們的細胞。作為除人以外的動物，沒有特殊限定，可列舉出例如靈長類(恒河猴等)、小鼠、大鼠、狗等。從使其進一步發(fā)揮與人的生物組織同等的性質(zhì)、功能的觀點出發(fā)，優(yōu)選人的細胞或來源于人的細胞。細胞的種類也沒有特殊限制，可列舉出肝細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞、組織干細胞、胚胎干細胞、骨細胞和免疫細胞等粘附性細胞。可以使用一種細胞，也可以使用二種以上。三維細胞培養(yǎng)物中的細胞可以為一種的細胞層，也可以為二種以上的細胞層。例如，當形成血管模型的三維細胞培養(yǎng)物時，可以考慮將最上層作為血管內(nèi)皮細胞的細胞層， 將其下的多個細胞層作為平滑肌細胞的細胞層。細胞層的組合并不限定于這些。[細胞外基質(zhì)]本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物優(yōu)選除了細胞和傳感器粒子之外還包含細胞外基質(zhì)。本發(fā)明中，細胞外基質(zhì)包括例如填充到生物體內(nèi)的細胞外的空間、發(fā)揮骨格的作用、提供支架的作用、和/或保持生物因子的作用等功能的生物體內(nèi)物質(zhì)，此外還包括在體外細胞培養(yǎng)中能夠發(fā)揮骨格的作用、提供支架的作用、和/或保持生物因子的作用等功能的物質(zhì)。本發(fā)明的細胞外基質(zhì)從形成作業(yè)的容易性、厚度調(diào)節(jié)的容易性、和三維細胞培養(yǎng)的效率化的觀點出發(fā)，優(yōu)選包含由具有RGD序列的蛋白質(zhì)或高分子(以下也稱為“具有RGD 序列的第1物質(zhì)”)和與所述具有RGD序列的第1物質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)或高分子(以下也稱為“相互作用的第2物質(zhì)”)的組合形成的物質(zhì)；或由具有正電荷的蛋白質(zhì)或高分子(以下也稱為“具有正電荷的第1物質(zhì)”)和具有負電荷的蛋白質(zhì)或高分子(以下也稱為“具有負電荷的第2物質(zhì)”)的組合形成的物質(zhì)。這里，本發(fā)明中，“相互作用”優(yōu)選是指在例如靜電相互作用、疏水性相互作用、氫鍵、電荷轉(zhuǎn)移相互作用、共價鍵形成、蛋白質(zhì)間的特異性相互作用、范德華力等的作用下，第1物質(zhì)與第2物質(zhì)以能夠發(fā)生結(jié)合、粘附、吸附或電子轉(zhuǎn)移的程度化學(xué)和/或物理地接近。(具有RGD序列的第1物質(zhì))具有RGD序列的第1物質(zhì)、即具有RGD序列的蛋白質(zhì)或高分子中的所述RGD序列是指通常所知的“Arg-Gly-Asp”序列。本發(fā)明中，“具有RGD序列”可以本來具有RGD序列，也可以RGD序列化學(xué)地結(jié)合而形成。具有RGD序列的第1物質(zhì)優(yōu)選為生物降解性的，且為水溶性的。作為具有RGD序列的蛋白質(zhì)，可列舉出例如以往公知的粘附性蛋白質(zhì)，具體而言，可列舉出纖連蛋白、波基結(jié)合素、層粘連蛋白、鈣黏著蛋白、膠原等。另外，具有RGD序列的蛋白質(zhì)還可以為例如使RGD序列結(jié)合形成的膠原、明膠、白蛋白、球蛋白、蛋白聚糖、酶、抗體等。作為具有RGD序列的高分子，可列舉出例如天然來源的高分子和合成高分子。作為具有 RGD序列的天然來源的高分子，可列舉出例如水溶性多肽、低分子肽、聚賴氨酸等聚氨基酸、 聚酯、甲殼素或殼聚糖等糖、聚氨酯、聚碳酸酯、聚酰胺、和它們的共聚物等。作為具有RGD 序列的合成高分子，可列舉出例如直鏈型、接枝型、串型、樹狀型、星型等的具有RGD序列的聚合物或共聚物。作為所述聚合物或共聚物，可列舉出例如聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-聚丙烯酸)、聚酰胺胺樹狀物、聚環(huán)氧乙烷、聚ε-己內(nèi)酰胺、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸甲基-Y-聚甲基丙烯酸氧基乙烯)等。(相互作用的第2物質(zhì))相互作用的第2物質(zhì)優(yōu)選為生物降解性的、且為水溶性的。相互作用的第2物質(zhì)中，作為與具有RGD序列的第1物質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)，可列舉出例如膠原、明膠、蛋白聚糖、整合素、酶、抗體等。另外，作為與具有RGD序列的第1物質(zhì)相互作用的高分子，可列舉出例如天然來源的高分子和合成高分子。作為與具有RGD序列的第1物質(zhì)相互作用的天然來源的高分子，可列舉出例如水溶性多肽、低分子肽、彈性蛋白、聚氨基酸、聚酯、肝素或硫酸乙酰肝素、硫酸葡聚糖等糖、聚氨酯、聚酰胺、聚碳酸酯、和它們的共聚物等。作為與具有RGD 序列的第1物質(zhì)相互作用的合成高分子，可列舉出例如直鏈型、接枝型、串型、樹狀型、星型等的具有RGD序列的聚合物或共聚物。作為所述聚合物或共聚物，可列舉出例如聚丙烯酸、 聚甲基丙烯酸、聚乙二醇-接枝-聚丙烯酸、聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-聚丙烯酸)、聚酰胺胺樹狀物、聚環(huán)氧乙烷、聚ε-己內(nèi)酰胺、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸甲基-Y-聚甲基丙烯酸氧基乙烯)等。作為和與具有RGD序列的第1物質(zhì)相互作用的第2物質(zhì)的組合，沒有特殊限制，只要是相互作用的不同的物質(zhì)的組合即可。可列舉出例如纖連蛋白和明膠、層粘連蛋白和明膠、纖連蛋白和硫酸葡聚糖、聚賴氨酸和彈性蛋白、纖連蛋白和膠原、層粘連蛋白和膠原、波基結(jié)合素和膠原、RGD結(jié)合膠原或RGD結(jié)合明膠和膠原或明膠等的組合。其中，優(yōu)選為纖連蛋白和明膠、層粘連蛋白和明膠的組合，更優(yōu)選為纖連蛋白和明膠的組合。另外，具有RGD 序列的第1物質(zhì)和相互作用的第2物質(zhì)可以分別為一種，也可以分別并用顯示相互作用的范圍內(nèi)的二種以上。(具有正電荷的第1物質(zhì))具有正電荷的第1物質(zhì)中，作為具有正電荷的蛋白質(zhì)，優(yōu)選例如水溶性蛋白質(zhì)。作為水溶性蛋白質(zhì)，可列舉出例如堿性膠原、堿性明膠、溶菌酶、細胞色素C、過氧化物酶、肌紅蛋白等。具有正電荷的第1物質(zhì)中，作為具有正電荷的高分子，可列舉出例如天然來源的高分子和合成高分子。作為天然來源的高分子，可列舉出例如水溶性多肽、低分子肽、聚氨基酸、聚酯、甲殼素或殼聚糖等糖、聚氨酯、聚酰胺、聚碳酸酯、和它們的共聚物等。作為聚氨基酸，可列舉出聚(α-賴氨酸入聚(ε-賴氨酸)等聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸等。作為合成高分子，可列舉出例如直鏈型、接枝型、串型、樹狀型、星型等的聚合物或共聚物。作為所述聚合物或共聚物，可列舉出例如聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚烯丙胺鹽酸鹽、聚乙烯亞胺、聚乙烯基胺、聚酰胺胺樹狀物等。(具有負電荷的第2物質(zhì))具有負電荷的第2物質(zhì)中，作為具有負電荷的蛋白質(zhì)，優(yōu)選例如水溶性蛋白質(zhì)。作為水溶性蛋白質(zhì)，可列舉出例如酸性膠原、酸性明膠、白蛋白、球蛋白、過氧化氫酶、β-乳球蛋白、甲狀球蛋白、α-乳白蛋白、卵白蛋白等。具有負電荷的第2物質(zhì)中，作為具有負電荷的高分子，可列舉出天然來源的高分子和合成高分子。作為天然來源的高分子，可列舉出例如水溶性多肽、低分子肽、聚(β賴氨酸)等聚氨基酸、硫酸葡聚糖、聚酯、聚氨酯、聚酰胺、 聚碳酸酯、和它們的共聚物等。作為合成高分子，可列舉出例如直鏈型、接枝型、串型、樹狀型、星型等的聚合物或共聚物。作為所述聚合物或共聚物，可列舉出例如聚酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺甲基丙磺酸、末端羧基化聚乙二醇等。作為具有正電荷的第1物質(zhì)和具有負電荷的第2物質(zhì)的組合，可列舉出例如殼聚糖和硫酸葡聚糖的組合、聚烯丙胺鹽酸鹽和聚苯乙烯磺酸的組合、聚二烯丙基二甲基氯化銨和聚苯乙烯磺酸的組合等。其中，具有正電荷的第1物質(zhì)和具有負電荷的第2物質(zhì)可以分別為一種，也可以并用顯示相互作用的范圍內(nèi)的二種以上。另外，作為本發(fā)明的細胞外基質(zhì)的成分，從進一步模擬生物組織的觀點出發(fā)，優(yōu)選使用天然的(即生物體內(nèi)的)細胞外基質(zhì)中所含的成分，從同樣的觀點出發(fā)，可以不含有有時用作人的細胞外基質(zhì)的替代成分的一種且人體內(nèi)不存在的成分即殼聚糖。本發(fā)明中，關(guān)于三維細胞培養(yǎng)物，例如從多種細胞能夠自在地層疊、和/或細胞層和/或細胞外基質(zhì)的厚度的控制容易的觀點出發(fā)，所述三維細胞培養(yǎng)物是通過下述制法制造的培養(yǎng)物，所述制法包括在至少細胞層間含有細胞外基質(zhì)、且將含有細胞的溶液配置從而形成細胞層，將第1液和第2液交替地配置從而形成細胞外基質(zhì)，交替地進行所述細胞外基質(zhì)的形成和所述細胞層的形成從而將所述細胞層層疊，和在層疊的細胞層的最下層的細胞層下、在最上層的細胞層上、和在細胞層間中的至少一層上配置所述能夠檢測生物信號的傳感器粒子；所述第1液的含有物和第2液的含有物的組合優(yōu)選是具有RGD序列的蛋白質(zhì)或高分子和與所述具有RGD的蛋白質(zhì)或高分子相互作用的蛋白質(zhì)或高分子的組合、或者具有正電荷的蛋白質(zhì)或高分子和具有負電荷的蛋白質(zhì)或高分子的組合。在本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法中，所使用的三維細胞培養(yǎng)物可以是在基體上形成的培養(yǎng)物。作為所述基體，沒有特殊限制，可適當使用例如玻璃、各種聚合物、濾紙、金屬、水凝膠等以往公知的材料。三維細胞培養(yǎng)物中與基體接觸的層可以是細胞外基質(zhì)的層、也可以是細胞層，在基體無法作為細胞層的支架的情況下，優(yōu)選在配置三維細胞培養(yǎng)物的區(qū)域配置上述的細胞外基質(zhì)，或者進行以往公知的用于細胞培養(yǎng)的涂布。在本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法中，傳感器粒子優(yōu)選配置在三維細胞培養(yǎng)物的最下層的細胞層下、細胞層間、和最上層的細胞層上中的至少一層上。從容易地確定生物信號的產(chǎn)生部位和擴散部位的觀點出發(fā)，可以將傳感器粒子配置在最下層的細胞層下、最上層的細胞層上、和細胞層間中的任一層上，另外，從在1個三維細胞培養(yǎng)物中能夠觀察生物信號的空間擴散和動態(tài)圖像的觀點出發(fā)，也可以將傳感器粒子配置在最下層的細胞層下、最上層的細胞層上、和細胞層間中的多個層上。在本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法中，從容易地確定生物信號的擴散部位的觀點出發(fā)，優(yōu)選準備為傳感器粒子被配置在最下層的細胞層下、細胞層間、和最上層的細胞層上中的任一層上，且傳感器粒子所配置的層不同的多個三維細胞培養(yǎng)物，并對多個三維細胞培養(yǎng)物的傳感器粒子分別進行光學(xué)觀察，然后基于觀察結(jié)果進行生物信號的行為分析。關(guān)于使用了多個三維細胞培養(yǎng)物的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法，以細胞層為5層層疊的三維細胞培養(yǎng)物的情況為例進行說明。在以下的例子中，將最下層作為第 1層、將最上層作為第5層。首先，準備在第1層的細胞層下、第1層的細胞層和第2層的細胞層之間、第2層的細胞層和第3層的細胞層之間、第3層的細胞層和第4層的細胞層之間、第4層的細胞層和第5層的細胞層之間、第5層的細胞層上中的任一個上配置有傳感器粒子的6種三維細胞培養(yǎng)物。接著，對6種三維細胞培養(yǎng)物全部施予例如被檢物質(zhì)等的某種刺激，然后，對傳感器粒子進行光學(xué)觀察。當傳感器粒子能夠檢測到的生物信號為從第5 層的細胞特異性產(chǎn)生的生物信號時，在將傳感器粒子配置在第1層的細胞層下的三維細胞培養(yǎng)物中檢測到生物信號的情況下，能夠確認在第5層的細胞中產(chǎn)生的生物信號擴散到第 1層。另一方面，將傳感器粒子配置在第2層的細胞層和第3層的細胞層之間的三維細胞培養(yǎng)物中檢測到生物信號、但在將傳感器粒子配置在第1層的細胞層下的三維細胞培養(yǎng)物中未檢測到生物信號的情況下，能夠確認生物信號擴散到第2層的細胞層附近，但沒有擴散到其以后的細胞層。在本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法中，傳感器粒子的光學(xué)觀察優(yōu)選包括將生物信號可視化和/或數(shù)值化。對于傳感器粒子的光學(xué)觀察方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員例如可以針對所含有的傳感器粒子選擇適當?shù)臋z測手段。作為檢測手段，可列舉出例如熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、共聚焦分光光度計、紫外-可見光分光光度計等。通過使用激光共聚焦顯微鏡等能夠例如將細胞所產(chǎn)生的生物信號可視化并形成圖像，優(yōu)選能夠?qū)⒓毎a(chǎn)生的特定的信號分子的擴散和/或局部分布可視化。因此，本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法能夠成為例如再生醫(yī)療中與分化誘導(dǎo)或組織形成相關(guān)的研究中的強有力的工具。“將生物信號可視化”包括例如使用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡等對三維細胞培養(yǎng)物中的傳感器粒子進行觀察、和/或?qū)ζ錈晒怙@微鏡圖像進行拍攝。另外，“將生物信號數(shù)值化”可包括例如使用熒光分光光度計、共聚焦分光光度計或紫外-可見光分光光度計等對三維細胞培養(yǎng)物中的傳感器粒子的熒光光譜或吸收光譜等進行測定，優(yōu)選包括使用它們的光譜將其定量化。另外，例如通過使用激光共聚焦顯微鏡來確定生物信號的擴散位置、測定其位置的光譜，也能夠?qū)⑸镄盘柖炕Ｊ褂脠DIA和B說明本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法和其所使用的三維細胞培養(yǎng)物的一個實施方式。但本發(fā)明并不受以下實施方式的限制。圖IA為概略地表示本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法中使用的三維細胞培養(yǎng)物的構(gòu)成的一個例子的圖。圖IA所示的三維細胞培養(yǎng)物1形成在基體2上。三維細胞培養(yǎng)物1包含傳感器粒子3、細胞層4 7、細胞外基質(zhì)層8 11、且細胞層4 7隔著細胞外基質(zhì)層8 11層疊。另外，傳感器粒子3配置在細胞外基質(zhì)層8 11上。如上所述，細胞層4 7的細胞的種類可以相同也可以不同。另外，傳感器粒子3可以是具有相同的傳感器功能的傳感器粒子，也可以是具有不同的傳感器功能的傳感器粒子。當使用具有不同的傳感器功能的傳感器粒子時，能夠檢測多種生物信號。具有不同的傳感器功能的傳感器粒子包括例如檢測不同種類的生物信號的傳感器粒子、檢測同一生物信號的不同種類的傳感器粒子等。下面，以血管模型中的血管內(nèi)皮細胞的信號傳遞的檢測為例對本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法進行說明。圖IB是血管模型的三維細胞培養(yǎng)物的構(gòu)成的一個例子，基體2上層疊有4層細胞層M 27。最上層的細胞層27為血管內(nèi)皮細胞的細胞層、 其下的多個細胞層M 26為平滑肌細胞的細胞層。各細胞層之間配置有細胞外基質(zhì)觀 31和能夠檢測NO的傳感器粒子40。當生物信號(NO)41從血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生時，NO在血管模型內(nèi)被傳遞(箭頭)、只有得到NO的傳感器粒子發(fā)光。通過觀察該傳感器粒子的光學(xué)變化，能夠例如在血管模型內(nèi)局部地檢測出由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的生物信號(NO)的產(chǎn)生或信號傳遞。另外，由于能夠檢測生物信號的傳感器是粒子狀的，因此生物信號的局部檢測更加容易。另外，通過進行一段時間的傳感器粒子的光學(xué)觀察，可以觀察例如生物信號的空間的擴散和動態(tài)圖像。另外，通過在血管模型內(nèi)局部地檢測由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的生物信號(NO)的產(chǎn)生和信號傳遞，還能夠例如檢查血管模型即三維培養(yǎng)物的品質(zhì)、或評價藥物等對血管的影響。 此外，通過代替DAF-2將對鈣離子應(yīng)答的Fura_4F載持在本傳感器粒子上，還能夠評價血管模型中的平滑肌細胞的收縮或心肌模型中的心肌細胞的收縮，并能夠用于評價治療藥物對動脈硬化或心肌梗塞的應(yīng)答。另外，通過將對PH變化應(yīng)答的seminaphtho-rhoda fluor-l-dye (SNARF-I)載持在本傳感器粒子上，還能夠評價治療藥物對癌或炎癥反應(yīng)的應(yīng)答。[評價方法]本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法由于能夠檢測例如在作為三維細胞培養(yǎng)物的模型對象(模擬對象)的生物組織中產(chǎn)生的生物信號，因此能夠用于評價三維細胞培養(yǎng)物的組織模型。因此，本發(fā)明在另一個實施方式中涉及一種三維細胞培養(yǎng)物的評價方法，其包括采用本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法對生物信號進行檢測、 和基于所述生物信號的檢測結(jié)果對細胞的活動進行分析。本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的評價方法能夠成為例如與再生醫(yī)療中的分化誘導(dǎo)或組織形成相關(guān)的研究的強有力的工具。本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的評價方法中，細胞活動的分析包括例如生物信號的擴散位置的確定、生物信號的定量化等。本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的評價方法包括確定生物組織中特異性地產(chǎn)生的生物信號的擴散位置、和/或定量地檢測特異性地產(chǎn)生的生物信號，并根據(jù)需要可以基于它們的結(jié)果評價三維細胞培養(yǎng)物是否能夠形成與其生物組織同等的組織體。擴散位置的確定和定量化可以使用例如熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、共聚焦分光光度計、紫外-可見光分光光度計等來進行。另外，在另一實施方式中，本發(fā)明還涉及一種被檢物質(zhì)對生物體的作用的評價方法，其包括使三維細胞培養(yǎng)物與作為被檢物質(zhì)的選自化合物、醫(yī)藥組合物、化妝品和食品中的物質(zhì)接觸、和采用本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法對三維細胞培養(yǎng)物的生物信號進行檢測。通過本發(fā)明的評價方法，能夠進行例如醫(yī)藥、制藥、化妝品、食品和環(huán)境等領(lǐng)域中有關(guān)安全性和藥代動為學(xué)的試驗、檢查、篩選。另外，通過本發(fā)明的被檢物質(zhì)對生物體的作用的評價方法，例如對于它們的試驗、檢查、篩選，能夠優(yōu)選獲得更好地反映人的生物體的信賴性高的結(jié)果。本發(fā)明的被檢物質(zhì)對生物體的作用的評價方法中，生物信號的檢測包括例如確定生物信號的擴散位置、對生物信號進行定量化等。本發(fā)明中，“被檢物質(zhì)對生物體的作用的評價”包括例如被檢物質(zhì)對生物體的影響。生物信號的檢測可以在例如三維細胞培養(yǎng)物與被檢物質(zhì)接觸前、接觸時、接觸后的任意時刻進行，也可以全部都進行，另外，也可以從接觸前到接觸后中持續(xù)地進行。[檢測試劑盒]本發(fā)明中，“檢查試劑盒”包括包含規(guī)定的檢查所使用的試劑、材料、用具、和裝置、 以及對其檢查進行說明的說明書(使用說明書)中的至少1個的制品。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，其為本發(fā)明的檢測方法中使用的檢測試劑盒(以下也稱為“本發(fā)明的檢測試劑盒”)，其具有包含層疊的至少2層細胞層和能夠檢測生物信號的傳感器粒子的三維細胞培養(yǎng)物。通過本發(fā)明的檢測試劑盒，能夠更簡便地進行本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法。本發(fā)明的檢測試劑盒可用于例如細胞功能的可視化、擴散位置的確定等生物信號的圖像化、定量分析等。檢測試劑盒所包含的三維細胞培養(yǎng)物與上述本發(fā)明的檢測方法中使用的三維細胞培養(yǎng)物是同樣的。另外，所述檢測試劑盒還可以進一步包括記載有三維細胞培養(yǎng)物的生物信號的檢測方法等的使用說明書等。[三維細胞培養(yǎng)物的制造方法]
在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種三維細胞培養(yǎng)物的制造方法(以下也稱為 “本發(fā)明的制造方法”)，其包含配置含有細胞的溶液從而形成細胞層、交替地配置第1液和第2液從而形成細胞外基質(zhì)、通過交替地進行所述細胞外基質(zhì)的形成和所述細胞層的形成來將所述細胞層層疊、以及在最下層的細胞層下、細胞層間、和最上層的細胞層上中的至少一層上配置能夠檢測生物信號的傳感器粒子；所述第1液的含有物和第2液的含有物的組合為具有RGD序列的蛋白質(zhì)或高分子和與所述具有RGD的蛋白質(zhì)或高分子相互作用的蛋白質(zhì)或高分子的組合、或者具有正電荷的蛋白質(zhì)或高分子和具有負電荷的蛋白質(zhì)或高分子的組合。通過本發(fā)明的制造方法，能夠制造能夠用于本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物的生物信號檢測方法的包含層疊的至少2層細胞層和能夠檢測生物信號的傳感器粒子的三維細胞培養(yǎng)物。因此，在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種三維細胞培養(yǎng)物，其包含通過本發(fā)明的制造方法制造的、層疊的至少2層細胞層和能夠檢測生物信號的傳感器粒子。本發(fā)明的三維細胞培養(yǎng)物中，傳感器粒子優(yōu)選配置在三維細胞培養(yǎng)物的最下層的細胞層下、細胞層間、 和最上層的細胞層上中的至少一層上。[細胞外基質(zhì)形成]本發(fā)明的制造方法中的細胞外基質(zhì)的形成通過例如在基體上的細胞層上交替地配置第1液和第2液來進行。第1液和第2液的配置可通過例如使第1液和第2液接觸來進行。例如可通過涂布、浸漬、滴加、噴霧等來進行。每個1次配置第1液和第2液而形成的細胞外基質(zhì)薄膜的厚度為約1 20nm，通過反復(fù)進行第1液和第2液的配置能夠形成期望厚度的細胞外基質(zhì)層。另外，可以根據(jù)第1 液和第2液各自所含的第1物質(zhì)和第2物質(zhì)的含量來調(diào)節(jié)所形成的細胞外基質(zhì)層的厚度。 通過這些方法，例如能夠形成厚度為1 lOOOnm、優(yōu)選為1 300nm、更優(yōu)選為5 IOOnm 的細胞外基質(zhì)層。第1液所含的含有物可以從上述的具有RGD序列的第1物質(zhì)和具有正電荷的第1 物質(zhì)中選擇使用。第2液所含的含有物可以從上述相互作用的第2物質(zhì)和具有負電荷的第 2物質(zhì)中選擇使用。第1液的含有物和第2液的含有物的優(yōu)選的組合如上所述。這里，第1 液的含有物或第2液的含有物是指在各液體的液體介質(zhì)中通過溶解和/或分散而含有的物質(zhì)。第1液和第2液例如可通過將上述第1物質(zhì)和上述第2物質(zhì)分別溶解或分散到溶劑或分散介質(zhì)來進行制備。第ι液中的第1物質(zhì)的含量和第2液中的第2物質(zhì)的含量例如優(yōu)選為0. 0001 1質(zhì)量％、更優(yōu)選為0.01 0.5質(zhì)量％、進一步優(yōu)選為0.02 0. 1質(zhì)量％。第1液和第2液中的溶劑或分散介質(zhì)(以下僅稱為“溶劑”)沒有特殊限制，可列舉出水或緩沖液等水性溶劑。作為緩沖液，可以使用例如Tris-HCl緩沖液等Tris緩沖液、磷酸緩沖液、HEPES緩沖液、檸檬酸-磷酸緩沖液、廿氨酰甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、 Britton-Robinson緩沖液、GTA緩沖液等。溶劑的pH沒有特殊限制，例如為3 11、優(yōu)選為6 8、更優(yōu)選為7. 2 7.4。第1液和第2液還可以含有氯化鈉、氯化鈣、碳酸氫鈉、醋酸鈉、檸檬酸鈉、氯化鉀、 磷酸二氫鈉、硫酸鎂、琥珀酸鈉等鹽?？梢院幸环N鹽，也可以含有兩種以上?？梢缘?液和第2液雙方均含有鹽，也可以其中一方含有鹽。鹽濃度沒有特殊限制，例如為1X10—6 2M、優(yōu)選為1 X IO"4 1M、更優(yōu)選為1 X IO"4 0. 05M。第1液和第2液根據(jù)需要還可以含有例如細胞生長因子、細胞因子、趨化因子、激素、生理活性肽、疾病的治療劑、預(yù)防劑、抑制劑、抗菌劑、抗炎劑等醫(yī)藥組合物等。[細胞層形成]本發(fā)明的制造方法中的細胞層的形成是通過將含有細胞的溶液配置在基體上的規(guī)定區(qū)域和/或形成于規(guī)定區(qū)域的細胞外基質(zhì)上來進行的。含有細胞的溶液的配置可以與第1液和第2液同樣地來進行。細胞層的形成中，優(yōu)選在含有細胞的溶液的配置后進行一定時間的孵育。通過該孵育，配置的細胞二維(平面方向)地增殖，從而易于形成單層的細胞。孵育的條件沒有特殊限制，可根據(jù)細胞來適當決定。作為通常的條件，溫度例如為4 60°C、優(yōu)選為20 40°C、更優(yōu)選為30 37°C，時間為例如1 168小時、優(yōu)選為3 M小時、更優(yōu)選為3 12 小時。另外，細胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基也沒有特殊限制，可根據(jù)細胞來適當決定。例如可以使用 Eagle，s MEM 培養(yǎng)基、Dulbecco，s Modified Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)、Modified Eagle 培養(yǎng)基(MEM)、最低必需培養(yǎng)基、RDMI.GlutaMax培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基等。含有細胞的溶液中的細胞濃度從細胞層形成的效率化的觀點出發(fā)，優(yōu)選為 (1. 0) X IO4 (1. 0) X 109cells/mL、更優(yōu)選為(1. 0) X IO5 (1. 0) X 108cells/mL、進一步優(yōu)選為(1.0) X IO6 (1.0)X107cells/mL。作為含有細胞的溶液的介質(zhì)，可以使用上述的培養(yǎng)基、和/或Tris緩沖液、磷酸緩沖液、HEPES、PBS等。[傳感器粒子的配置]傳感器粒子可以通過含有在例如第1液、第2液和含有細胞的溶液中來配置在三維細胞培養(yǎng)物內(nèi)，也可以分散在其他溶劑中來配置在例如最下層的細胞層下、細胞層間、和最上層的細胞層上。使傳感器粒子分散的溶劑可以使用例如作為第1液、第2液和含有細胞的溶液所使用的上述溶劑的上文所述的溶劑。傳感器粒子的配置部位可以根據(jù)目的來適當決定，例如可以整體地沒有遺漏地配置在三維細胞培養(yǎng)物整體上，也可以局部地配置。另外，傳感器粒子可以是具有相同傳感器功能的傳感器粒子，也可以是具有不同的傳感器功能的傳感器粒子。當使用具有不同的傳感器功能的傳感器粒子時，能夠檢測多種的生物信號。以下，使用實施例對本發(fā)明進行進一步說明。但本發(fā)明并不受以下實施例的限定性解釋。實施例[傳感器粒子的制作]作為載持體使用介孔二氧化硅粒子(平均粒徑1. 6 μ m)、作為具有傳感器功能的物質(zhì)使用NO檢測發(fā)光物質(zhì)即4，5-二氨基熒光素(DAF-2)。首先，將介孔二氧化硅粒子浸漬到25μΜ DAF-2溶液中M小時。由此，使DAF-2載持在介孔二氧化硅粒子內(nèi)部。接著， 洗滌載持了 DAF-2的介孔二氧化硅粒子，然后交替地浸漬到殼聚糖溶液(lmg/mL殼聚糖、IM NaCl、pH為1)和硫酸葡聚糖溶液(lmg/mL硫酸葡聚糖、IM NaCl、pH為7)中。反復(fù)6次殼聚糖溶液和硫酸葡聚糖溶液的交替浸漬，由此制作在介孔二氧化硅粒子表面交替層疊了各 6層的殼聚糖層和硫酸葡聚糖層的傳感器粒子。層疊于二氧化硅表面的殼聚糖/硫酸葡聚糖層的厚度為約130nm，得到的傳感器粒子的平均粒徑為約1.8μπι。確認了利用上述傳感器粒子能夠檢測NO。首先，將作為NO供體的N0C-7(1-羥基-2-氧代-3-(N-甲基-3-3氨基丙基)-3-甲基-1-三氮烯)溶解到50mM Tris緩沖液 (pH為7. 4)中，制備N0C-7溶液(50nM N0C-7)。接著，將N0C-7溶液添加到傳感器粒子分散液(0. 5MNaCl、pH為7)中，用相位差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察N0C-7溶液添加前后的傳感器粒子分散液。將其結(jié)果示于圖2A F。圖2A C分別為NOC溶液添加前的傳感器分散液的數(shù)碼相機照片、相位差顯微鏡照片(X40)、熒光顯微鏡照片(X40)。圖2D F分別為NOC溶液添加后的傳感器分散液的熒光顯微鏡照片數(shù)碼相機照片、相位差顯微鏡照片 (X40)、熒光顯微鏡照片(X40)。如圖2A F所示，由于傳感器粒子在NO存在下顯示強熒光，因此確認了利用上述傳感器粒子能夠檢測NO。[三維細胞培養(yǎng)物的制作]如下操作，制作在基體上的人平滑肌細胞(SMC)上層疊有人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVEC)、在SMC層和HUVEC層之間配置有細胞外基質(zhì)和傳感器粒子的三維細胞培養(yǎng)物。首先，將基體浸漬到基底膜用溶液(0.2mg/mL纖連蛋白、50mM Tris緩沖液(pH*7.4))中從而在基體上形成基底膜。然后，在基底膜上配置含有SMC細胞的液體G.0X104cellS/ mL人平滑肌細胞、50mM Tris緩沖液(pH為7. 4))，在細胞培養(yǎng)孵育箱(37°C、5% CO2)中培養(yǎng)過夜，使細胞粘附(SMC層)。然后，浸漬細胞外基質(zhì)形成用第1液(0.2mg/mL纖連蛋白、 50mM Tris緩沖液(pH為7. 4))和細胞外基質(zhì)形成用第2液(0. 2mg/mL明膠、50mM Tris緩沖液(PH為7. 4))浸漬。交替地進行10次第1液(纖連蛋白)和第2液(明膠)的浸漬， 從而在SMC層表面上形成纖連蛋白-明膠的薄膜(細胞外基質(zhì))。其后立刻在細胞外基質(zhì)上配置傳感器粒子，并配置含有HUVEC細胞的液體(6. OX IO4ceIlsAiL入臍靜脈內(nèi)皮細胞、 50mM Tris緩沖液(pH為7. 4))，在細胞培養(yǎng)孵育箱(37°C、5% CO2)中培養(yǎng)過夜，使細胞粘附(HUVEC 層)。另外，作為參考例，制作在基體上形成HUVEC層、在其表面上配置有傳感器粒子的細胞培養(yǎng)物。首先，在基體上通過浸漬基底膜用溶液而在基體上形成基底膜。然后，在基底膜上配置含有HUVEC細胞的液體，在細胞培養(yǎng)孵育箱(37°C、5%C(^)中培養(yǎng)過夜，使細胞粘附(HUVEC層)。然后，在HUVEC層表面上配置傳感器粒子。其中，基底膜用溶液和含有 HUVEC細胞的液體使用上文所述的物質(zhì)。用相位差顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察得到的三維細胞培養(yǎng)物和參考例的細胞培養(yǎng)物。將其顯微鏡照片示于圖3A D。其中，F(xiàn)-肌動蛋白用鬼筆環(huán)肽-羅丹明染色、 細胞核用DAPI (4’6_ 二氨基-2-2苯基吲哚)染色。圖3A表示三維細胞培養(yǎng)物的相位差顯微鏡照片(X60)、圖;3B表示三維細胞培養(yǎng)物的共聚焦熒光顯微鏡照片(X60)、圖3C表示參考例的細胞培養(yǎng)物的相位差顯微鏡照片(X60)、圖3D表示參考例的細胞培養(yǎng)物的共聚焦熒光顯微鏡照片(X60)。其中，圖;3B的照片是按照能夠觀察SMC層和層間配置的傳感器粒子的方式聚焦拍攝的。在圖3A和C中，白箭頭所示的圓形物是傳感器粒子，在圖:3B和D 中，發(fā)黃綠色光的是傳感器粒子。在圖3D的照片中確認了 HUVEC來源的鵝卵石狀的細胞和傳感器粒子。另一方面， 在圖3B的照片中確認了具有特征性的伸長的形態(tài)的細胞SMC和傳感器粒子，而未能確認層疊于SMC層上的HUVEC來源的鵝卵石狀的細胞。如此，由于在圖:3B的照片中無法確認HUVEC層，因此可確認傳感器粒子載持在SMC層和HUVEC層之間。另外，如圖:3B和D所示，SMC和 HUVEC的任意細胞均未見細胞形態(tài)的變化。由此，能夠確認配置于三維細胞培養(yǎng)物的傳感器粒子對細胞(SMC和HUVEC)沒有影響，且沒有細胞毒性。[三維細胞培養(yǎng)物的生物信號的檢測]將N0C-7溶液滴加到上述三維細胞培養(yǎng)物和參考例的細胞培養(yǎng)物中，使用激光共聚焦顯微鏡觀察傳感器粒子和對傳感器粒子進行熒光光譜測定。其結(jié)果示于圖4A D。其中，N0C-7溶液使用與傳感器粒子的檢測中使用的同樣的溶液。圖4A表示三維細胞培養(yǎng)物的共聚焦熒光顯微鏡照片(X40)、圖4B表示三維細胞培養(yǎng)物的熒光光譜、圖4C表示參考例的細胞培養(yǎng)物的共聚焦熒光顯微鏡照片(X40)、圖4D表示參考例的細胞培養(yǎng)物的熒光光譜。其中，圖4A的照片是按照能夠觀察配置在SMC層、和SMC層與HUVEC層之間的傳感器粒子的方式進行聚焦而拍攝的。圖4A的照片中確認了具有特征性的伸長的形態(tài)的細胞SMC和傳感器粒子，但無法確認SMC層上層疊的HUVEC來源的鵝卵石狀的細胞。因此，確認了傳感器粒子載持在SMC 層和HUVEC層之間。另外，由于顯示黃綠色的熒光，因此確認了利用層間載持的傳感器粒子能夠檢測NO。在圖4B和D中，均在515nm附近出現(xiàn)了峰。該峰顯示傳感器粒子上載持的DAF-2 由于得到NO而變化為DAF-2T(triaZ0lfl0rescein)。因此，利用配置在三維細胞培養(yǎng)物上的傳感器粒子能夠檢測N0，并且能夠測定傳感器粒子的光譜。另外，由于能夠測定配置在三維細胞培養(yǎng)物上的傳感器粒子內(nèi)的DAF-2T(具有傳感器功能的物質(zhì))的光譜，因此能夠?qū)θS細胞培養(yǎng)物的生物信號定量地進行評價。[鈣應(yīng)答傳感器粒子和pH應(yīng)答傳感器粒子的制作]作為載持體使用介孔二氧化硅粒子(平均粒徑1. 6 μ m)、作為具有傳感器功能的物質(zhì)使用作為鈣離子應(yīng)答物質(zhì)的Fura-4F、和作為pH應(yīng)答物質(zhì)的SNARF-I。首先，將介孔二氧化硅粒子分別浸漬在M μ M Fura-4F溶液和SNARF-I溶液中各M小時。由此，使各應(yīng)答物質(zhì)載持在介孔二氧化硅粒子內(nèi)部。接著，洗滌載持了各應(yīng)答物質(zhì)的介孔二氧化硅粒子，然后交替地浸漬到殼聚糖溶液(lmg/mL殼聚糖、IM NaCl、pH為1)和硫酸葡聚糖溶液(lmg/mL 硫酸葡聚糖、IM NaCl、pH為7)中。反復(fù)6次殼聚糖溶液和硫酸葡聚糖溶液的交替浸漬，由此制作在介孔二氧化硅粒子表面上交替層疊了各6層的殼聚糖層和硫酸葡聚糖層的傳感器粒子。二氧化硅表面上層疊的殼聚糖/硫酸葡聚糖層的厚度為約130nm、得到的傳感器粒子的平均粒徑為約1.8μπι。確認了利用上述傳感器粒子能夠檢測鈣離子和pH變化。將載持了 Fura-4F的傳感器粒子溶解到IM的氯化鈣溶液(50mM Tris緩沖液、pH為7. 4)中，使?jié)舛葹榧slmg/mL，測定熒光光譜。其結(jié)果示于圖5A。確認僅在鈣離子存在時發(fā)光。另外，按照以下的順序檢測 PH變化。以lmg/mL的濃度將載持了 SNARF-I的傳感器粒子分散液溶解到pH調(diào)節(jié)至5. 3和 8. 5的50mM磷酸二氫鉀緩沖液中，測定熒光光譜。其結(jié)果示于圖5B中。在酸性條件下(pH 為5. 3)觀察到在580nm處具有強的熒光，另外，在堿性條件下(pH為8. 5)觀察到在640nm 處觀察到熒光。根據(jù)這些結(jié)果，確認制作了對鈣離子或PH變化進行應(yīng)答從而發(fā)出熒光的傳感器粒子。產(chǎn)業(yè)上的可利用性
如上所述，本發(fā)明在例如醫(yī)藥、制藥、化妝品、食品、再生醫(yī)療、環(huán)境保全等領(lǐng)域是有用的。符號說明1,21 三維細胞培養(yǎng)物2 基體3、40:傳感器粒子4 7、24 27 細胞層8 11J8 31 細胞外基質(zhì)41:生物信號(NO分子)
權(quán)利要求
1.一種三維細胞培養(yǎng)物的生物信號的檢測方法，其包括準備包含層疊的至少2層細胞層和能夠檢測生物信號的傳感器粒子的三維細胞培養(yǎng)物，以及對所述傳感器粒子進行光學(xué)觀察。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中，所述傳感器粒子包含具有傳感器功能的物質(zhì)、載持具有傳感器功能的物質(zhì)的載持體、 以及在所述載持體的表面交替地層疊的堿性聚合物層和酸性聚合物層，所述載持體為多孔性粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中，所述傳感器粒子的光學(xué)觀察包括將所述生物信號可視化和/或數(shù)值化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的檢測方法，其中，所述傳感器粒子配置在最下層的細胞層下、細胞間、和最上層的細胞層上中的至少一層上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的檢測方法，其中， 所述三維細胞培養(yǎng)物包含細胞外基質(zhì)，所述細胞外基質(zhì)包含具有RGD序列的蛋白質(zhì)或高分子和與所述具有RGD的蛋白質(zhì)或高分子相互作用的蛋白質(zhì)或高分子的組合、或者具有正電荷的蛋白質(zhì)或高分子和具有負電荷的蛋白質(zhì)或高分子的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項所述的檢測方法，其中， 所述三維細胞培養(yǎng)物在至少細胞層間包含細胞外基質(zhì)；所述三維細胞培養(yǎng)物能夠通過如下的制法制造，該制法包括配置含有細胞的溶液從而形成細胞層、交替地配置第1液和第2液從而形成細胞外基質(zhì)、通過交替地進行所述細胞外基質(zhì)的形成和所述細胞層的形成來將所述細胞層層疊、以及在最下層的細胞層下、細胞層間、和最上層的細胞層上中的至少一層上配置所述能夠檢測生物信號的傳感器粒子；其中，所述第1液的含有物和第2液的含有物的組合為具有RGD序列的蛋白質(zhì)或高分子和與所述具有RGD的蛋白質(zhì)或高分子相互作用的蛋白質(zhì)或高分子的組合、或者具有正電荷的蛋白質(zhì)或高分子和具有負電荷的蛋白質(zhì)或高分子的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中，所述傳感器粒子包含具有傳感器功能的物質(zhì)、載持具有傳感器功能的物質(zhì)的載持體、 以及在所述載持體的表面交替地層疊的堿性聚合物層和酸性聚合物層。
8.—種檢測試劑盒，其是用于權(quán)利要求1 7中任一項所述的檢測方法的檢測試劑盒， 其中，其具有包含層疊的至少2層細胞層和能夠檢測生物信號的傳感器粒子的三維細胞培養(yǎng)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測試劑盒，其中，所述三維細胞培養(yǎng)物在至少細胞層間包含細胞外基質(zhì)；所述三維細胞培養(yǎng)物能夠通過如下的制法制造，該制法包括配置含有細胞的溶液從而形成細胞層、交替地配置第1液和第2液從而形成細胞外基質(zhì)、通過交替地進行所述細胞外基質(zhì)的形成和所述細胞層的形成來將所述細胞層層疊、以及在最下層的細胞層下、細胞層間、和最上層的細胞層上中的至少一層上配置所述能夠檢測生物信號的傳感器粒子；其中，所述第1液的含有物和第2液的含有物的組合為具有RGD序列的蛋白質(zhì)或高分子和與所述具有RGD的蛋白質(zhì)或高分子相互作用的蛋白質(zhì)或高分子的組合、或者具有正電荷的蛋白質(zhì)或高分子和具有負電荷的蛋白質(zhì)或高分子的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測試劑盒，其中，所述傳感器粒子包含具有傳感器功能的物質(zhì)、載持具有傳感器功能的物質(zhì)的載持體、 以及在所述載持體的表面交替地層疊的堿性聚合物層和酸性聚合物層。
11.一種三維細胞培養(yǎng)物的制造方法，其包括 配置含有細胞的溶液從而形成細胞層，交替地配置第1液和第2液從而形成細胞外基質(zhì)，通過交替地進行所述細胞外基質(zhì)的形成和所述細胞層的形成來將所述細胞層層疊，以及在最下層的細胞層下、細胞層間、和最上層的細胞層上中的至少一層上配置能夠檢測生物信號的傳感器粒子；其中，所述第1液的含有物和第2液的含有物的組合為具有RGD序列的蛋白質(zhì)或高分子和與所述具有RGD的蛋白質(zhì)或高分子相互作用的蛋白質(zhì)或高分子的組合、或者具有正電荷的蛋白質(zhì)或高分子和具有負電荷的蛋白質(zhì)或高分子的組合。
12.—種三維細胞培養(yǎng)物的評價方法，其包括采用權(quán)利要求1 7中任一項記載的檢測方法對生物信號進行檢測，和， 基于所述生物信號的檢測結(jié)果對細胞的活動進行分析。
13.一種被檢物質(zhì)對生物體的作用的評價方法，其包括使三維細胞培養(yǎng)物和作為被檢物質(zhì)的選白化合物、醫(yī)藥組合物、化妝品和食品中的物質(zhì)接觸，和，采用權(quán)利要求1 7中任一項所述的檢測方法對三維細胞培養(yǎng)物的生物信號進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對三維細胞培養(yǎng)物的生物信號進行檢測的方法。一種三維細胞培養(yǎng)物的生物信號的檢測方法，其包括制備包含層疊的至少2層細胞層和能夠檢測生物信號的傳感器粒子的三維細胞培養(yǎng)物，以及對傳感器粒子進行光學(xué)觀察。三維細胞培養(yǎng)物優(yōu)選為含有下述細胞外基質(zhì)的三維細胞培養(yǎng)物，所述細胞外基質(zhì)包含具有RGD序列的蛋白質(zhì)或高分子和與所述具有RGD的蛋白質(zhì)或高分子相互作用的蛋白質(zhì)或高分子的組合、或者具有正電荷的蛋白質(zhì)或高分子和具有負電荷的蛋白質(zhì)或高分子的組合。
文檔編號C12Q1/02GK102209788SQ20098014496
公開日2011年10月5日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日
發(fā)明者岡野和宣, 明石滿, 松崎典彌 申請人:獨立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機構(gòu)